張園，侯彥深，宋佳，董翔

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.腫瘤防治研究所，2.麻醉科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011)

·論 著·

凍融循環(huán)對肝癌新鮮凍存組織RNA完整性的影響

張園1，侯彥深2，宋佳1，董翔1

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1.腫瘤防治研究所，2.麻醉科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830011)

目的：評估新鮮凍存組織解凍后RNA降解動(dòng)力學(xué)變化，探討反復(fù)凍融對肝癌組織樣本質(zhì)量的影響。方法：將15例肝癌患者術(shù)后組織標(biāo)本各分11份，其中1份用于組織形態(tài)學(xué)驗(yàn)證，另外10份于-80℃保存，取4份標(biāo)本分別在凍融0、1、3、6次后提取RNA，剩余6份標(biāo)本分別在室溫下放置0min(T0)、5min(T5)、15min(T15)、30min(T30)、45min(T45)及1h(T60)后進(jìn)行RNA提取，采用微芯片凝膠電泳技術(shù)分析RNA完整性。結(jié)果：切片中腫瘤組織面積均超過85%，壞死組織面積均小于15%，符合國際腫瘤基因組聯(lián)盟制定的標(biāo)準(zhǔn)，且與術(shù)后病理學(xué)結(jié)果符合率達(dá)100%。不同凍融次數(shù)組織RNA完整性(RNA integrity number，RIN值)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而且凍融次數(shù)越多，RIN值越低(凍融循環(huán)0、1、3、6次后RIN分別為8.27±0.42、6.38±0.61、5.08±0.61、4.32±0.62)。隨解凍后RNA提取時(shí)間的延長，RNA完整性也不斷降低(T0：RIN=8.33±0.52；T5：RIN=7.95±0.48；T15：RIN=7.09±0.40；T30：RIN=5.88±0.39；T45：RIN=5.06±0.39；T60：RIN=4.40±0.30)，與T0時(shí)提取RNA比較，解凍后T30、T45、T60后提取RNA的RIN平均值顯著下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論：當(dāng)研究對RNA質(zhì)量要求比較高時(shí)，肝癌組織解凍不應(yīng)超過3次，并且在30min內(nèi)提取RNA，以保證RNA的完整性。

凍融；RNA提取時(shí)間；RNA完整性

生物樣本庫中的新鮮冰凍組織經(jīng)常被用于PCR、基因芯片、比較基因組雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此凍存質(zhì)量對研究的可靠性尤為重要[1]。組織細(xì)胞內(nèi)RNA容易降解，因此RNA檢測成為組織樣本質(zhì)量鑒定的重要指標(biāo)。完整性和均一性是評價(jià)RNA質(zhì)量的最關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)，也是下游生物學(xué)分析尤其是基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)和保障。

目前，關(guān)于不同保存條件對標(biāo)本影響的研究主要集中在臨床樣本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性上，有關(guān)標(biāo)本庫采集、儲(chǔ)存體系角度對樣本存儲(chǔ)溫度變化及反復(fù)凍融對標(biāo)本質(zhì)量的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在評估新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動(dòng)力學(xué)變化，探討反復(fù)凍融對肝癌組織樣本質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備

-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher Forma995)，液氮儲(chǔ)存箱(Thermo Fisher CryoPlus3)，普通小型(3L)液氮罐，干式恒溫器，低溫高速離心機(jī)(貝克曼 Microfuge 22R)，安捷倫2100生物分析儀。

1.2 主要試劑

Trizol，氯仿，異丙醇，DEPC，乙醇，RNA6000 Nano 總RNA分析試劑盒。

1.3 標(biāo)本采集與分組

1.3.1 組織標(biāo)本的留取 組織標(biāo)本來源于新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤防治研究所腫瘤資源庫，15例肝癌患者術(shù)前未經(jīng)過任何生物、化療及放療治療，所有標(biāo)本均有留取標(biāo)本知情同意書及倫理審查報(bào)告。組織離體后在不影響病理診斷的前提下切取腫瘤組織標(biāo)本，所留取的標(biāo)本避免了出血及壞死組織，每例組織標(biāo)本切成直徑約0.8cm的組織塊11份(約50mg·個(gè)-1)，其中1份經(jīng)福爾馬林固定用于組織病理學(xué)鑒定，其余分別裝入凍存管中，迅速放入液氮轉(zhuǎn)移罐，整個(gè)過程在20min內(nèi)完成。標(biāo)本在液氮轉(zhuǎn)移罐中速凍 30min后，轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 分組 標(biāo)本放置于25℃干式恒溫器上5min解凍，之后放入液氮速凍20min為1次凍融過程。根據(jù)凍融次數(shù)分為4組：對每例組織樣本分別在凍融0、1、3、6次后提取RNA，以凍融0次做參考，探討凍融次數(shù)對RNA提取效率和RNA質(zhì)量的影響。

