王 珊，董麗儒，劉愛東，熊艷杰，任會強，宋旭東

EGFR及KRAS基因突變與非小細胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

王 珊，董麗儒，劉愛東，熊艷杰，任會強，宋旭東

目的 探討非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者EGFR及KRAS基因突變與其臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用毛細管電泳法及熒光探針法分別檢測64例NSCLC組織中EGFR及KRAS基因的突變類型。結(jié)果 64例NSCLC中發(fā)生EGFR基因突變27例(占42.2%)、KRAS基因突變8例(占12.5%)，同時發(fā)生EGFR和KRAS基因突變者4例(占6.25%)。EGFR基因突變與患者性別、組織學類型及吸煙史有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(P>0.05)。肺腺癌中KRAS基因突變率明顯高于肺鱗癌(P<0.01)，KRAS基因突變與患者性別、年齡、有無吸煙史、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 NSCLC患者中EGFR基因突變率高于KRAS基因突變率，EGFR突變率在女性、肺腺癌、不吸煙患者中較高，KRAS基因突變率在腺癌患者中較高，且EGFR和KRAS基因突變可以同時發(fā)生。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；EGFR；KRAS；基因突變

肺癌是影響人類生存的重大疾病之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%。目前，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)及鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)已經(jīng)明確為NSCLC發(fā)生的驅(qū)動基因[1]。本文通過檢測64例NSCLC中EGFR及KRAS基因狀態(tài)，分析兩者的突變率及其與臨床病理特征的相關(guān)性，為臨床研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集河北省唐山市人民醫(yī)院2015年9月到2016年2月及華北理工大學附屬醫(yī)院2012年1月～2016年6月期間經(jīng)組織學證實的NSCLC石蠟標本共64例。所有病例臨床病理資料完整，且患者術(shù)前均未行化、放療。其中肺腺癌38例，肺鱗癌26例，年齡41～81歲，中位年齡61歲。

1.2 主要試劑 石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(北京天根生化公司)、EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR-毛細管電泳法)、KRAS基因突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)均購自北京鑫諾美迪基因檢測公司。

1.3 主要儀器 BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR基因擴增儀、ABI 3100測序儀。

1.4 方法

1.4.1 樣本準備 選擇富含腫瘤細胞的石蠟包埋NSCLC組織，每例標本連續(xù)切5張(每張10 μm)白片，不漂洗脫蠟，直接封存于1.5 mL EP管中。

1.4.2 樣本處理和核酸提取 按說明書采用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取樣本DNA。

1.4.3 檢測方法 采用PCR-熒光探針法檢測KRAS基因狀態(tài)，采用毛細管電泳法檢測EGFR突變情況，兩者擴增引物序列詳見表1。PCR反應(yīng)條件：預變性95 ℃ 3 min，1個循環(huán)，變性94 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 45 s，共45個循環(huán)。

1.4.4 結(jié)果分析 通過Bio-Rad CFX Manager分析KRAS基因突變結(jié)果，通過Bio-Edit軟件對EGFR測序結(jié)果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，基因突變狀態(tài)與臨床病理特征分析采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變 64例NSCLC中發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變共27例(圖1)，突變率為42.2%。涉及單位點突變23例，占85.2%(23/27)，包括19號外顯子突變12例，21號外顯子突變7例，18號及20號外顯子突變各2例。其余4例為雙位點突變，占14.8%(4/27)，其中2例為20與21號外顯子突變，1例為18與20號外顯子突變，1例為19與20號外顯子突變，占突變總數(shù)的14.8%(表2)。統(tǒng)計分析顯示，19號外顯子的突變率(20.3%)明顯高于18號外顯子的突變率(4.7%)(P<0.01)，其余位點突變率之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。此外，在NSCLC患者中，女性患者的EGFR基因突變率高于男性(P<0.05)，肺腺癌及無吸煙史患者的突變率顯著高于肺鱗癌及有吸煙史的患者(P<0.01)，而EGFR基因突變與患者年齡、腺癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(P>0.05，表4)。

表1 EGFR及KRAS擴增引物序列

2.2 KRAS基因突變 64例NSCLC中KRAS基因突變共8例(圖2)，突變率為12.5%，且均為第2外顯子的12號密碼子突變(表2)。統(tǒng)計分析顯示肺腺癌患者的突變率明顯高于肺鱗癌患者(P<0.01)，而KRAS基因突變與患者性別、年齡、吸煙史、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)(P>0.05，表4)。此外，本組實驗結(jié)果顯示有4例肺腺癌患者同時存在EGFR基因突變和KRAS基因突變，其中EGFR均為單位點突變，1例18號外顯子點突變，3例為19號外顯子缺失突變(表2)。

