谷停停+王艷廷+許建鵬+李田田+劉永月+姜文芝+孫亞玲+楊亞會(huì)+曹辰興

摘要：以本課題組篩選的4個(gè)黃瓜自交系（4號(hào)、13號(hào)、19號(hào)、76號(hào)）為試材，以不抗白粉虱的大青把黃瓜材料為對(duì)照，探討了不同黃瓜材料接種白粉虱后防御性酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，接種白粉虱后各黃瓜材料5種防御性酶（PPO、HPL、LOX、SOD、APX）基因相對(duì)表達(dá)量變化差異較大，白粉虱抗性從高到低排序?yàn)?3號(hào)、4號(hào)、19號(hào)、76號(hào)、大青把。因此，13號(hào)是下一步培育抗白粉虱黃瓜新品種的首選材料。

關(guān)鍵詞：黃瓜；白粉虱；防御性酶基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.2：Q784文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）05-0039-07

Effects of Trialeurodes vaporariorum on Gene Relative Expression

Levels of Defensive Enzymes in Different Cucumber Materials

Gu Tingting， Wang Yanting， Xu Jianpeng， Li Tiantian， Liu Yongyue，

Jiang Wenzhi， Sun Yaling， Yang Yahui， Cao Chenxing

（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University/

State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

AbstractUsing four cucumber inbred lines （No. 4， 13， 19， 76） as test materials， and the Daqingba cucumber material which was not resistant to Trialeurodes vaporariorum as control， the changes of gene relative expression levels of defensive enzymes were studied before and after inoculation of Trialeurodes vaporariorum. The results showed that five kinds of defensive enzymes of each cucumber material presented obvious gene relative expression level changes after inoculation. The resistance to Trialeurodes vaporariorum showed the descending order as No.13， No.4， No.19， No.76 and Daqingba. So No.13 was the key material to breed new cucumber varieties resistant to Trialeurodes vaporariorum.

KeywordsCucumber； Trialeurodes vaporariorum； Defensive enzyme genes

黃瓜（Cucumis sativus L.）是重要的蔬菜作物之一，被稱(chēng)為世界性蔬菜[1-3]。然而，隨著種植面積不斷擴(kuò)大和集約化程度不斷提升，黃瓜病蟲(chóng)害的發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重[4]，尤其以白粉虱危害最為常見(jiàn)，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。而以化學(xué)防治為主的防治措施給黃瓜集約化、規(guī)模化生產(chǎn)造成了巨大的負(fù)面影響。因此，培育抗白粉虱黃瓜新品種就顯得尤為重要，其中，研究其抗性機(jī)理是育種的前提和關(guān)鍵。

酶是具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，幾乎所有細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)程都離不開(kāi)相關(guān)酶的參與，諸多研究也表明酶活性的高低與植物抗蟲(chóng)、抗逆性有密切關(guān)系[6-12]。如苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷類(lèi)代謝途徑的重要催化酶，是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，其活性的高低與次生代謝速度和次生代謝產(chǎn)物如酚類(lèi)、單寧、木質(zhì)素、黃酮等積累相關(guān)，從而間接增強(qiáng)植物抗蟲(chóng)性[13，14]；多酚氧化酶（PPO）可通過(guò)催化植物體內(nèi)酚類(lèi)物質(zhì)氧化生成醌，使植物汁液對(duì)害蟲(chóng)具有毒害作用而提高植物抗性[15]；脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）和脂加氧酶（LOX）可催化不飽和脂肪酸經(jīng)過(guò)脂質(zhì)生化代謝途徑形成C6、C9的醛、醇、酯類(lèi)綠葉揮發(fā)物質(zhì)，從而提高植物抗逆性[16]；而超氧化物歧化酶（SOD）可以通過(guò)清除超氧陰離子自由基反應(yīng)生成H2O2，過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸氧化酶（APX）則又具有分解H2O2的能力。正是各種酶之間的彼此協(xié)調(diào)、相互作用， 使細(xì)胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）保持在適當(dāng)水平， 從而減輕ROS對(duì)植物造成的毒害，提高植物的抗逆能力[17]。另外，APX 還是AsA-GSH（抗壞血酸—谷胱甘肽）循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一，與植物H2O2清除、抗衰老、抗病性及抗蚜性密切相關(guān)[18-21]。目前植物中關(guān)于各種酶與抗性關(guān)系的研究更多的集中于各相關(guān)酶的活性研究，對(duì)各種酶相關(guān)基因表達(dá)量方面的探討并不多見(jiàn)，黃瓜白粉虱抗性響應(yīng)研究方面更是至今未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以本課題組篩選的4種對(duì)白粉虱具有抗性的黃瓜自交系（4號(hào)、13號(hào)、19號(hào)、76號(hào)）為試材，以不抗的大青把黃瓜材料為參照，分別測(cè)定了接種白粉虱后多酚氧化酶（PPO）、脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸氧化酶（APX）5種防御性酶基因的相對(duì)表達(dá)量，探討了不同黃瓜材料接種白粉虱后各防御性酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化，旨在加強(qiáng)對(duì)黃瓜抗白粉虱機(jī)理的研究，進(jìn)一步為抗白粉虱黃瓜材料的篩選、新品種的培育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材