根據(jù)標(biāo)本RNA提取延長時(shí)間分為6組：同例患者的組織標(biāo)本從-80℃超低溫冰箱取出后將其中1份標(biāo)本立刻置于Trizol中進(jìn)行RNA提取(T0)，剩余5份標(biāo)本分別在室溫下放置5min(T5)、15min(T15)、30min(T30)、45min(T45)、1h(T60)后進(jìn)行RNA提取。RNA提取效率和RNA質(zhì)量以T0做參考。

1.4 組織形態(tài)學(xué)檢測

將未發(fā)生凍融的1份冷凍組織標(biāo)本室溫解凍，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4～6μm切片，進(jìn)行HE染色。由病理科主任醫(yī)師對切片進(jìn)行病理學(xué)檢查，確認(rèn)取材部位與病理學(xué)診斷的符合情況，并檢測樣本的代表性，按照國際腫瘤基因組聯(lián)盟(ICGC)腫瘤組織樣本病理質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評判標(biāo)本質(zhì)量，即腫瘤部分占80%以上，壞死細(xì)胞少于20%為合格標(biāo)本。

1.5 總RNA提取在2mlEP管中放入組織標(biāo)本(約50mg)，加入1ml預(yù)冷Trizol，冰上機(jī)械制成勻漿，每使用 1ml Trizol加入0.2ml氯仿，離心后取上清，加入上清液等體積的異丙醇沉淀總RNA后，用75%乙醇洗滌并用RNase-free H2O溶解總RNA。

1.6 RNA濃度和純度檢測取2μl未稀釋的RNA樣本在NanoDrop2000分光光度計(jì)上檢測260nm/280nm RNA的濃度，判斷RNA純度標(biāo)準(zhǔn)是OD260/OD280值在1.9～2.0(比值<1.8表明有DNA、蛋白質(zhì)的污染，比值>2.1表明RNA降解或有異硫氰酸肌等物質(zhì)的污染)。

1.7 RNA完整性檢測參照RNA 6000 Nano Labchip Kit 說明書取50～100ng RNA與1μlRNA 6000 ladder在Agilent 2100生物分析儀上進(jìn)行分析，采用毛細(xì)管電泳法對28S和18S rRNA通過軟件進(jìn)行量化，得到RNA完整性(RIN)的值。RIN值在10(最佳質(zhì)量)～0(完全降解)之間[2]。根據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，本研究將RIN≥7的樣本RNA質(zhì)量評價(jià)為“優(yōu)”，4≤RIN<7的樣本RNA質(zhì)量評價(jià)為“中”，RIN<4的樣本RNA質(zhì)量評價(jià)為“差”。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 病理質(zhì)控結(jié)果

15例肝癌組織樣本，經(jīng)常規(guī)切片HE染色閱片，結(jié)果顯示，所選取的組織腫瘤細(xì)胞形態(tài)良好，符合肝細(xì)胞癌典型的病理特征(圖1)。切片中腫瘤組織面積均超過85%，壞死組織面積均小于15%，符合ICGC標(biāo)準(zhǔn)，且與術(shù)后病理學(xué)結(jié)果符合率達(dá)100%。

圖1 肝癌組織樣本 HE×200

Fig1 Liver tumor tissue sample HE×200

2.2 RNA濃度和純度檢測

在NanoDrop2000分光光度計(jì)上檢測RNA的濃度，結(jié)果顯示，RNA濃度范圍在185.0～1913.8ng·μl-1之間，RNA純度A260/A280值在1.94～2.06之間。

