時燦燦，于明明，張先平，陳麗剛，王乾興

(1遵義醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州遵義 563003；2婁底市中心醫(yī)院)

生理性孕酮撤退過程中小鼠子宮角組織蛋白激酶 B、糖原合成激酶3β 的表達觀察

時燦燦1，于明明1，張先平2，陳麗剛1，王乾興1

(1遵義醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州遵義 563003；2婁底市中心醫(yī)院)

目的 觀察生理性孕酮撤退小鼠子宮角組織中蛋白激酶 B(Akt)及糖原合成激酶3β(GSK3β)的表達變化。方法 90只未交配健康成年雌性C57BL/6J小鼠，制作生理性孕酮撤退模型，分別在孕酮撤退0、8、12、16、20、24、32、40、48 h(48 h為小鼠生理性孕酮撤退周期)時處死10只小鼠，收集子宮角組織。采用real-time PCR法檢測孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA，采用Western blotting法檢測孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織總蛋白激酶 B(t-Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(Akt)及3βp-Akt及磷酸化糖原合成激酶(p-GSK3β)。結果 隨孕酮撤退時間延長，Akt mRNA及蛋白相對表達量逐漸降低，孕酮撤退20 h時達到最低值，后隨孕酮撤退時間逐漸延長，Akt mRNA及蛋白相對表達量逐漸升高。孕酮撤退8 h 時GSK mRNA及蛋白相對表達量高于孕酮撤退0 h時(P<0.05)；隨孕酮撤退時間延長，GSK mRNA及蛋白相對表達量逐漸降低，孕酮撤退24 h時達到最低值，后隨孕酮撤退時間逐漸延長， GSK mRNA及蛋白相對表達量逐漸增加。孕酮撤退20 h小鼠子宮角組織 Akt 、GSK3β mRNA表達量低于孕酮撤退后0、48 h(P均<0.05)。與孕酮撤退0 h比較，孕酮撤退20 h時小鼠子宮角組織p-Akt、p-GSK3β的相對表達量均降低(P均<0.05)。與孕酮撤退8 h比較，孕酮撤退20 h時小鼠子宮角組織p-GSK3β的相對表達量降低(P<0.05)。與孕酮撤退20 h比較，孕酮撤退48 h時小鼠子宮角組織p-Akt、p-GSK3β的相對表達量均升高(P均<0.05)。結論 生理性孕酮撤退小鼠子宮角組織中存在Akt表達隨時間下降后上調，GSK3β表達隨時間上調后下降后再次上調。 Akt/GSK-3β信號通路可能在鼠孕酮撤退過程中起重要作用。

