袁志明，林澤旭，陳一峰，吳曉紅，林 鑫

長鏈非編碼RNA TUSC7對人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

袁志明1，林澤旭1，陳一峰2，吳曉紅1，林 鑫1

目的 探討長鏈非編碼RNA TUSC7在人皮膚惡性黑色素瘤(malignant melanoma, CMM)細(xì)胞株中的表達(dá)及其對人黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響。方法 采用qRT-PCR技術(shù)檢測人皮膚CMM組織和良性痣組織，CMM細(xì)胞株G-361、SK-MEL-1、A375、A875和正常人表皮黑色素細(xì)胞系HEMn-LP中TUSC7的表達(dá)。將CMM A375細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染TUSC7過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-TUSC7組)和陰性對照序列(pcDNA3.1組)，分別采用CCK-8法和克隆形成實驗檢測兩組細(xì)胞的增殖情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 60例CMM組織和CMM細(xì)胞株中TUSC7的表達(dá)水平顯著低于20例良性痣組織和正常人表皮黑色素細(xì)胞(P<0.05)。A375細(xì)胞過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-TUSC7轉(zhuǎn)染組中TUSC7表達(dá)水平顯著高于pcDNA3.1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CCK-8和克隆集落形成實驗結(jié)果表明pcDNA-TUSC7組A375細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞克隆數(shù)均顯著低于pcDNA3.1組，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率結(jié)果表明pcDNA-TUSC7組A375細(xì)胞凋亡率均顯著高于pcDNA3.1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CMM細(xì)胞株中TUSC7呈低表達(dá)，上調(diào)TUSC7表達(dá)能顯著抑制CMM細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，TUSC7可能參與CMM的惡性進(jìn)展。

皮膚腫瘤；惡性黑色素瘤；長鏈非編碼RNA；TUSC7；細(xì)胞增殖；凋亡

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一種黑色素細(xì)胞失控性增殖引起的高侵略性腫瘤，占皮膚惡性腫瘤的10%左右[1]。盡管有伊匹單抗、維羅非尼、達(dá)拉菲尼和曲美替尼等多種靶向藥物已被臨床用于治療轉(zhuǎn)移性CMM，為CMM的治療帶來徹底的革新，但截至目前，CMM仍無法治愈[2]。這就促使研究者們更好的理解CMM的發(fā)生、發(fā)展機制，而研究不同基因在CMM中的表達(dá)情況和功能已成為發(fā)展新的治療方法的基礎(chǔ)。

繼蛋白編碼RNA后，miRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等非編碼RNA極大的補充了機體中高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3-4]。lncRNA由于其在人類基因組中巨大的數(shù)量和全方面多機制的腫瘤調(diào)控功能也引起越來越多學(xué)者關(guān)注[5-6]。通過直接調(diào)控致癌或抑癌基因，lncRNA可在CMM中行使促癌或抑癌作用[7-8]。TUSC7(tumor suppressor candidate 7)，又名LOC285194，是一個位于人類染色體3q13.31的可在多種腫瘤中扮演抑癌基因角色的lncRNA[9-13]。目前為止尚無關(guān)于其在人CMM組織和細(xì)胞中表達(dá)情況及其是否功能性參與CMM發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化的公開報道。本實驗通過qRT-PCR技術(shù)檢測人CMM組織和細(xì)胞株及良性痣中TUSC7的表達(dá)；并采用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)結(jié)合CCK-8實驗、克隆集落形成實驗觀察TUSC7對細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院2012年4月～2015年10月手術(shù)切除的60例CMM和20例良性痣手術(shù)切除標(biāo)本，術(shù)前患者均未接受放療、化療及免疫治療，術(shù)后均經(jīng)病理證實為CMM?；颊呔押炇鹬橥鈺?。標(biāo)本采集后置于DEPC水處理后的凍存管，浸沒于RNA Latter中，存放于-80 ℃冰箱備用。所有細(xì)胞均為本科室保有并常規(guī)培養(yǎng)傳代。正常人表皮黑色素細(xì)胞系HEMn-LP培養(yǎng)于M-254(Invitrogen公司，Carlsbad，CA, USA)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所有4株人黑色素瘤細(xì)胞株(G-361，SK-MEL-1，A375，A875)均培養(yǎng)于DMEM(Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA)培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均含1%雙抗(青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L)和10%胎牛血清(Gibco公司，Carlsbad，CA，USA)，細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中，5%CO2濃度下培養(yǎng)。2～3天細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%可進(jìn)行傳代。PCR引物(上海生工公司)。

