張澤彪+趙玉華+周文婷+汪宇峰+趙晨瓊+關(guān)偉軍+朱志強(qiáng)

摘 要：構(gòu)建一個(gè)優(yōu)秀單板U型場(chǎng)地滑雪運(yùn)動(dòng)員血液的cDNA文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序從中獲取大量的表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tags）ESTs，用于基因篩選和功能預(yù)測(cè)。方法：通過(guò)對(duì)多名優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員血液樣品的總RNA進(jìn)行提取、混合總RNA，合成雙鏈cDNA、蛋白酶K消化、Sfi1酶切并連接載體、λ噬菌體的包裝，經(jīng)擴(kuò)增最終獲得優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員cDNA文庫(kù)；隨后從文庫(kù)中隨機(jī)挑選500個(gè)克隆提交至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用Chromas軟件去低質(zhì)量樣品，使用GenBank中的BLAST功能對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)獲取相關(guān)信息，將獲得的ESTs信息提交PANTHR和GO（Gene Ontology）生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本歸類(lèi)分析，從中獲取運(yùn)動(dòng)員cDNA文庫(kù)中所涵蓋的重要遺傳信息。結(jié)果：得到滴度分別為1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL的未擴(kuò)增文庫(kù)和擴(kuò)增后文庫(kù)，擴(kuò)增后文庫(kù)的重組率為90.6%；得到長(zhǎng)度在300～1 100 bp序列360個(gè)，平均長(zhǎng)度606 bp；通過(guò)BLAST比對(duì)得出201條具有注釋的基因信息，利用PANTHER數(shù)據(jù)庫(kù)基本分析發(fā)現(xiàn)這些基因分布在27個(gè)pathway上，其中TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等基因分別分布在參與新陳代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、心血管系統(tǒng)機(jī)能等相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路上，推測(cè)其可能與運(yùn)動(dòng)能力存在關(guān)聯(lián)。通過(guò)GO分析對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行歸類(lèi)得到在該數(shù)據(jù)庫(kù)中具有功能注釋的基因143個(gè)，參與31項(xiàng)不同功能，主要包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程。結(jié)論：構(gòu)建了一個(gè)全長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)員cDNA文庫(kù)，其質(zhì)量符合構(gòu)建cDNA文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)伟錟型場(chǎng)地滑雪；外周血淋巴細(xì)胞；全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；表達(dá)序列標(biāo)簽

中圖分類(lèi)號(hào)：G 804.2 文章編號(hào)：1009-783X（2017）03-0254-05 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Objective： The aim of this study is to construct a cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders. And we can get a large number of ESTs （Expressed Sequence Tags） from it by sequencing the genes. We can also use it for gene screening and function prediction. Methods： The cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders was constructed by a series of experiments extracting and mixing Total RNA of several elite ice-snow athletes， synthesizing double-stranded DNA， proteinase K digestion， Sfi 1 enzyme digestion， connecting with vector， packaging phage λ and amplification. Then 500 clones from the library were randomly selected to be sequenced. Low-quality samples in the results of sequence were removed by Chromas software. The relevant information of ESTs was captured by matching gene sequences with BLAST of GenBank. Then the information of ESTs was presented to PANTHR and GO（Gene Ontology）bioinformatics database to make a basic classification and analysis and to get some important genetic information in the cDNA library of athletes. Results： The titer of cDNA library unamplified was 1.32×106pfu/ml， and the titer of cDNA library amplified was 1.65×1010pfu/ml .The recombinant rate of cDNA library amplified was 90.6%. We finally got 360 sequences whose length were between 300bp and 110bp， and the average length was 606bp. 201 Gene information with annotation（BLAST） was distributed on 27 pathways（PANTHER）， including TXN， MDH1， ARL1， ARPC3， ACTG1 and many other genes which were separately distributed on pathways associated with metabolism， Oxidative stress， or Cardiovascular system function. So we speculate that it may be related to physical ability. GO was used to analysis and classify gene sequences， and then 143 Genes with functional annotation in the database were confirmed to participate in different functions which mainly include cellular component， molecular function and biological process. Conclusions： This study has successfully constructed a full-length athletes' cDNA library which conformed to the standard of cDNA library construction.endprint

Keywords： half-pipe snowboarding； Lymphocyte； full-Length cDNA Library； expressed sequence tags