2.3 反復(fù)凍融對RNA樣本質(zhì)量的影響

不同凍融次數(shù)組織RIN值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而且凍融次數(shù)越多，RIN值越低，見表1。凍融0、1、3、6次后RNA質(zhì)量見表2。

表1 不同凍融循環(huán)次數(shù)肝癌組織樣本RIN值均數(shù)比較

Tab 1 Comparison the RIN value of HCC tissue sample after different freeze-thaw cycles

凍融次數(shù)nRIN值(x±s)0158.27±0.421156.38±0.613155.08±0.616154.32±0.62F值107.319P值0.000

表2 不同凍融循環(huán)次數(shù)肝癌組織樣本RNA質(zhì)量評價(jià)結(jié)果

Tab 2 Assessment the RNA quality of HCC tissue sample after different freeze-thaw cycles

凍融次數(shù)RNA質(zhì)量評價(jià)優(yōu)中差合計(jì)0150015141101530150156010515合計(jì)1936560

2.4 新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動(dòng)力學(xué)變化

檢測了15個(gè)肝癌組織樣本中6份標(biāo)本的RIN值，新鮮凍存組織解凍后RNA降解動(dòng)力學(xué)變化見表3。T0、T5、T15時(shí)標(biāo)本RIN值平均值均大于7，T0時(shí)與T30、T45、T60時(shí)相比，RIN平均值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

表3 新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動(dòng)力學(xué)變化
Tab 3 Kinetics of RNA degradation in fresh frozen HCC tissue samples after thawing

RNA提取時(shí)間nRIN值(x±s)T0158.33±0.52T5157.95±0.48T15157.09±0.40T30155.88±0.39T45155.06±0.39T60154.40±0.30F值153.387P值0.000

圖2 經(jīng)過反復(fù)凍融后樣本RIN變化趨勢圖(RIN值4和7為分界點(diǎn))

Fig 2 The RIN of all tissue-samples after repetitive freezingand thawing(The RIN of 7 and 4 are chosen as the value cutoff)

3 討 論

RNA的完整性和均一性是評價(jià)RNA質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)行后續(xù)研究的必要前提。使用生物分析儀測量RIN值是替代傳統(tǒng)的凝膠評價(jià)RNA質(zhì)量快速而簡單的方法，這種方法可以更好地反映RNA電泳圖中的特征，可以同時(shí)對RNA樣品進(jìn)行定量及質(zhì)量評估[2]。有研究顯示，組織RIN≥7的標(biāo)本可用于大部分傳統(tǒng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括對標(biāo)本質(zhì)量要求比較高的基因序列分析，4≤RIN<7的標(biāo)本可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，而RIN<4的標(biāo)本質(zhì)量會(huì)嚴(yán)重影響分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[2，4]。

在本研究中，未經(jīng)過凍融循環(huán)處理，立刻置于Trizol中進(jìn)行RNA提取的標(biāo)本，RIN值均大于7，RIN平均值可達(dá)8.27±0.42，標(biāo)本質(zhì)量最佳，也證明了本研究中標(biāo)本在采集、存儲(chǔ)及RNA提取的實(shí)驗(yàn)技術(shù)不存在問題。但是經(jīng)過1次凍融肝癌組織RIN平均值降到6.38±0.61，3次凍融組織RIN平均值降到5.08±0.61，6次凍融組織RIN平均值降到4.32±0.62。說明反復(fù)凍融可影響標(biāo)本RNA質(zhì)量，隨著凍融次數(shù)的增多，RNA完整性越差，對后續(xù)研究的影響也越大。若后續(xù)研究對RNA樣本質(zhì)量要求比較嚴(yán)格，例如miRNA芯片或miRNA定量PCR檢測，應(yīng)選取未經(jīng)凍融的標(biāo)本作相關(guān)研究。本研究還提示，對肝癌組織標(biāo)本經(jīng)過3次凍融仍有使用價(jià)值，可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，但應(yīng)避免凍融次數(shù)的繼續(xù)增多。李維凱等[5]從大鼠海馬組織提取總RNA后，測定了不同時(shí)間和溫度下保存，以及3次循環(huán)凍融后RNA完整性變化，結(jié)果表明，不同條件下保存及凍融3次后RNA完整性較首次均有所降低，本研究結(jié)果與其一致。