月經；孕酮撤退；蛋白激酶 B;糖原合成激酶3β；動物實驗

在晚分泌期由于黃體功能的下降導致體內孕酮水平的降低成為孕酮撤退，孕酮撤退導致子宮內膜經歷一系列生化和細胞水平上的變化，最后發(fā)生凋亡和崩解，造成子宮內膜出血、脫落，即月經發(fā)生。孕酮撤退導致子宮內膜快速崩解、脫落是月經的顯著特征。月經是一個由于孕酮撤退而引發(fā)的涉及到內分泌和局部免疫系統(tǒng)相互作用的一個組織損傷過程[1]。目前關于子宮內膜崩解和修復過程所涉及分子機制并不明確。蛋白激酶 B/糖原合成激酶3β(Akt/ GSK3β)信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑之一，在調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、遷移、新陳代謝和血管生成等機體生理活動中具有重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化-蛋白激酶 B (p-Akt)及磷酸化-糖原合成激酶3β(p-GSK3β)在正常月經周期增殖期和分泌期子宮內膜中的表達呈周期性變化[2,3]，但關于其在孕酮撤退過程中的表達變化尚未見報道。本研究建立小鼠生理性孕酮撤退模型(即月經模型)，模擬子宮內膜崩解和修復過程，觀察Akt/GSK-3β信號通路在子宮內膜崩解和修復過程中的表達變化,現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 未交配健康成年(8～12周齡)雌性C57BL/6J小鼠90只購自重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物研究所，SPF Ⅱ級；光周期調控為6∶00～18∶00光照，18∶00～6∶00黑暗。溫度(21 ±1)℃，自由進食和攝水。雌二醇(E2,Alfa Aesar公司，英國)；孕酮(P4,Sigma公司，美國)；所有引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2 小鼠生理性孕酮撤退模型建立方法 小鼠生理性孕酮撤退模型建立方法參照文獻[4]稍作修改。主要步驟為：取90只小鼠乙醚麻醉下行雙側卵巢切除術，術后適應性恢復7 d以清除體內內源性激素，以術后第7天記為實驗第0天。分別于實驗第1～3天上午9∶30對小鼠皮下注射E2 100 ng；實驗第4～6天不做任何處理；實驗第7天上午9∶30于小鼠背部皮下埋植孕酮皮埋管，同時皮下注射P4 50 ng和E25 ng；實驗第8、9天的上午9∶30分別皮下注射E25 ng；實驗第9天上午11∶30取小鼠，在一側子宮角注射20 μL過濾除菌花生油誘導子宮內膜蛻膜化，誘導蛻膜化49 h后取出孕酮皮埋管，此點記為孕酮撤退0 h。分別在孕酮撤退0、8、12、16、20、24、32、40、48 h(48 h為小鼠生理性孕酮撤退周期)時隨機頸椎脫臼處死10只小鼠，收集子宮角組織，迅速放于液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA檢測 采用real-time PCR法。取生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織，根據TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA純度和濃度，所用樣品RNA的260/280比值在1.8～2.0。采用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)進行逆轉錄生成cDNA后進行real-time PCR實驗。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。Akt基因上游引物序列5′-CCCTTCTACAACCAGGACCA -3′,下游引物5′-CATGATCTCCTTGGCATCCT-3′； GSK3β基因上游引物序列5′-TGGCGTGTGATGTCAGGTAT -3′,下游引物5′-TAAGCTGGCATCTGCAACAC-3′；β-actin上游引物5′-AGGTATCCTGACCCTGAAGT-3′，下游引物5′-AGGTCTCAAACATGATCTGG-3′。以β-actin為內參。Akt及GSK3β mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.4 生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織總蛋白激酶 B(t-Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(Akt)及3βp-Akt及磷酸化糖原合成激酶(p-GSK3β)蛋白檢測 采用Western blotting法。取生理性孕酮撤退模型小鼠子宮角組織，提取小鼠子宮組織總蛋白后通過二喹啉甲酸( BCA) 法測定蛋白濃度，將40 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常規(guī)轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，兔抗鼠一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌，加入辣根過氧化酶( HRP) 標記的羊抗兔二抗( 1∶2 000) 室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL 發(fā)光檢測， 凝膠圖象分析各條帶的光密度值。以GAPDH為內參，以t-Akt、p-Akt及p-GSK3β的光密度與GAPDH光密度之比表示t-Akt、p-Akt及p-GSK3β的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達量比較 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達量比較見表1。

表1 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織Akt、GSK3β mRNA相對表達量比較

注：與孕酮撤退0 h比較，*P<0.05；與孕酮撤退8 h比較，☆P<0.05；與孕酮撤退20 h比較，#P<0.05。

2.2 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β相對表達量比較 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β 相對表達量比較見表2。