單板U型場(chǎng)地滑雪于1998年日本長(zhǎng)野冬奧會(huì)上被設(shè)為正式比賽項(xiàng)目[1 ]。研究表明，該項(xiàng)目在完成整套動(dòng)作中無(wú)氧供能占比例較大，但在高山環(huán)境中重復(fù)的訓(xùn)練及漫長(zhǎng)的賽季使得該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員同樣需要進(jìn)行大量的有氧耐力訓(xùn)練 [2-3]。由于該項(xiàng)目開(kāi)展時(shí)間較短，有關(guān)的科學(xué)研究數(shù)量有限，主要集中在生物學(xué)監(jiān)控、技術(shù)動(dòng)作分析、運(yùn)動(dòng)損傷與心理調(diào)控等方面，其他領(lǐng)域多為空白。近年來(lái)有研究表明，遺傳因素在個(gè)體間運(yùn)動(dòng)能力的差異方面起較大作用。隨著分子生物學(xué)研究的深入，大量與運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的基因被發(fā)掘出來(lái)，通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行研究已成為了當(dāng)今研究的熱點(diǎn) [4]。對(duì)新興的該項(xiàng)目而言，為持久深入了解運(yùn)動(dòng)員遺傳信息在其表達(dá)調(diào)控過(guò)程中所起的作用，勢(shì)必面臨運(yùn)動(dòng)員遺傳資源有限與持續(xù)的功能基因研究間的矛盾問(wèn)題，鑒于此原因，構(gòu)建cDNA文庫(kù)則成為解決這一矛盾的首選，更為我國(guó)2022年北京冬季奧林匹克運(yùn)動(dòng)會(huì)的備戰(zhàn)起到重要作用。

本研究選擇SMART技術(shù)構(gòu)建單板滑雪運(yùn)動(dòng)員cDNA文庫(kù)優(yōu)勢(shì)在于減少了起始階段RNA的用量便可獲得比例較高的全長(zhǎng)cDNA，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速簡(jiǎn)單 [5]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

無(wú)菌采集優(yōu)秀單板滑雪運(yùn)動(dòng)員靜脈血，所有標(biāo)本均在運(yùn)動(dòng)員知情同意的條件下采集。本研究樣品來(lái)源于2010/2011年LG國(guó)際雪聯(lián)單板滑雪世界杯賽中國(guó)國(guó)家隊(duì)全體男子運(yùn)動(dòng)員，共記13名，均參加過(guò)國(guó)際比賽或在全國(guó)錦標(biāo)賽上取得過(guò)名次，符合優(yōu)秀冰雪運(yùn)動(dòng)員特征標(biāo)準(zhǔn)，具體信息見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑

Trizol購(gòu)自Invitrogen；SMARTTM cDNA Library Construction Kit購(gòu)自Clontech；Gigapack Ⅲ Gold-7購(gòu)自Stratagene，其他試劑為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取

抽取運(yùn)動(dòng)員新鮮靜脈血，隨后用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)約3×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL Trizol，混勻后室溫靜置使其充分裂解，對(duì)其進(jìn)行抽提，混合總RNA，將所有總RNA溶于無(wú)Rnase的DEPC處理過(guò)的水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280，提取總RNA的濃度與純度，隨后進(jìn)行甲醛變性電泳檢測(cè)總RNA的降解情況。

1.2.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

在運(yùn)動(dòng)員外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建中ss-cDNA和ds-cDNA 的合成利用SMART cDNA Library Construction Kit，取2 μg總RNA為模板，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，經(jīng)LD-PCR合成ds-cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA合成結(jié)果。隨后對(duì)經(jīng)檢測(cè)符合要求的ds-cDNA依次進(jìn)行蛋白酶K處理和SfiI酶切消化，利用spin-400純化柱進(jìn)行分級(jí)純化，收集含有cDNA的樣品與λTriplEx2載體16 ℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物用Gigapack Ⅲ packing extract包裝，得到未擴(kuò)增文庫(kù)。

1.2.3 文庫(kù)的擴(kuò)增

培養(yǎng)VCS257菌液，離心后用10 mol/L MgSO4調(diào)OD值為4.0，加入500 μL的過(guò)夜菌和足夠形成6～7×104個(gè)噬菌斑的包裝產(chǎn)物，將菌液與包裝產(chǎn)物混合液于37 ℃孵育15 min；立即加入LB頂層膠，顛倒混勻并倒入已經(jīng)準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基中；37 ℃孵育過(guò)夜直至噬菌斑相互接觸；隨后在平皿中加入SM buffer4 ℃過(guò)夜并洗脫表面噬菌斑將其收集純化，從而得到擴(kuò)增后的cDNA文庫(kù)，擴(kuò)增文庫(kù)在4 ℃可以保存6個(gè)月，長(zhǎng)期保存時(shí)需加入7%的DMSO以每管1 mL分裝于-70 ℃保存，且避免反復(fù)凍融。

