袁 航，汪 闖，王琴容，趙 艷，李雅潔，龍妮婭，周建獎

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點實驗室/地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴陽 550004)

阻斷胃泌素受體對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡及其信號通路的影響*

袁 航，汪 闖，王琴容，趙 艷，李雅潔，龍妮婭，周建獎△

(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點實驗室/地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴陽 550004)

目的 探討阻斷胃泌素受體對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。方法 試驗組使用終濃度為5 mmol/L的丙谷胺(胃泌素受體阻斷劑)處理胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS 6 d，以不加丙谷胺培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS為對照組。四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測各組細(xì)胞的生長并繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期，Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測各組細(xì)胞的凋亡；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測典型Wnt/β-catenin通路、核因子κB、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白中關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核轉(zhuǎn)錄因子RelA、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、糖原合酶激酶3β mRNAs的表達(dá)；免疫蛋白印跡檢測β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果 用丙谷胺處理后，試驗組細(xì)胞的生長速度低于對照組細(xì)胞，細(xì)胞周期中S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也低于對照組細(xì)胞，而G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于對照組細(xì)胞(P<0.05)；試驗組的細(xì)胞凋亡數(shù)高于對照組(P<0.05)； RT-qPCR結(jié)果顯示：丙谷胺處理后，胃癌細(xì)胞中β-catenin的 mRNA表達(dá)量降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示丙谷胺處理后，β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低(P<0.05)。結(jié)論 阻斷胃泌素受體能下調(diào)胃癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，同時促進細(xì)胞凋亡。

胃腫瘤；胃泌素類；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；丙谷胺；β-catenin

胃泌素是一種由胃竇部的G細(xì)胞合成分泌的肽類激素，胃泌素受體主要是膽囊收縮素-B(cholecystokinin-B receptor，CCK-B)受體，通常表達(dá)在胃腸道細(xì)胞的細(xì)胞膜上[1]。 已有證據(jù)表明，幽門螺旋桿菌(HP)感染會引起高胃泌素血癥[2-3]，本課題組前期研究也表明HP感染會上調(diào)胃泌素基因mRNA的表達(dá)水平[4]，而HP感染作為胃癌高發(fā)的生物因素，已經(jīng)得到公認(rèn),因此胃泌素可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期的體外研究也發(fā)現(xiàn)，胃泌素及其受體在胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901均有表達(dá)，用商品化胃泌素處理細(xì)胞后，兩種細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力增強[5-6]。丙谷胺具有跟胃泌素相似的結(jié)構(gòu)，能夠與胃泌素競爭結(jié)合胃泌素受體，是胃泌素受體的阻斷劑[7]。為了探究阻斷胃泌素受體對胃癌細(xì)胞的作用及其可能的信號通路，本研究用丙谷胺處理胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS，檢測細(xì)胞的增殖、凋亡及相關(guān)信號通路中幾個關(guān)鍵基因的表達(dá)，包括Wnt、核因子kappa B(NF-κB)、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-MTOR)信號通路中關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核轉(zhuǎn)錄因子(Rel A P65)、MTOR、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，尋找胃泌素的作用途徑及胃癌可能的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901和AGS購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由本實驗室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美國)，丙谷胺(國家食品藥品檢定研究所)，青鏈霉素(Hyclone，美國)，細(xì)胞總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiangen，中國)，四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)試劑盒、Western blot相關(guān)試劑、蛋白提取試劑盒(碧云天,中國)，瓊脂糖(Sigma，美國)，八連管(ABI，美國)，SYBER Green (ABI，美國)，細(xì)胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(BD，美國)，二喹啉甲酸 (BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)，β-catenin一抗、羊抗兔二抗(Proteintech，美國)。

1.2 方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS的培養(yǎng) 用含5%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)80%以上融合度時進行傳代，備用。