表2 孕酮撤退各時點小鼠子宮角組織t-Akt、p-Akt及p-GSK3β相對表達量比較

注：與孕酮撤退0 h比較，*P<0.05；與孕酮撤退8 h比較，☆P<0.05；與孕酮撤退20 h比較，#P<0.05。

3 討論

子宮內膜在雌激素和孕激素作用下，經歷了增殖、分化以及在分泌晚期孕酮撤退情況下的子宮內膜周期性的崩解、脫落和其后的再生修復過程。孕酮撤退后引起子宮螺旋動脈收縮，導致組織缺氧而引起長時間小動脈松弛和組織缺血再灌注，這又進一步引起了螺旋動脈的收縮，引起子宮內膜細胞凋亡，最終導致子宮內膜崩解和出血[5]。研究表明子宮內膜細胞凋亡是月經發(fā)生的原因，人子宮內膜細胞凋亡主要發(fā)生在晚分泌期，在月經期達到最高[6]。提示孕酮撤退后上調炎性介質引起的炎癥反應誘導子宮內膜基質細胞凋亡是子宮內膜組織崩解、壞死和脫落(即月經發(fā)生)的主要生理事件之一[7～9]。但究竟是什么信號來調控子宮內膜細胞凋亡目前尚未見報道，且子宮內膜修復過程中的分子機制也還不清楚。

Akt/GSK3β信號通路為經典的抗細胞凋亡途徑，同時可能參與缺血再灌注性組織損傷的修復[10]。最新研究表明，該通路參與子宮內膜細胞的增殖、凋亡及炎癥反應和血管生成，對維持子宮內膜規(guī)律、周期性變化具有重要作用。蛋白激酶B(PKB/Akt)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其激酶催化結構域與蛋白激酶A和蛋白激酶C具有較高的相似性。Akt激酶催化結構域蘇氨酸殘基(Thr308)位點磷酸化是活化Akt所必需的，其調節(jié)區(qū)域含有的第二個磷酸化位點(Ser473)磷酸化則可使Akt獲得最高活性。生理條件下，Akt以低活性狀態(tài)存在于細胞質，當細胞受到胞外刺激(如缺血或缺氧)時，首先活化磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，使其催化產生PIP3并與含有PH結構域的Akt結合，從而使其被激活成為磷酸化Akt(p-Akt)。p-Akt轉位到胞質或細胞核內，通過磷酸化GSK-3β的N-端ser-9位點而使之失活，促使下游的促存活、促細胞周期轉錄因子表達增加以及負調控caspase活性，最終抑制凋亡[11]。本實驗結果顯示，孕酮撤退后子宮內膜組織中總Akt蛋白在各時間點表達量無明顯差異，而Akt mRNA和p-Akt蛋白表達量從8 h開始緩慢降低，到20 h達最低點，隨后又逐漸增加，至48 h恢復到一定水平；GSK3β mRNA和p-GSK3β蛋白在孕酮撤退后8 h表達最高,隨后時間點表達趨勢與Akt mRNA和p-Akt蛋白表達趨勢一致。提示其機制可能為：①小鼠子宮內膜組織中總的Akt和GSK3β在月經周期中未出現(xiàn)周期性改變，與p-Akt和p-GSK3β的周期性變化不符。在人正常月經周期中的研究中也證實了這一點，即子宮內膜功能層中總Akt和GSK3β表達量在月經周期各階段無明顯差異，而p-Akt及p-GSK3β表達呈周期性變化[3,12]。這說明Akt和GSK3β的活性調節(jié)不是在轉錄水平進行，而是通過非轉錄機制進行蛋白質磷酸化而實現(xiàn)的信號分子的快速激活[13,14]。②在孕酮撤退后的月經發(fā)生過程(0～24 h)中，孕酮撤退12 h以前為小鼠月經發(fā)生的可逆轉時期，主要進行相關細胞因子表達以誘導子宮內膜基質細胞凋亡；孕酮撤退16 h以后為不可逆時期，主要進行白細胞、上皮細胞等引發(fā)的組織崩解事件[4]。本研究結果顯示，p-Akt在0 h表達最高，而p-GSK3β則在孕酮撤退8 h表達量增加，且都在隨后時間點逐漸下降，至孕酮撤退20 h達到最低。說明隨著孕酮撤退后小鼠體內孕酮水平的下降，Akt/GSK3β信號通路受抑制，即首先p-Akt水平下降，從而減少對GSK-3β的磷酸化作用使其活性增加，進而調控下游信號分子的表達而促進細胞凋亡，其可能機制有：激活p53表達而抑制Bcl-2、激活Bax,促進細胞凋亡[15]； GSK3β磷酸化水平的降低，可以解除p-GSK3β對NF-κB的競爭性抑制作用，一方面上調促炎性細胞因子生成，另一方面促使NF-κB p65轉位入核與MMP-9啟動子結合，從而促進子宮內膜組織崩解[16]。③在孕酮撤退后的子宮內膜再生和修復過程(24～48 h)中，p-Akt和p-GSK3β從孕酮撤退24 h開始表達量增加，至48 h時達到高峰，這與人子宮內膜研究結果相吻合[2]，即p-Akt在分泌早期和中期表達較增殖期降低，分泌晚期又逐漸增加，但均低于蛻膜組織。說明Akt/GSK3β信號通路的激活也參與了子宮內膜再生和修復過程。其可能機制是：可競爭性抑制NF-κB活性，抑制促炎性細胞因子生成，利于修復[17]；促進一氧化氮合酶(eNOS)的表達，增加子宮內膜腺體和基質細胞中的NO水平，從而促進子宮內膜增殖、血管擴張和血流灌注[17]；通過促血管生成素和血管內皮生長因子(VEGF)激活Akt，抑制血管內皮細胞凋亡，啟動一氧化氮合酶(eNOS)，反過來促進內皮細胞遷移、血管生成[18]。