1.2.4 文庫(kù)滴度測(cè)定

培養(yǎng)VCS257菌液，離心后用10 mol/L MgSO4調(diào)OD值為4.0，隨后稀釋包裝產(chǎn)物，未擴(kuò)增文庫(kù)按1∶10 和1∶20稀釋?zhuān)瑪U(kuò)增后文庫(kù)按1∶5 000和1∶10 000稀釋?zhuān)蝗? μL稀釋后的包裝產(chǎn)物加到菌液中；將菌液與包裝產(chǎn)物混合37 ℃孵育15 min；加入LB頂層膠顛倒混勻，并立即倒入已經(jīng)準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基中；37 ℃孵育過(guò)夜；查找噬菌斑個(gè)數(shù)，通過(guò)文庫(kù)克隆數(shù)量滴度計(jì)算公式：Pfu/mL=（噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×103）/鋪板的稀釋噬菌體體積（μL）來(lái)推斷未擴(kuò)增文庫(kù)滴度。

1.2.5 確定重組克隆的百分比

利用X-Gal顯色原理，在混有IPTG和X-gal及VCS257菌液的頂層膠的LB/MgSO4的平皿上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，以此檢測(cè)未擴(kuò)增文庫(kù)的重組率。37 ℃培養(yǎng)8～18 h，通過(guò)白色（重組體）和藍(lán)色（非重組體）來(lái)推斷cDNA文庫(kù)的重組率，重組率=重組體/總克隆×100%。

1.2.6 PCR檢測(cè)插入片段

隨機(jī)挑選96個(gè)噬菌斑樣品加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL的SM緩沖液孵育擴(kuò)增。取1 μL作為模板，以檢測(cè)引物cDNAF：CCATTGTGTTGGTACCCGG；cDNAR：ATACGACTCACTATAGGGCGAATT進(jìn)行PCR。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析電泳結(jié)果用以推斷重組率。重組率=陽(yáng)性克隆檢出數(shù)/測(cè)定樣品數(shù)。

1.2.7 ESTs獲取

為了在所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中識(shí)別和分析更多轉(zhuǎn)錄本的功能，隨機(jī)挑選500個(gè)噬菌斑作為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物提交至北京諾賽基因組研究中心有限公司，利用ABI3730基因分析儀對(duì)待測(cè)的500個(gè)樣品PCR產(chǎn)物以5端開(kāi)始進(jìn)行單項(xiàng)測(cè)序（測(cè)序引物序列5sequencing primer： CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT）。endprint

1.2.8 ESTs分析

利用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果中的空載、信號(hào)質(zhì)量雜亂以及小于l00 bp的序列去除，獲得單拷貝EST，將這些ESTs提交至NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用GenBank中的BLAST序列比對(duì)功能對(duì)所測(cè)的序列進(jìn)行相似性檢索比對(duì)，根據(jù)序列的相似性獲得最佳匹配效果的基因注釋 [6 ]，將匹配的序列通過(guò)GO（http：//wego.genomics.org.cn）與PANTHER（http：//www.pantherdb.org）進(jìn)行相關(guān)基因功能歸類(lèi)及分析 [7-8 ]。

2 結(jié)果

2.1 總RNA樣品檢測(cè)

提取的總RNA用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，OD260/OD280的比值為1.98，表明所提取的RNA沒(méi)有被DNA，蛋白和其他雜質(zhì)污染。樣品濃度約為3 650 ng/uL。甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)得到的電泳圖上能觀察到清晰的28 S核糖體RNA與18SRNA及5 S核糖體三條帶，如圖1所示。28 S和18 S兩條帶的灰度值比約為2：1，由此表明，RNA降解較少，保存較為完整，可用于后續(xù)文庫(kù)的構(gòu)建工作。

2.2 LD-PCR合成雙鏈cDNA

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和LD-PCR來(lái)合成全長(zhǎng)雙鏈cDNA，經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ds-cDNA應(yīng)分布在0.1～4 kb，如圖2所示，由此證明合成的cDNA雙鏈覆蓋的范圍很大，基因種類(lèi)豐富。

