徐小艷，徐憲偉，王 慧，楊金花

肺腺癌中CD147、MMP-9和VEGF的表達(dá)及臨床意義

徐小艷1，徐憲偉1，王 慧2，楊金花1

目的 觀察肺腺癌中CD147、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)，并分析三者表達(dá)的相關(guān)性。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)90例肺腺癌、10例肺良性病變和10例相對(duì)正常肺組織中CD147、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)，用Imagepro Plus圖像分析軟件測(cè)試3種蛋白在肺腺癌中的陽性強(qiáng)度。結(jié)果 CD147、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的陽性單位(positive unit, PU)值在肺腺癌組織中均顯著高于相對(duì)正常肺組織和肺良性病變組織(P均<0.001)。在90例肺腺癌中，CD147、MMP-9和VEGF的陽性率分別為88.89%(80/90)、84.44%(76/90)、80%(72/90)。CD147、MMP-9和VEGF均分別與肺腺癌組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P均<0.001)，三者與肺腺癌患者年齡、吸煙史、大體類型均無關(guān)(P均>0.05)。CD147表達(dá)和MMP-9、VEGF表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(rp=0.992，rp=0.984，P均<0.001)。結(jié)論 CD147、MMP-9和VEGF可能在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，推測(cè)CD147刺激腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9和VEGF，進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，可以作為肺腺癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

肺腫瘤；腺癌；CD147；MMP-9；VEGF；相關(guān)性

肺腺癌發(fā)病率在肺癌中占有很大比例，肺腺癌組織病理形態(tài)多樣，其發(fā)病機(jī)制是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。CD147是免疫球蛋白超家族的一種跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤中均高表達(dá)，表達(dá)越高，腫瘤的侵襲性越強(qiáng)。由于CD147能夠刺激腫瘤周圍間質(zhì)的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)，而MMP能夠在降解腫瘤基膜和腫瘤間質(zhì)的過程中誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的產(chǎn)生，MMP-9和VEGF在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)90例肺腺癌中CD147、MMP-9和VEGF的表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，用定量測(cè)試法對(duì)三種蛋白進(jìn)行定量測(cè)試，并分析三者與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及三者的相關(guān)性，以期為肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集鄭州市人民醫(yī)院病理科2012年6月～2015年8月存檔的病理活檢標(biāo)本，包括90例肺腺癌原發(fā)灶；10例距腫物5 cm處相對(duì)正常成人肺組織；10例成人肺良性病變組織，包括2例結(jié)核、2例支氣管擴(kuò)張癥及6例肺大皰，標(biāo)本結(jié)果均經(jīng)病理科確診。按照(2015)WHO/國(guó)際肺癌研究聯(lián)合會(huì)肺癌組織病理分級(jí)分類法將肺腺癌組織按形態(tài)分為附壁為主型、腺腔為主型、乳頭為主型、實(shí)性為主伴黏液產(chǎn)生型、微乳頭為主型，本實(shí)驗(yàn)將附壁為主型視為高分化，腺腔為主型和乳頭為主型視為中分化，實(shí)性為主伴黏液產(chǎn)生型和微乳頭為主型視為低分化?；颊叩钠渌Y料均來自住院病歷，術(shù)前均未行化、放療。

1.2 免疫組化 CD147、MMP-9和VEGF一抗兔抗人單克隆抗體(即用型)、二抗及DAB均為福州邁新公司。免疫組化采用SP法，主要步驟如下：石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；抗原修復(fù)；一抗37 ℃孵育2 h；二抗37 ℃孵育20～30 min；DAB顯色5～10 min；脫水、透明和封片。用已知CD147、MMP-9和VEGF陽性的肺腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽性和空白對(duì)照。

1.3 免疫組化定量測(cè)試 用Imagepro Plus圖像分析軟件分別測(cè)試CD147、MMP-9和VEGF表達(dá)強(qiáng)度的陽性單位(positive unit, PU)[1]。具體步驟如下：(1)萊卡顯微鏡在40倍物鏡下進(jìn)行拍照；(2)將照片導(dǎo)入Imagepro Plus圖像分析軟件；(3)對(duì)于陰性切片從每個(gè)視野隨機(jī)選取1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，對(duì)陽性切片從每例切片中選取陽性細(xì)胞圖片輸入計(jì)算機(jī)，測(cè)試每個(gè)陽性細(xì)胞的灰度Gα，同時(shí)在相應(yīng)的視野中測(cè)試背景灰度Gβ；(4)按參考文獻(xiàn)[1]公式計(jì)算每張切片細(xì)胞的PU值。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)試軟件設(shè)定的Gmax為256。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用方差分析對(duì)多樣本均數(shù)之間進(jìn)行比較。組間多重比較，如方差不齊，采用DunnettT3檢驗(yàn)；如方差齊，采用LSD檢驗(yàn)。采用Spearman法進(jìn)行相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147、MMP-9、VEGF在肺腺癌、肺良性病變及相對(duì)正常肺組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示CD147在肺腺癌組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)，為粗細(xì)相對(duì)均勻的黃褐色顆粒，其在肺良性病變及相對(duì)正常肺組織中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)(圖1、2)。MMP-9(圖3)和VEGF(圖4)主要定位于肺腺癌細(xì)胞胞質(zhì)，兩者在肺腺癌間質(zhì)的纖維細(xì)胞中也有一定的表達(dá)，兩者在肺良性病變及正常肺組織中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)。90例肺腺癌中CD147、MMP-9和VEGF的陽性率分別為88.89%(80/90)、84.44%(76/90)和80%(72/90)。