試材為本課題組篩選出的4份抗白粉虱黃瓜自交系：4號(hào)、13號(hào)、19號(hào)、76號(hào)和1份感白粉虱材料：大青把。

供試白粉虱蟲(chóng)源采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站9號(hào)日光溫室內(nèi)黃瓜植株，并在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中籠罩盆栽黃瓜植株上連續(xù)飼養(yǎng)多代（擴(kuò)大蟲(chóng)源）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年8月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站9號(hào)日光溫室中進(jìn)行。選取顆粒飽滿(mǎn)的黃瓜種子進(jìn)行浸種催芽處理，然后播種于塑料育苗缽（直徑10 cm，高8 cm）內(nèi)，每育苗缽1株，生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)每份材料選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的20株黃瓜幼苗，每株接種溫室白粉虱60頭，接種后每株用自制80目防蟲(chóng)網(wǎng)隔開(kāi)。

1.3樣品采集

接種白粉虱后，于第0、1、3、5、7 d取整片葉片，立即用鋁箔紙包好放入液氮罐中，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室置于-40℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.4防御性酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定方法

1.4.1防御性酶基因序列確定首先在擬南芥基因庫(kù)（http：//www.arabido psis.org/）中查找苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸氧化酶（APX）7種酶的基因序列，然后在黃瓜基因庫(kù)（http：//cucumber.genomics. org.cn/page/ cucumber/index.jsp）中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)出其中5種，分別為多酚氧化酶（PPO）、脂氫過(guò)氧化物裂解酶（HPL）、脂加氧酶（LOX）、超氧化物歧化酶（SOD）及抗壞血酸氧化酶（APX），具體為 PPO（CsPPO，Csa5M184820.1）、HPL（CsHPL，Csa7M041960.1）、LOX（CsLOX，Csa2M023850.1），SOD（CsSOD，Csa1M573600.2）和APX（CsAPX，Csa1M479610.2）。

1.4.2引物設(shè)計(jì)采用Beacon Designer 7軟件，以5種酶相關(guān)基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，具體見(jiàn)表1。

1.4.3相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit（離心柱型）試劑盒提取黃瓜葉片RNA，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用TransGen Biotech公司生產(chǎn)的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR儀型號(hào)為Bio-Rad CFX96（USA），熒光定量PCR反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)配制，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考許海峰等[22]的方法。其中，以UBI為內(nèi)參，每個(gè)基因擴(kuò)增均有內(nèi)參同時(shí)擴(kuò)增，默認(rèn)條件下讀取Ct值，采用2-ΔΔCT方法分析[23]：△△CT=（CT，Target-CT，UBI）（待測(cè)樣本）-（CT，Target-CT，UBI）（校準(zhǔn)樣本）。

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值，用Microsoft Excel 2010和DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1大青把黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