2.3 大片段cDNA分離處理

利用CHROMA SPIN-400 column分離純化不同大小的cDNA片段，得到400 bp以上的片段可用于后續(xù)連接載體使用。

2.4 cDNA文庫(kù)特征

未擴(kuò)增的文庫(kù)和擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度分別是：1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL。通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)插入片段的比率和插入片段的平均長(zhǎng)度，擴(kuò)增后文庫(kù)的重組率約為90.6%，插入片段在100～1 100 bp，如圖3所示。這些結(jié)果表明，插入片段包含大部分的cDNA片段，符合一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)構(gòu)建的要求，對(duì)進(jìn)一步研究基因結(jié)構(gòu)、翻譯和表達(dá)提供了必要的條件。

2.5 ESTs的生成

為了獲得更多運(yùn)動(dòng)員外周血淋巴細(xì)胞中ESTs功能性基因的信息，在本研究中，我們共對(duì)500個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，去除空載及結(jié)果在300 bp以下低質(zhì)量序列后，得到有效EST序列360個(gè)，其核苷酸片段大小分別從300～1 100 bp不等，平均長(zhǎng)度606 bp，如圖4所示。

2.6 GO分析

根據(jù)GO檢索出該數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能基因143個(gè)，參與31項(xiàng)生物功能，GO分析的結(jié)果主要分3類(lèi)。根據(jù)圖5可以很清晰地觀測(cè)到，在GO分類(lèi)分析結(jié)果中與細(xì)胞組成方面相關(guān)的生物學(xué)功能9個(gè)，與分子功能方面相關(guān)8個(gè)，與生物過(guò)程方面相關(guān)的注釋數(shù)量有14個(gè)，分別占29.0%、25.5%和45.5%。GO分析可反映同一基因具有的不同分子功能，同時(shí)也參與不同的生物學(xué)過(guò)程，從而反映生命過(guò)程的復(fù)雜性。

2.7 Pathway分析

將BLAST比對(duì)后具有注釋的基因進(jìn)行PANTHER檢索，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中有201個(gè)與本次提交信息相關(guān)的基因信息，這201個(gè)功能被發(fā)現(xiàn)參與27個(gè)相關(guān)的代謝途徑，其中占比率較高的分別為：整合素信號(hào)通路（Integrin signalling pathway）、趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路（Inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling pathway）、Rho GTPase調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架（Cytoskeletal regulation by Rho GTPase）、鈣粘著蛋白信號(hào)通路（Cadherin signaling pathway），而其中氧化應(yīng)激反應(yīng)（Oxidative stress response）、三羧酸循環(huán)（TCA cycle）和HIF激活缺氧反應(yīng)（Hypoxia response via HIF activation）等通路由于與新陳代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、心血管系統(tǒng)機(jī)能相關(guān)聯(lián)，推測(cè)可能與該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)存在關(guān)聯(lián)，如圖6所示。

3 討論

以往研究表明，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建是功能基因組分析不可缺的工具，可為生物體內(nèi)基因組機(jī)制多樣化過(guò)程提供更多的詳細(xì)信息，隨著科技的進(jìn)步，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)已日趨成熟，并在農(nóng)業(yè)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域取得了一批珍貴的研究成果，但在體育領(lǐng)域至今仍無(wú)人問(wèn)津。通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)不僅可有效保存優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員遺傳資源，分離全長(zhǎng)功能基因，還可以從轉(zhuǎn)錄水平反應(yīng)運(yùn)動(dòng)員特定時(shí)期功能基因在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老等生命現(xiàn)象的研究過(guò)程中起到重要作用，具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值[9]。由于cDNA便于克隆和表達(dá)，從cDNA文庫(kù)中篩選得出的目的基因可直接用于該基因的表達(dá)，是研究工作中最常使用到的表達(dá)基因文庫(kù)[10]。