1.2.2 MTT試驗 取對數(shù)生長期的兩種細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板,試驗組加入含5 mmol/L丙谷胺的RPMI 1640完全培養(yǎng)基200 μL，對照組用RPMI 1640完全培養(yǎng)基,每組設(shè)5個復(fù)孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加20 μL MTT 液。孵育4 h后，去上清液，加入DMSO每孔150 μL，振蕩器振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm波長處測各孔吸光度(A)值，連續(xù)檢測7 d后繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡 試驗組與對照組細(xì)胞于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，棄培養(yǎng)基后PBS洗3次，加入胰酶消化收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期與凋亡，按試劑說明書操作。試驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-qPCR檢測各信號通路中關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá) 取各組細(xì)胞，按試劑盒步驟提取總RNA，去除gDNA。反應(yīng)體系如下：5×gDNA Buffer 2.0 μL，總RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補足10.0 μL，37 ℃ 孵育30 min。隨后用Oligo dt逆轉(zhuǎn)成cDNA。體系為 MIX 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，去離子水補足至20.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。收集各基因的熒光信號，以β-action為內(nèi)參基因，SDS 1.4軟件計算試驗組細(xì)胞中各靶基因的相對表達(dá)量。用融解曲線監(jiān)測各樣本PCR反應(yīng)的特異性，相對標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PCR反應(yīng)的擴增效率，試驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。計算公式：△Ct=待測基因Ct值-β-actin Ct值，△△Ct=試驗組△Ct-對照組△Ct，相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。qPCR引物序列見表1。

1.2.5 Western blot 檢測β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá) 取試驗組及對照組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量后，取20 μg總蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳3.0 h后轉(zhuǎn)膜封閉，兔抗β-catenin多克隆抗體(1∶1 500)4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)及HRP-β-actin(1∶10 000)孵育1 h后暗室膠片曝光。用Image J軟件處理條帶并讀取灰度值，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 阻斷胃泌素受體對細(xì)胞生長的影響 丙谷胺處理細(xì)胞后，試驗組SGC-7901、AGS細(xì)胞在培養(yǎng)第4天時A值低于對照組細(xì)胞(P<0.05)，培養(yǎng)第7天時兩組差異最大，見圖1。

表1 qPCR引物序列

A：SGC-7901；B：AGS。

圖1 SGC-7901(A)和AGS(B)的細(xì)胞生長曲線

2.2 阻斷胃泌素受體對細(xì)胞周期的影響 丙谷胺處理6 d后，試驗組細(xì)胞的S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于對照組細(xì)胞，G0/G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于對照組細(xì)胞，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 阻斷胃泌素受體對細(xì)胞凋亡的影響 丙谷胺處理細(xì)胞6 d后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示試驗組的凋亡細(xì)胞數(shù)均高于對照組細(xì)胞，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 阻斷胃泌素受體對信號蛋白β-catenin、P65、MTOR、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響 試驗組與對照組細(xì)胞的總RNA，A260/A280比值為1.8～2.0，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， RNA 28 s與18 s 的比例為1.5～2.0，提示RNA質(zhì)量較好。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示各基因的溶解曲線均為單峰，各基因的擴增特異性較好。 丙谷胺處理后，試驗組的β-catenin mRNA的表達(dá)量比對照組顯著降低，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而其他基因的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.5 阻斷胃泌素受體對β-catenin蛋白表達(dá)的影響 丙谷胺處理細(xì)胞6 d后，試驗組兩種胃癌細(xì)胞中的β-catenin蛋白質(zhì)表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

*：P<0.05，與對照組比較。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果

*：P<0.05，與對照組比較。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

*：P<0.05，與對照組比較。

圖4 信號通路中相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

*：P<0.05，與對照組比較。

圖5 丙谷胺處理對β-catenin蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

胃泌素促進胃癌細(xì)胞生長的作用在諸多研究中已經(jīng)證實， Cao等[8]在結(jié)腸癌細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)胃泌素有類似的作用，并且闡明是通過激活β-catenin/Tcf-4通路發(fā)揮作用。然而阻斷胃泌素受體對胃癌細(xì)胞作用的潛在機制的報道較少。為了進一步探究丙谷胺對胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS的作用，本研究根據(jù)前期結(jié)果用丙谷胺處理胃癌細(xì)胞，檢測細(xì)胞的生長，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡。與楊瑩瑩等[9]的結(jié)果相似，試驗組細(xì)胞的增殖受到抑制。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示阻斷胃泌素受體可能阻止細(xì)胞從G1期進入S 期，從而抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果還顯示，試驗組的凋亡細(xì)胞數(shù)增加，提示阻斷胃泌素受體不僅能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，還能促進胃癌細(xì)胞的凋亡，這些結(jié)果與國內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果一致[10-11]。