①②③④

圖1 CD147在相對(duì)正常肺組織中幾乎不表達(dá)，SP法 圖2 CD147在肺腺癌中的表達(dá)，SP法 圖3 MMP-9在肺腺癌中的表達(dá)，SP法 圖4 VEGF在肺腺癌中的表達(dá)，SP法

2.2 CD147、MMP-9、VEGF在肺腺癌、肺良性病變及相對(duì)正常肺組織中的表達(dá) 肺腺癌組織中CD147、MMP-9和VEGF蛋白PU值均顯著高于相對(duì)正常肺組織和肺良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)；三種蛋白陽性強(qiáng)度在相對(duì)正常肺組織和肺良性病變組織中基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表1)。

表1 CD147、MMP-9和VEGF在相對(duì)正常肺組織、肺良性病變及肺腺癌中的PU值差異

2.3 CD147、MMP-9、VEGF與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系 CD147、MMP-9、VEGF在肺腺癌高分化組、中分化組和低分化組中的表達(dá)依次升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。CD147、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)在肺腺癌TNM分期Ⅲ+Ⅳ期比Ⅰ+Ⅱ高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)；CD147、MMP-9、VEGF蛋白的陽性強(qiáng)度在肺腺癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移原發(fā)灶中均高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。CD147、MMP-9、VEGF的PU值與肺腺癌患者性別、年齡、吸煙史及大體類型均無關(guān)(P均>0.05，表2)。

2.4 肺腺癌中CD147、MMP-9和VEGF表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示：90例肺腺癌中，CD147蛋白表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rp=0.992，P<0.001)，CD147和VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rp=0.984，P<0.001)。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]CD147在肝癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等來源于上皮性惡性腫瘤組織中高表達(dá)，在正常組織或胚胎性組織中幾乎不表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。MMP主要通過降解細(xì)胞外基質(zhì)這一作用在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，上述結(jié)論已在多種腫瘤如結(jié)直腸癌、腎癌、涎腺腺樣囊性癌等中得到證實(shí)[5-7]。腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移離不開新生毛細(xì)血管的形成。VEGF能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞分裂和毛細(xì)血管出芽生長(zhǎng)，為腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供相對(duì)有利的微環(huán)境[8]。

臨床病理參數(shù)nCD147P值MMP?9P值VEGFP值性別 男6213．11±4．740．82112．75±4．810．79612．64±4．770．919 女2813．38±5．2213．03±4．9012．75±4．71年齡(歲) ≥605412．75±4．210．29012．49±4．260．41712．39±4．210．481 <603613．86±5．7013．35±5．5613．10±5．43吸煙史 否3612．91±4．560．65412．79±4．620．94012．81±4．620．824 是5413．39±5．0912．87±4．9012．59±4．88大體類型 周圍性5813．13±4．460．85512．96±4．430．73912．93±4．360．502 中央型3213．32±5．6012．61±5．5012．22±5．36腫瘤直徑(cm) ≤34313．82±5．130．24913．46±4．900．24213．24±4．640．279 >34712．63±4．5912．27±4．7112．16±4．79分化程度 高309．57±2．339．32±2．269．18±2．34 中3912．24±2．85<0．00111．92±3．15<0．00111．81±3．10<0．001 低2120．15±3．1319．58±2．9719．29±2．70淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無5410．73±3．32<0．00110．42±3．24<0．00110．32±3．23<0．001 有3616．90±4．6916．46±4．5316．21±4．42TNM分期 Ⅰ+Ⅱ5010．20±2．63<0．0019．92±2．87<0．0019．87±2．93<0．001 Ⅲ+Ⅳ4016．94±4．4016．48±4．2416．19±4．17