3 討論

人EGFR基因位于第7號染色體p13-q22區(qū)，由28個外顯子構(gòu)成，編碼1 186個氨基酸。EGFR蛋白由三部分構(gòu)成，分別為與配體結(jié)合的胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)。細胞表面的EGFR與其配體結(jié)合可以激活其細胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)，從而產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞增殖[2]。有研究證明，NSCLC EGFR基因突變可以持續(xù)活化EGFR酪氨酸激酶，促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡[3]。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)可以競爭結(jié)合EGFR的胞內(nèi)部分，直接抑制EGFR酪氨酸激酶，從而阻斷EGFR的信號傳導，導致腫瘤細胞生長停滯[4]。目前，EGFR-TKI藥物(如吉非替尼和厄洛替尼)已經(jīng)成為臨床治療NSCLC的重要手段。

表2 非小細胞肺癌EGFR、KRAS基因突變類型

表3 64例非小細胞肺癌 EGFR基因突變位點的比較

與EGFR 19號外顯子突變率相比，*P<0.01

表4 64例非小細胞肺癌中EGFR、KRAS基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 非小細胞肺癌中EGFR突變測序結(jié)果

A.18號外顯子點突變2156G>C；B.19號外顯子缺失突變2235_2249 del 15；C.20號外顯子點突變2369 C>T；D.20號外顯子插入突變2307_2308 ins 9；E.21號外顯子點突變2573 T>G；F.21號外顯子點突變2582T>A

圖2 非小細胞肺癌中KRAS基因突變PCR結(jié)果 A.GGT>TGT；B.GGT>AGT；C.GGT>GTT；D.GGT>GAT

EGFR突變中最多見的為19號外顯子缺失和21號外顯子突變，約占突變總數(shù)的86%，19號外顯子缺失由于突變位點及缺失堿基長度不同使得突變類型較多[5]。本組64例NSCLC中EGFR基因突變率為42.2%，其中19號外顯子缺失突變與21號外顯子的突變率較高，且19號外顯子的突變率明顯高于18號外顯子。這與上述文獻結(jié)果相近。欒煥玲等[6]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)女性NSCLC患者EGFR基因突變率高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，無吸煙史者高于有吸煙史者。與Paez等[7]的研究結(jié)論一致。本組實驗結(jié)果顯示，NSCLC患者中女性、肺腺癌及無吸煙史患者的EGFR突變率分別高于男性、肺鱗癌及有吸煙史患者，這與國內(nèi)外學者的研究結(jié)果一致。通過探討EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系，有助于篩選EGFR基因檢測的人群，為臨床提供參考依據(jù)。

KRAS蛋白相對分子質(zhì)量為2.1×104，故也被稱為p21蛋白。KRAS蛋白位于細胞膜內(nèi)面，具有內(nèi)在GTP酶活性，KRAS蛋白通過與GTP結(jié)合后被活化，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖。KRAS基因突變后其編碼的p21蛋白活性降低，失去內(nèi)在GTP酶活性，從而使得信號傳導一直處于激活狀態(tài)，持續(xù)刺激細胞生長、發(fā)育、增殖，引起細胞惡變[8]。

KRAS基因突變率在人種之間存在差異，西方NSCLC人群中KRAS突變率較高，在肺腺癌中達30%。亞洲NSCLC人群的突變率為4%～24%[9]。KRAS基因突變主要發(fā)生于第2外顯子的12及13號密碼子上，其中12號密碼子的突變率(92%)顯著高于13號密碼子突變率(8%)[10]。本組實驗結(jié)果顯示，NSCLC中KRAS基因突變率為12.5%，均發(fā)生在12號密碼子，與上述文獻結(jié)果相符。目前對KRAS基因突變與臨床病理特征關(guān)系的相關(guān)研究結(jié)果各異。Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的KRAS基因突變檢出率男性多于女性，肺腺癌多于其它類型的肺癌，有吸煙史者多于無吸煙史者。而張陽等[12]的研究結(jié)果顯示KRAS基因的突變在性別之間差異并無統(tǒng)計學意義，也未發(fā)現(xiàn)KRAS突變與病理類型、吸煙情況以及分化程度存在相關(guān)性。本組實驗結(jié)果顯示，肺腺癌患者的突變率要明顯高于肺鱗癌患者，而與患者性別、年齡、有無吸煙史、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無關(guān)。該結(jié)果與文獻報道不完全一致，這種差異可能與KRAS突變率較低所導致的抽樣誤差有關(guān)。