不抗白粉虱大青把黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢钥闯?，各種酶基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)白粉虱侵害的反應(yīng)不同。接種1 d后LOX、SOD酶基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化，而PPO、HPL、APX三種酶基因迅速做出反應(yīng)，其表達(dá)量極顯著降低。接種3 d后，5種酶基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于接種前水平。隨后PPO酶基因表達(dá)量一直維持在較低水平；HPL、APX酶基因表達(dá)量雖然顯著回升，但接種7 d后仍極顯著低于接種前水平；LOX酶基因相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)到接種前水平；僅SOD酶基因相對(duì)表達(dá)量在接種7 d后超過(guò)接種前水平。這表明大青把黃瓜材料對(duì)白粉虱的侵害未做出有利反應(yīng)，即未增加能產(chǎn)生阻止昆蟲(chóng)接近的揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)酶（HPL、LOX）基因相對(duì)表達(dá)量，又未增加產(chǎn)生對(duì)蟲(chóng)害有毒害作用的次生代謝物相關(guān)的酶（PPO）基因相對(duì)表達(dá)量，對(duì)消除逆境環(huán)境的酶（APX）基因表達(dá)量也產(chǎn)生了不利的影響，對(duì)能消除逆境傷害的酶（SOD）基因表達(dá)量也是到白粉虱侵害7 d后才明顯升高。這些結(jié)果均說(shuō)明大青把黃瓜材料對(duì)白粉虱侵害無(wú)積極反應(yīng)，因而不抗白粉虱。

2.24號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

4號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2?？芍?種酶基因相對(duì)表達(dá)量在接種白粉虱后第1 d均極顯著高于接種白粉虱前，而在第3 d普遍下降，在第5～7 d，PPO、HPL、LOX、SOD酶基因相對(duì)表達(dá)量又上升，總體各種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)為先上升后下降再上升趨勢(shì)。除APX酶基因外，接種白粉虱后1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD酶基因平均相對(duì)表達(dá)量均高于接種白粉虱前，為接種白粉虱前的1.33、1.88、4.43、1.29倍（均值）。

與對(duì)照大青把相比，4號(hào)黃瓜材料5種酶基因相對(duì)表達(dá)量在接種白粉虱1～7 d，除APX外均高于接種前，其中，在接種1 d后表達(dá)量差異均達(dá)到極顯著水平，可見(jiàn)4號(hào)黃瓜材料對(duì)白粉虱的侵害非常敏感，反應(yīng)迅速，能及時(shí)合成大量的次生代謝物質(zhì)，從而阻止或者減緩白粉虱的進(jìn)一步侵害，并對(duì)白粉虱的危害進(jìn)行及時(shí)地修復(fù)。

2.313號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

13號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍臃N白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量總體為上升-下降-上升的趨勢(shì)，其中，接種白粉虱1 d后PPO、HPL、LOX、SOD極顯著高于接種白粉虱前，而在第3 d又普遍下降，但仍高于接種前水平。接種1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD、APX酶基因相對(duì)表達(dá)量均高于接種前，差異多數(shù)達(dá)到極顯著水平，平均為接種前的1.52、1.96、4.09、1.62、1.05倍。

同對(duì)照大青把相比，5種酶基因相對(duì)表達(dá)量均對(duì)白粉虱的侵害有明顯的積極響應(yīng)，13號(hào)黃瓜材料對(duì)白粉虱的侵害極為敏感，比4號(hào)黃瓜材料敏感性更強(qiáng)。

2.419號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

19號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4?？芍臃N白粉虱后除APX外，PPO、HPL、LOX、SOD 4種酶基因相對(duì)表達(dá)量總體為上升-下降-上升的趨勢(shì)，其中PPO表達(dá)量接種前后變化不明顯，HPL、LOX、SOD表達(dá)量接種白粉虱1 d后都極顯著高于接種白粉虱前，在接種3～5 d內(nèi)只有HPL酶基因表達(dá)量較接種前高，而APX表達(dá)量在接種白粉虱后1～7 d內(nèi)均極顯著低于接種前。

由上可知，5種酶中只有HPL、LOX、SOD 3種酶基因?qū)Π追凼那趾τ斜容^明顯的響應(yīng)，可見(jiàn)19號(hào)黃瓜材料對(duì)白粉虱的侵害敏感性一般，比4號(hào)、13號(hào)材料弱。