已有研究表明，鑒定cDNA文庫(kù)的質(zhì)量需從3個(gè)方面進(jìn)行：首先根據(jù)Clareke公式計(jì)算，cDNA 文庫(kù)應(yīng)包含至少1.7×105獨(dú)立克隆來(lái)確保99%低豐度mRNA會(huì)呈現(xiàn)在庫(kù)中；其次是插入基因長(zhǎng)度應(yīng)在0.1 kb以上，確保cDNA的富集與完整，最后重組率應(yīng)達(dá)到90%以上，同樣作為一個(gè)評(píng)價(jià)文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)[4-12]。在本研究中，我們得到未擴(kuò)增與擴(kuò)增后滴度分別為1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL，插入片段在100～1 100 bp且重組率為90.6%的運(yùn)動(dòng)員cDNA文庫(kù)，表明該文庫(kù)質(zhì)量良好，可為該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員在轉(zhuǎn)錄水平的深入研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。另有研究表明，對(duì)于EST分析等功能基因組學(xué)的研究而言，大于300 bp的核苷酸序列即可以代表基因信息[13]；所以在對(duì)隨機(jī)挑選的500個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序后除去小于300 bp的序列，余下的360個(gè)序列長(zhǎng)度分別從300～1 100 bp不等，平均長(zhǎng)度為606 bp，從而進(jìn)一步表明所建文庫(kù)效果較好。因此，本研究構(gòu)建的文庫(kù)可以用于EST測(cè)序。在本文中我們所構(gòu)建的單板U型場(chǎng)地技巧運(yùn)動(dòng)員全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)符合標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)的要求。endprint

20世紀(jì)末Adams等[14]提出了ESTs的概念，通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)可以從中大規(guī)模獲得ESTs用于基因的共功能性研究，在本研究通過(guò)測(cè)序比對(duì)得到201個(gè)具有功能注釋的基因，參與27個(gè)相關(guān)的代謝途徑，其中占比率較高的如前所述。通過(guò)查詢(xún)發(fā)現(xiàn)文庫(kù)中所得基因TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等分別在這些pathway上被注釋?zhuān)瑥亩茢嗫赡軈⑴c與運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的機(jī)能。利用GO對(duì)所測(cè)ESTs進(jìn)行歸類(lèi)得到具有功能注釋的基因143個(gè)，參與31項(xiàng)不同功能，大多與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)活動(dòng)和新陳代謝相關(guān)，主要包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程，在各功能歸類(lèi)中細(xì)胞組成反映了基本功能基礎(chǔ)，分子功能反應(yīng)是一個(gè)單獨(dú)的基因產(chǎn)物的功能，而生物學(xué)過(guò)程則綜合反映各生命活動(dòng)過(guò)程的復(fù)雜性。通過(guò)對(duì)所獲得的ESTs信息注釋歸類(lèi)，從而獲得更多與身體機(jī)能及運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的信息為后續(xù)對(duì)該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員相關(guān)機(jī)能的研究提供依據(jù)。

目前研究表明，從文庫(kù)中選擇單克隆進(jìn)行ESTs測(cè)序，已被證明是一種快速高效的用以評(píng)估cDNA文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)方法[15]。通過(guò)計(jì)算某一基因片段在EST文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率，就可以確定基因表達(dá)的差異，隨著越來(lái)越多物種全基因組測(cè)序的完成，ESTs數(shù)據(jù)迅速增加，許多通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)中EST來(lái)鑒定cDNA文庫(kù)間基因差異表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)資源也發(fā)展起來(lái)，用EST序列分析來(lái)研究基因表達(dá)顯示良好的前景[15]。

早在1997年由McPherron等[16]在對(duì)小鼠肌肉cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)Myostatin（MSTN）基因，繼而鑒定出MSTN基因可強(qiáng)有力地負(fù)向調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育和使肌肉力量的增加，為人類(lèi)后期從文庫(kù)中篩選與肌肉力量相關(guān)基因提供可行性依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，由于外周血淋巴細(xì)胞取材便捷且攜帶大量遺傳信息，所以成為實(shí)驗(yàn)取材的首選。據(jù)以往研究表明，人類(lèi)淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜與多種疾病相關(guān)，是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，淋巴細(xì)胞是免疫活性細(xì)胞，分泌白細(xì)胞介素等多種重要的細(xì)胞因子，其中表達(dá)的基因不僅與免疫功能有關(guān)，而且與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞再生等有密切的關(guān)系，所以在后續(xù)研究中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值[17]。在本研究中，我們構(gòu)建運(yùn)動(dòng)員外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)，旨在批量保存優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員功能性基因的基礎(chǔ)上分離出大量的ESTs，以此推斷這些基因是否與某種運(yùn)動(dòng)能力存在相關(guān)聯(lián)系，同時(shí)也為以淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜研究運(yùn)動(dòng)員神經(jīng)系統(tǒng)，在相關(guān)基因的調(diào)控過(guò)程中所起的重要作用提供了更為便捷的途徑，因此，構(gòu)建運(yùn)動(dòng)員外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