1.2 試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(大連Takara公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，上海生工公司)。TRIzol試劑、雙抗、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000均購自美國Invitrogen公司。pcDNA/TUSC7表達(dá)載體(引物序列：上游5′-CGATCTTAATTAAGGGGTACCAAAGTCCACTCTG-3′，下游5′-TCAGTGGCGCGCCTTTTTCGTGAGTACACAATAGTCATC-3′)和陰性對照pcDNA3.1質(zhì)粒，克隆酶切位點：BamHI/EcoRI，購自上海權(quán)陽生物公司。CCK-8試劑購自上?？蒲派锕尽＝Y(jié)晶紫購自美國Sigma公司。G418、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.3 總RNA抽提及qRT-PCR 采用TRIzol試劑一步法分別提取各細(xì)胞株總RNA。根據(jù)兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，擴增TUSC7和內(nèi)參GAPDH基因。引物序列：GAPDH上游5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′，下游5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′，擴增產(chǎn)物片段長度為309 bp；TUSC7上游5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，下游5′- TTGTGCCATGAGACTCCATCAG-3′，擴增產(chǎn)物片段長度為325 bp。反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s后，進(jìn)行40個循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。運用熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的純度。獲得CT值，基因表達(dá)量采用qRT-PCR相對定量法對2-ΔΔCT進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計算。

1.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染和TUSC7穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建 轉(zhuǎn)染前1天在6孔板中接種每升2.5×105個的A375細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)60%～70%。第2天按照轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將pcDNA-TUSC7陰性對照質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞(2 μg質(zhì)粒，5 μL Lipofectamine 2000)，轉(zhuǎn)染6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞供后續(xù)功能實驗使用，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞用于提取RNA檢測轉(zhuǎn)染效率。用150 μg/mL G418篩選3周，獲得穩(wěn)定表達(dá)TUSC7 RNA的A375細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞，將2株細(xì)胞擴大培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代，并用RT-PCR法鑒定陽性克隆。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 用DMEM培養(yǎng)液制備A375/pcDNA3.1細(xì)胞和A375/pcDNA-TUSC7細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，制備濃度為3×103/100 μL的單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組6個復(fù)孔，共5板。設(shè)置貼壁時間為0 h，之后每24 h取出1塊96孔板，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀檢測其在波長450 nm處的吸光值(A)。連續(xù)記錄96 h的實驗結(jié)果，分析各組細(xì)胞的增殖能力。

1.6 克隆形成實驗 用DMEM培養(yǎng)液制備穩(wěn)定表達(dá)A375/pcDNA3.1細(xì)胞和A375/pcDNA-TUSC7細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，制備濃度為800/2 mL的單細(xì)胞懸液。6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞各鋪3個復(fù)孔。培養(yǎng)第7天換一次新鮮培養(yǎng)基。10天后，取出棄去培液，PBS清洗，乙醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗，晾干。拍照并計數(shù)計算克隆形成率。

1.7 流式細(xì)胞學(xué)實驗 收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，離心去上清后，用PE Annexin V凋亡檢測試劑盒進(jìn)行雙標(biāo)染色(美國BD公司)。細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析(FACSca；美國BD公司)。細(xì)胞被分類為活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，對各組間早期凋亡比例進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 TUSC7在CMM組織中的表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)檢測60例CMM組織和20例良性痣組織中TUSC7的表達(dá)結(jié)果顯示，CMM組織中TUSC7 mRNA的相對表達(dá)量(0.507±0.079)顯著低于良性痣組織(1.568±0.246)(P<0.05，圖1)。

圖1 TUSC7在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)

2.2 TUSC7在CMM細(xì)胞株中的表達(dá) 人CMM細(xì)胞株G-361、SK-MEL-1、A375和A875中TUSC7的表達(dá)量均顯著低于正常人表皮黑色素HEMn-LP細(xì)胞株(P<0.05，圖2)。以上結(jié)果證實TUSC7在CMM組織及細(xì)胞系中表達(dá)降低，故選用相對低表達(dá)的A375細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的功能實驗。

圖2 TUSC7在惡性黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)與正常黑色素細(xì)胞相比，*P<0.05

2.3 A375細(xì)胞中TUSC7的過表達(dá)效果 用qRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)TUSC7的mRNA表達(dá)量，與pcDNA3.1組相比，轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的pcDNA-TUSC7組中TUSC7表達(dá)水平顯著升高(P<0.01，圖3)，上調(diào)約32倍。

圖3 qRT-PCR檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞中TUSC7的表達(dá)

2.4 過表達(dá)TUSC7對A375細(xì)胞增殖能力的影響 通過酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在加入CCK-8試劑并避光孵育后在波長450 nm處的吸光值，結(jié)果顯示：與A375/pcDNA3.1組比較，A375/pcDNA-TUSC7組的細(xì)胞增殖能力減弱，轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞增殖能力低于A375/pcDNA-3.1組(P<0.05，圖4)。細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果表明A375/pcDNA-TUSC7組細(xì)胞克隆數(shù)少于A375/pcDNA3.1組(P<0.05，圖5)，這表明A375細(xì)胞過表達(dá)TUSC7后克隆形成能力減弱。