2.576號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

76號(hào)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5?？芍?，接種白粉虱1 d后LOX表達(dá)量與接種前相比極顯著增加，PPO、HPL、SOD 3種酶基因相對(duì)表達(dá)量有所增加，但差異不顯著，而APX表達(dá)量極顯著降低，第3 d才極顯著高于接種前；在接種后5～7 d，除SOD明顯增加外，PPO、LOX酶基因表達(dá)量與接種前一致，而HPL、APX酶基因表達(dá)量變化規(guī)律不明顯。

由上可知，5種酶基因表達(dá)量變化對(duì)白粉虱侵害響應(yīng)不明顯，可見(jiàn)76號(hào)黃瓜材料對(duì)白粉虱的侵害敏感性較差，僅比對(duì)照大青把反應(yīng)強(qiáng)一些。

綜上對(duì)5個(gè)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果可知，白粉虱抗性能力排序?yàn)?3號(hào)>4號(hào)>19號(hào)>76號(hào)>對(duì)照。因此，13號(hào)為進(jìn)一步重點(diǎn)培育的抗白粉虱黃瓜新材料。

3討論與結(jié)論

研究表明，同種寄主植物的不同品種如煙草、番茄、辣椒、豇豆等對(duì)白粉虱的抗性不同[24-27]，這與植株葉片內(nèi)防御性酶活性變化有密切聯(lián)系[28，29]?？缀｝埖萚28]研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱成蟲(chóng)侵害導(dǎo)致辣椒葉片內(nèi)POD、SOD防御酶活性上升，而且品種抗性越強(qiáng)，上升幅度越大；陳奕磊等[29]研究表明，煙粉虱侵害番茄不同品種后，落蟲(chóng)量多的防御酶活性變化顯著，落蟲(chóng)量少的防御酶活性變化不顯著；王濤等[30]對(duì)不同黃瓜材料白粉虱侵害后研究發(fā)現(xiàn)，POD、PAL、PPO 等酶的活性普遍升高，并認(rèn)為三種酶活性的增強(qiáng)與無(wú)毛黃瓜突變體對(duì)白粉虱的抗性緊密相關(guān)。本研究對(duì)5個(gè)黃瓜材料接種白粉虱后5種酶基因相對(duì)表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，4號(hào)、13號(hào)、19號(hào)多數(shù)酶表達(dá)量在接種白粉虱1 d后就極顯著增加，1～7 d總體為上升-下降-上升的變化趨勢(shì)。其中，4號(hào)黃瓜材料除APX外，接種白粉虱后1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD酶基因平均相對(duì)表達(dá)量均高于接種白粉虱前；13號(hào)接種1～7 d PPO、HPL、LOX、SOD、APX 5種酶基因相對(duì)表達(dá)量均高于接種前，差異多數(shù)達(dá)到極顯著水平；但19號(hào)5種酶中只有HPL、LOX、SOD 3種酶基因?qū)Π追凼那趾τ休^明顯的響應(yīng)；而76號(hào)接種白粉虱1 d后僅有LOX表達(dá)量與接種前相比極顯著增加，PPO、HPL、SOD 3種酶基因相對(duì)表達(dá)量增加不顯著，APX表達(dá)量卻極顯著降低，在接種5～7 d后，PPO、HPL、LOX、APX 4種酶基因表達(dá)量變化規(guī)律不明顯，總體與接種前相比為降低；對(duì)照材料接種1～7 d發(fā)現(xiàn)，總體上，與接種前相比PPO、HPL、LOX、APX等酶基因相對(duì)表達(dá)量均為下降。綜合分析認(rèn)為白粉虱抗性排序?yàn)?3號(hào)>4號(hào)>19號(hào)>76號(hào)>對(duì)照，這與本課題組許建鵬對(duì)這5種黃瓜材料抗白粉虱研究得到的PPO酶活性1～7 d變化趨勢(shì)及各材料抗性順序基本一致[31]。對(duì)于更深入的抗性機(jī)理有待借助分子生物學(xué)、基因克隆等手段進(jìn)一步深入研究，以期為黃瓜抗白粉虱育種提供更加深入可靠的理論指導(dǎo)和理論支撐。

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