CD147在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，主要是能夠刺激腫瘤間質(zhì)的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生MMP[9]。MMP在降解基膜和細(xì)胞間質(zhì)的過程中，在使內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)的同時(shí)，又釋放出一些血管生成分子如VEGF[10]，促進(jìn)新生血管形成，直接或間接刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)90例肺腺癌組織中CD147、MMP-9和VEGF的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CD147在相對(duì)正常肺組織和肺良性病變組織中幾乎不表達(dá)或低表達(dá)，而在肺腺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)越高，腫瘤分化越差，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，腫瘤分期越晚，對(duì)肺腺癌的病理診斷有一定的價(jià)值。MMP-9和VEGF的表達(dá)也出現(xiàn)了相似的結(jié)果。相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺腺癌中CD147表達(dá)越高，MMP-9和VEGF表達(dá)也越高，CD147蛋白表達(dá)分別與MMP-9和VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示在肺腺癌組織學(xué)水平，CD147的高表達(dá)可能促進(jìn)MMP-9和VEGF的高表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。以往研究顯示[4]，在肺腺癌A549細(xì)胞水平，CD147 mRNA的表達(dá)分別與MMP-9、VEGF的mRNA呈正相關(guān)，但是三者在組織學(xué)蛋白水平的表達(dá)文獻(xiàn)甚少報(bào)道。

目前，人們對(duì)于CD147調(diào)控MMPs和VEGF機(jī)制的研究也很多，觀點(diǎn)也不一。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]SiRNA下調(diào)CD147的表達(dá)能夠阻止MMP-2、actin和FAK的表達(dá)，這一過程可能通過ERK1/2通路。有研究認(rèn)為CD147可能通過如MAPK、PKC、PKA等信號(hào)干擾細(xì)胞內(nèi)NO/cGMP調(diào)節(jié)的Ca2+發(fā)揮其活化和表達(dá)MMPs[12]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。另外有研究發(fā)現(xiàn)CD147還可直接促進(jìn)腫瘤本身VEGF或間接通過MMPs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和周圍基質(zhì)細(xì)胞中VEGF表達(dá)增高，從而促進(jìn)血管新生[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)CD147可能通過核因子κB受體活化因子配體激動(dòng)劑對(duì)MMP-9和VEGF進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。

綜上所述，CD147蛋白在肺腺癌組織中高表達(dá)，在相對(duì)正常肺組織和肺良性病變組織中幾乎不表達(dá)，其高表達(dá)可能提示腫瘤惡性增殖、分化差、淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移和較高的臨床分期，CD147表達(dá)與MMP-9和VEGF表達(dá)呈顯著相關(guān)，推測(cè)CD147的高表達(dá)促進(jìn)了MMP-9和VEGF的高表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。CD147蛋白在肺腺癌中調(diào)控MMP-9和VEGF的具體機(jī)制可作為后續(xù)的研究。

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Quantitative expression of CD147, MMP-9 and VEGF in lung adenocarcinoma and their clinical significance

XU Xiao-yan1, XU Xian-wei1, WANG Hui2, YANG Jin-hua1
(1DepartmentofPathology,2AcademyofSciencesExpertWorkstation,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China)

Purpose To investigate the expression of CD147, MMP-9 and VEGF and their relationships in lung adenocarcinoma. Methods The expression of CD147, MMP-9 and VEGF proteins was examined in 90 lung adenocarcinoma tissues by SP immunohistochemical method. The positive unit (PU) of CD147, MMP-9 and VEGF was assessed quantitatively using Imagepro Plus image analysis software. Results Positive intensity of CD147, MMP-9 and VEGF in lung adenocarcinoma was significantly higher than that in non-neoplastic internal controls and benign control tissues (P<0.001). The positive rates of CD147, MMP-9 and VEGF were 88.89% (80/90), 84.44% (76/90), and 80% (72/90), respectively. The expression of CD147, MMP-9 and VEGF was positively correlated with the degree of histologic differentiation，lymph node metastasis status and TNM stage (P<0.001). CD147 was correlated positively with MMP-9 and VEGF expression (rp=0.992,rp=0.984,P<0.001). Conclusion CD147, MMP-9 and VEGF may play an important role in the pathogenesis and progression of lung adenocarcinoma; CD147 may induce tumor invasion and metastasis by stimulating production of MMP-9 and VEGF, which is expected to be a potential promising target for immunotherapy.

lung neoplasms; adenocarcinoma; CD147; MMP-9;VEGF; correlation

鄭州市普通科技攻關(guān)計(jì)劃(20150076)

鄭州人民醫(yī)院1病理科、2院士工作站，鄭州 450000

徐小艷，女，碩士，主治醫(yī)師。Tel: (0371)67077128， E-mail: xxy123com@sina.com 楊金花，女，主任醫(yī)師，通訊作者。Tel: (0371)67077350，E-mail: jinhuay65@sina.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.007.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)04-0384-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.007

接受日期：2017-01-10