新鮮凍存組織在解凍后的幾分鐘甚至幾秒鐘就啟動(dòng)降解程序。本研究顯示，新鮮凍存組織解凍后立即提取的RNA質(zhì)量最佳，隨著解凍后時(shí)間的延長，RNA的完整性也不斷降低，但解凍15min后提取RNA的RIN均值為7.50±1.00，仍可滿足對標(biāo)本質(zhì)量要求較高的實(shí)驗(yàn)研究。當(dāng)新鮮凍存組織解凍30、45、60min后，提取RNA的RIN值下降，與解凍后5min及立即提取相比具差異有顯著性，解凍60min后的樣本RNA出現(xiàn)嚴(yán)重降解。因此，要避免新鮮凍存組織RNA的降解，應(yīng)在解凍后15min內(nèi)提取RNA。

[1] SHABIHKHANI M，LUVEY G M，WEI B，et al.The procurement，storage，and quality assurance of frozen blood and tissuebiospecimens in pathology，biorepository，and biobanksettings[J].Clin Biochem，2014，47(4-5)：258-266.

[2] SCHROEDER A，MUELLER O，STOCKER S，et al.The RIN：an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements[J].BMC Mol Biol，2006，7：3.

[3] ELLIOTT P，PEAKMAN T C，UK BIOBANK.The UK Biobank sample handling and storage protocol for the collection，processing and archiving of human blood and urine[J].Int J Epidemiol，2008，37(2)：234-244.

[4] SANDUSKY G E，TEHENY K H，ESTERMAN M，et a1.Quality control of human tissues-experience from the Indiana Univerrsity Cancer Center-Lilly Research Labs human tissue bank [J].Cell Tissue Bank，2007，8(4)：287-295.

[5] 李維凱，霍韜光，暢蓓，等.保存條件對大鼠海馬組織總RNA質(zhì)量的影響[J].化學(xué)研究，2012，23(5)：93-96.

Effects of freeze-thawing cycles on RNA integrity in fresh frozen liver tumor tissue

ZHANG Yuan1，HOU Yan-shen2，SONG Jia1，DONG Xiang1

(1.InstituteofCancerResearch；2.DepartmentofAnesthesiology，CancerAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：To evaluate the kinetics of RNA degradation and the effect of quality after thawing in fresh frozen liver cancer tissue.Methods： Fifteen specimens were from the patients of liver cancer.Each specimen was divided into 11 parts，1 of them was used for histomorphological verification，the others 10 were preserved in -80℃.Four parts of the specimen underwent 0 time，1 time，3 times，6 times repetitive freezing and thawing cycles before RNA extraction.The other 6 parts were thawed at room temperature for 0min(T0)，5min(T5)，30min(T30)，45min(T45)，1h(T60) before RNA extraction.RNA integrity was analyzed by microchip gel electrophoresis.Results： The tumor tissue area in detected specimens was over 85%，necrotic tissue area was less than 15%，which meet ICGC standard.The recombination rate of postoperative pathological diagnosis was 100%.The liver tissue RIN value was significant different after different freeze-thawing cycles，and the RIN value was decreased with increasing freeze-thawing times.The RINs were 8.27±0.42，6.38±0.61，5.08±0.61，4.32±0.62 at 0，1，3 and 6 times freeze-thawing cycles，respectively.The RNA integrity was decreased with increasing delayed RNA extraction time(T0：RIN=8.33±0.52；T5：RIN=7.95±0.48；T15：RIN=7.09±0.40；T30：RIN=5.88±0.39；T45：RIN=5.06±0.39；T60：RIN=4.40±0.30).The RIN value at T0 was significantly higher than those that at T30，T45 and T60 (P<0.001).Conclusion： According to the RIN results，we recommend that liver cancer tissue should not be thawed more than 3 times for studies requiring RNA of high quality and within 30 minutes for RNA extraction.

freeze-thawing；RNA extraction time；RNA integrity

2016-06-13

2016-09-03

新疆醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(XYDCX201472)

張園(1982-)，女，河北安國人，助理研究員。E-mail：18099606776@163.com

張園，侯彥深，宋佳，等.凍融循環(huán)對肝癌新鮮凍存組織RNA完整性的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：58-61.

R34

A

1671-6264(2017)01-0058-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.014