綜上所述，孕酮撤退可能通過非轉錄機制而調控Akt磷酸化程度，負性調節(jié)GSK3β活性，進而通過其下游相關效應分子調控月經期子宮內膜炎性細胞浸潤、蛻膜化基質細胞發(fā)生凋亡崩解以及后期組織重塑。

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Expression of protein kinase B and glycogen synthase kinase 3β in mouse uterine horn during the process of physiological progesterone withdrawal

SHICancan1,YUMingming,ZHANGXianping,CHENLigang,WANGQianxing

(1DepartmentofCellBiology,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi563003,China)

Objective To observe the expression of protein kinase B (Akt) and glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) in the uterine tissues of mouse models in the process of physiological progesterone withdrawal.Methods We selected 90 non-mating healthy adult female C57BL/6J mice to make the physiological progesterone withdrawal models. Ten mice were killed at 0, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, and 48 h (The physiological progesterone withdrawal cycle in mice is 48 h) to collect uterine horns. The gene expression levels of Akt and GSK3β were detected by real-time PCR. The protein expression levels of total Akt, phosphorylated AKT and phosphorylated GSK-3β were detected by Western blotting.Results Over the time of progesterone withdrawal, the expression of Akt mRNA and protein gradually decreased (reached the minimum at 20 h) and then gradually increased. The expression of GSK3β mRNA and protein at 8 h was higher than that at 0 h (P<0.05). Over the time of progesterone withdrawal, the expression of GSK mRNA and protein decreased (reached the minimum at 24 h) and then gradually increased. The expression of Akt and GSK3β mRNA at 20 h was lower than that at 0 and 48 h (bothP<0.05). The expression of p-Akt and p-GSK-3β at 20 h decreased as compared with that at 0 h (bothP<0.05). The expression of p-GSK-3β protein in mouse uterine tissues at 20 h decreased as compared with that at 8 h (P<0.05). The expression of p-Akt and p-GSK3β protein at 48 h increased as compared with that at 20 h (allP<0.05).Conclusions Over the time of progesterone withdrawal, the expression of Akt gradually decreases and then increases in the uterine tissues of mouse models. Meanwhile, the expression of GSK3β first increases, then decreases, and finally increases again. Akt/GSK3β signal pathway may play an important role in the process of progesterone withdrawal.

menstruation; progesterone withdrawal; protein kinase B; glycogen synthase kinase 3β; animal experiment

貴州省科技廳聯(lián)合基金項目(黔科合J字LKZ-2010-33號)；貴州省科學技術基金資助項目(黔科合J字-2011-2282)。

時燦燦(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向為生殖醫(yī)學。E-mail: 915939832@qq.com

王乾興(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要研究方向為生殖醫(yī)學。E-mail: 317002641@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.003

R711.3

A

1002-266X(2017)19-0009-04

2016-11-18)