單板U型場(chǎng)地雪上技巧作為一項(xiàng)開(kāi)展不久的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目，相關(guān)的科學(xué)研究目前十分有限，本研究通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，以基因組的形式對(duì)此類(lèi)運(yùn)動(dòng)員遺傳信息進(jìn)行永久保存，解決以往實(shí)驗(yàn)研究的接力式進(jìn)行與標(biāo)本的暫時(shí)性采集中存在的矛盾，以便有效地對(duì)同一研究對(duì)象進(jìn)行持久的連續(xù)性研究，為日后深入探索該項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員遺傳及發(fā)育特點(diǎn)提供可持續(xù)利用資源，此外，本研究結(jié)合測(cè)序技術(shù)得到大量的ESTs，從中篩選出相關(guān)基因，推測(cè)其可能與運(yùn)動(dòng)能力存在聯(lián)系，更是為備戰(zhàn)2022年我國(guó)冬季奧林匹克運(yùn)動(dòng)會(huì)前運(yùn)動(dòng)員的科學(xué)選材、運(yùn)動(dòng)基因的篩選及基因功能研究提供了一種新的思路與方法，對(duì)運(yùn)動(dòng)科學(xué)更好地開(kāi)展起著促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] TURNBULL J， KEOGH J W L， KILDING A E. Strength and Conditioning Considerations for Elite Snowboard Half Pipe[J]. Open Sports Medicine Journal， 2011， 5（1）： 1.

[2] GABBETT T J， DOMROW N. Relationships between training load， injury， and fitness in sub-elite collision sport athletes[J]. Journal of sports sciences， 2007， 25（13）： 1507.

[3] KIPP R W. Physiological Analysis and Training for Snowboard's Halfpipe Event[J]. Strength & Conditioning Journal， 1998， 20（4）： 8.

[4] WILLIAMS A G， FOLLAND J P. Similarity of polygenic profiles limits the potential for elite human physical performance[J]. The journal of physiology， 2008， 586（1）： 113.

[5] XIAO HONG C， ZHI C， HANG PING Y， et al. Construction and characterization of a cDNA library from human liver tissue with chronic hepatitis B[J]. Journal of Zhejiang University Science B， 2005， 6（4）： 288.

[6] LI J Y， WANG H Y， LIU J， et al. Transcriptome analysis of a cDNA library from adult human epididymis[J]. DNA research， 2008， 15（3）： 115.

[7] YING S Y. Complementary DNA libraries[J]. Molecular biotechnology， 2004， 27（3）：245.endprint

[8] GUO Y， LIU C， LU T， et al. Generation and analysis of a large-scale expressed sequence tags from a full-length enriched cDNA library of Siberian tiger[J]. Gene， 2014， 541（2）： 75.

[9] SAYERS E W， BARRETT T， BENSON D A， et al. Database resources of the national center for biotechnology information[C]//Haptics Symposium，IEEE， 2010：199.

[10] THANH T， CHI V T Q， ABDULLAH M P， et al. Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from green microalga Ankistrodesmus convolutus Corda[J]. Molecular biology reports， 2011， 38（1）： 177.

[11] LIU C Q， LU T F， FENG B G， et al. Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from Siberian tiger[J]. International journal of biological sciences， 2010， 6（6）： 584.

[12] LIU C， LIU D， GUO Y， et al. Construction of a Full-Length Enriched cDNA Library and Preliminary Analysis of Expressed Sequence Tags from Bengal Tiger Panthera tigris tigris[J]. International journal of molecular sciences， 2013， 14（6）： 11072.

[13] PRATT L H， LIANG C， SHAH M， et al. Sorghum expressed sequence tags identify signature genes for drought， pathogenesis， and skotomorphogenesis from a milestone set of 16，801 unique transcripts[J]. Plant physiology， 2005， 139（2）： 869.

[14] ADAMS M D， KELLEY J M， GOCAYNE J D， et al. Complementary DNA sequencing： expressed sequence tags and human genome project[J]. Science， 1991， 252（5013）： 1651.

[15] RICHMOND T， SOMERVILLE S. Chasing the dream： plant EST microarrays[J]. Current opinion in plant biology， 2000， 3（2）： 108.

[16] BELLINGE R H S， LIBERLES D A， IASCHI S P A， et al. Myostatin and its implications on animal breeding： a review[J]. Animal Genetics， 2005， 36（1）： 1.

[17] MEZEY E， CHANDROSS K J， HARTA G， et al. Turning blood into brain： cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow[J]. Science， 2000， 290（5497）： 1779.endprint