2.5 過表達(dá)TUSC7對A375細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與A375/pcDNA3.1組比較，A375/pcDNA-TUSC7組的細(xì)胞凋亡率增加，轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞凋亡率高于A375/pcDNA-3.1組(P<0.05，圖6)。這表明TUSC7可促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。

圖4 CCK-8法檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞增殖情況

圖5 pcDNA-TUSC7和pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染10天后A375細(xì)胞的克隆形成情況

圖6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測pcDNA-TUSC7及pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞的凋亡率

3 討論

大量研究表明lncRNA不僅參與調(diào)控生命體的各種生理病理進(jìn)程，這一類既往被人們誤判為基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymerase Ⅱ, RNA PⅡ)轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物亦可在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化中扮演重要角色。TUSC7既往也被報道在骨肉瘤[9]、胰導(dǎo)管腺癌[10]、食管鱗狀細(xì)胞癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、胃癌[13]等多種腫瘤中異常表達(dá)。相關(guān)報道亦證實，TUSC7是腫瘤抑制因子，其表達(dá)缺失參與多種腫瘤惡性轉(zhuǎn)化甚至化療耐受的調(diào)控。

本實驗采用qRT-PCR技術(shù)對人CMM組織和細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果表明TUSC7在CMM組織中表達(dá)顯著低于良性痣組織；且在CMM細(xì)胞系中的表達(dá)顯著低于正常表皮黑色素細(xì)胞系。其中A375細(xì)胞株中TUSC7的表達(dá)下調(diào)最明顯，故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)試驗。期望通過研究TUSC7在A375細(xì)胞中的功能，發(fā)現(xiàn)CMM新的治療靶點。

利用質(zhì)粒構(gòu)建和瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)可在短期內(nèi)大量增加細(xì)胞內(nèi)TUSC7的表達(dá)量，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。本實驗首先過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)TUSC7含量，在qRT-PCR檢測結(jié)果證實細(xì)胞內(nèi)TUSC7顯著上調(diào)后，通過細(xì)胞增殖實驗和克隆集落形成實驗，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)可顯著抑制A375細(xì)胞的增殖和克隆形成，且流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明過表達(dá)TUSC7的凋亡率顯著高于對照組，表明TUSC7在人CMM中也可發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，參與調(diào)控CMM的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化。

既往研究表明：作為p53信號通路的重要調(diào)控因子[14]，TUSC7可通過與miR-211和miR-23b等miRNAs互補結(jié)合，發(fā)揮“海綿”作用抑制后者功能，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13-14]。然而，TUSC7影響人CMM發(fā)生、發(fā)展的下游分子機制如何，尚未可知。作者推測TUSC7或可通過與潛在的人CMM特異miRNAs之間形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖。然而，特定的lncRNA在不同的組織和細(xì)胞類型中其作用靶點可能也不盡相同[15]。因此，TUSC7在人CMM中的作用靶點如何需要進(jìn)一步的機制研究來闡明。在未來的研究工作中，可以利用諸如基因組芯片技術(shù)、二代測序和蛋白質(zhì)譜等高通量檢測方法檢測經(jīng)過TUSC7干預(yù)的人CMM細(xì)胞，獲得一個基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化的全局視圖，有望深入闡明其作用機制。

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Expression of lncRNA TUSC7 in melanoma A375 cell line and its effect on proliferation and apoptosis of melanoma cells

YUAN Zhi-ming1, LIN Ze-xu1, Chen Yi-feng2, WU Xiao-hong1, LIN Xin1
(1DepartmentofPlasticSurgery,2DepartmentofPathology,FujianMedicalUniversityAffiliatedQuanzhouFirstHospital,Quanzhou362000,China)

Purpose To investigate the expression level and the role of TUSC7 in human cutaneous malignant melanoma (CMM). Methods Quantitative real time-PCR (qRT-PCR) assay was performed to detect the expression of TUSC7 in 60 cases of CMM tissues, 20 cases of benign nevus, 4 CMM cell lines, and one normal human epidermal melanocytes. Then overexpression of TUSC7 was performed and its role in tumor progression was explored. Results TUSC7 expression was significantly downregulated in primary CMM tissues (n=60) compared to benign nevi (n=20), which were significantly down-regulated in all the four melanoma cell lines, especially in A375 cells．compared with the normal melanocytes cells (allP<0.05). In comparison with the A375 cells transfected with the empty plasmid, those transfected with pcDNA-TUSC7 showed an obvious decrease in the proliferation and colony formation activity, while increase in the apoptosis rate (allP<0.05). Conclusion Our results suggested that the dysregulation of TUSC7 may play an important role in the CMM progression.

skin neoplasms; cutaneous malignant melanoma; long noncoding RNA; TUSC7; proliferation; apoptosis

福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院1整形外科、2病理科，泉州 362000

袁志明，男，主治醫(yī)師。E-mail: doctoryuan216@163.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.012.html

R 739.5

A

1001-7399(2017)04-0408-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.012

接受日期：2016-12-20