為了探討丙谷胺的作用機制，本研究用定量PCR技術(shù)篩查了與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號通路中幾個關(guān)鍵蛋白的mRNA表達(dá)，包括Wnt、NF-κB、PI3K-AKT-MTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、P65、MTOR及GSK-3β，結(jié)果僅有β-catenin mRNA的表達(dá)水平在處理的2株細(xì)胞中一致性的明顯降低，隨后用Western blot證實β-catenin蛋白表達(dá)量在丙谷胺處理后也一致性的明顯降低。β-catenin的功能主要體現(xiàn)在2個方面：(1)與E-cadherin組成復(fù)合物參與細(xì)胞間的黏附[12]；(2)作為經(jīng)典Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白參與通路的激活[13]。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)Wnt蛋白與受體結(jié)合后，會抑制此β-catenin降解復(fù)合物的形成，使β-catenin在胞內(nèi)聚集進而轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef-1 結(jié)合，引起c-Myc、Cyclin-D1、survivin等轉(zhuǎn)錄，引起腫瘤的發(fā)生[14-16]。同時也會調(diào)節(jié)眾多上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移(EMT)相關(guān)蛋白如MMP7、Snail、Twist等表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在胃癌組織高表達(dá)，同時與胃癌惡性程度正相關(guān)，并且隨著浸潤深度的增加而增加，推測可能是E-cadherin與β-catenin的復(fù)合物中E-cadherin的丟失使得癌細(xì)胞黏附減弱，易于脫落，促進了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[18]。同時，β-catenin從膜E-cadherin的結(jié)合部位分離，會更多地在胞內(nèi)聚集，從而激活Wnt信號通路，使腫瘤進展。因此，有諸多學(xué)者認(rèn)為β-catenin的異常表達(dá)可能作為胃癌進展的一個生物學(xué)指標(biāo)[19]。

在體外試驗中，潘安萍等[20]用慢病毒載體沉默胃癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默β-catenin后能夠減慢細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡，使眾多癌基因的表達(dá)下調(diào)。結(jié)合本研究，推測丙谷胺阻斷胃泌素受體后，可能通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)，抑制Wnt信號通路，進而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進胃癌細(xì)胞的凋亡，提示β-catenin有可能成為胃癌治療的靶點之一，但是具體機制有待進一步的研究。

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Influence of blocking gastrin receptor on the proliferation and apoptosis and expression of key proteins in related pathway of gastric cancer cell*

YuanHang，WangChuang，WangQinrong，ZhaoYan，LiYajie，LongNiya，ZhouJianjiang△

(KeyLaboratoryofMolecularBiologyofGuizhouMedicalUniversity/KeyLaboratoryofEndemicandMinorityDiseases,MinistryofEducationGuiyang，Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the effects of blocking gastrin receptor on the proliferation,apoptosis and expression of key proteins in the related pathway in gastric cancer cell lines.Methods In the experimental group，the gastric cancer cell lines SGC-7901 and AGS cells were treated with 5 mmol/L proglumide,a kind of a gastrin receptor antagonist.And the normal cultured gastric cancer cells SGC-7901 and AGS were used in control group.The growth of each group was detected by MTT assay;the cell growth curve was drawn by flow cytometry；the cell cycle of each group was detected by flow cytometry.Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect the cell growth of apoptosis.The relative mRNA expression of β-catenin,nuclear factor-P65,mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 beta in Wnt,NF-κB and PI3K-AKT-MTOR pathways were detected by RT-qPCR.The expression of β-catenin protein was detected by Western blotting.Results After treatment with proglumide,the growth of the cells in the experimental group was lower than that in the control group;and the proportion of S phase cells in the cell cycle was also lower than that in the control group,but the proportion of cells in G0/G1phase was higher than that in the control group (P<0.05).The percentage of apoptotic cells was also increased after treatment with proglumide(P<0.05).Furthermore,proglumide treatment significantly reduced the expression of β-catenin at both mRNA and protein levels(P<0.05).Conclusion Blocking gastrin receptor can down-regulate the expression of β-catenin,inhibit the cell proliferation and promote the cell apoptosis in gastric cancer cells.

stomach neoplasms；gastrins;apoptosis;cell proliferation；proglumide；β-catenin

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.001

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260303，31560326)；貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字[2015]7360)。 作者簡介：袁航(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事胃癌方面研究?！?/p>

，E-mail:jianjiangzhou@sina.cn。

R735.2

A

1671-8348(2017)15-2017-04

2016-11-18

2017-01-06)