KRAS通路是EGFR活化下游效應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導通路之一。突變型KRAS無需接受EGFR信號即可自動活化該通路并啟動下游信號的轉(zhuǎn)導，使得NSCLC進展更迅速，并且使KRAS突變患者對分子靶向藥物EGFR-TKI發(fā)生原發(fā)耐藥[13]。目前，NSCLC患者EGFR突變與KRAS突變被廣泛認為是相互獨立的[14]，但本組檢出4例肺腺癌患者同時存在EGFR和KRAS基因突變。以上結(jié)果提示在同一NSCLC患者中可以同時發(fā)生EGFR和KRAS基因突變。有學者研究了6例EGFR-KRAS共突變患者，他們認為存在共突變的腫瘤細胞中，EGFR基因突變在其肺癌的發(fā)生中起到主導作用[15]。由于共同突變的發(fā)生率較低，研究病例有限，其生物學意義仍需更多臨床資料的積累。

[1] 張 丹, 黃 艷, 王紅陽. 非小細胞肺癌驅(qū)動基因突變及靶向治療的研究進展[J]. 中國肺癌雜志, 2014,17(10):750-754.

[2] 吳健虹, 謝秋玲, 陳小佳, 洪 岸. 表皮生長因子受體EGFR及其信號傳導[J]. 生命科學, 2006,18(2):116-122.

[3] Lynch T J, Bell D W, Sordella R,etal. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med, 2004,350(21):2129-2139.

[4] 王 芬, 王 潔, 白 樺, 等. 晚期非小細胞肺癌EGFR蛋白磷酸化、基因突變與EGFR-TKI療效相關(guān)性的研究[J]. 中國癌癥雜志, 2014,4(9):657-668.

[5] 凌 云, 邱 田, 李 卓, 等. 非小細胞肺癌中EGFR和KRAS基因突變的特點及與臨床病理特征的關(guān)系[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(5):536-541.

[6] 欒煥玲, 孫蕾娜, 董 娜, 等. 非小細胞肺癌中EGFR和KRAS基因突變與蛋白表達相關(guān)性的研究[J]. 中國癌癥雜志, 2010,20(7):486-491.

[7] Paez J G, Janne P A, Lee J C,etal. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004,304(5676):1497-1500.

[8] Bos J L. Ras oncogenes in human cancer: a review[J]. Cancer Res, 1989,49(17):1352.

[9] 羅 煒, 王 慧, 徐韞健. 非小細胞肺癌患者KRAS基因突變情況分析[J]. 廣東醫(yī)學, 2014,13(35):2025-2028.

[10] Yu H A, Sima C S, Shen R,etal. Prognostic impact of KRAS mutation subtypes in 677 patients with metastatic lung adenocarcinomas[J]. J Thorac Oncol, 2015,10(3):431-437.

[11] Xu J, He J, Yang H,etal. Somatic mutation analysis of EGFR, KRAS, BRAF and PIK3CA in 861 patients with non-small cell lung cancer[J]. Cancer Biomark, 2011,10(2): 63-69.

[12] 張 陽, 潘振奎, 張 星, 等. 非小細胞肺癌患者KRAS基因突變的研究[J]. 中國肺癌雜志, 2010,13(6):602-606.

[13] Timar J, Hegedus B, Raso E. KRAS mutation testing of colorectal cancer for anti-EGFR therapy: dogmas versus evidence[J]. Current Cancer Drug, 2010,10(8):813-823.

[14] 王 瓊, 呂亞莉,鐘 梅, 等. 非小細胞肺癌中EGFR和KRAS基因突變檢測分析與病理特征的關(guān)系[J]. 診斷病理學雜志, 2012,19(2):144-147.

[15] Lee L, Lee B, Choi Y L,etal. Non-small cell lung cancer with concomitant EGFR, KRAS, and ALK mutation: clinicopathologic features of 12 cases[J]. J Pathol Transl Med, 2016,50(3):197-203.

Relation of EGFR and KRAS gene mutations with its pathological characteristics in non-small cell lung cancer

WANG Shan, DONG Li-ru, LIU Ai-dong, XIONG Yan-jie, REN Hui-qiang, SONG Xu-dong
(DepartmentofPathology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China)

Purpose To investigate the relation of EGFR and KRAS gene mutations with the pathological characteristics in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The EGFR and KRAS gene mutations were detected and analyzed in 64 patients with NSCLC by capillary electrophoresis and fluorescent probe method. Results In 64 cases, the EGFR gene mutations were detected in 27 patients (42.2%); the KRAS gene mutations in 8 patients (12.5%). The EGFR and KRAS mutations synchronized in 4 patients (6.25%). The mutations rate of EGFR was related to gender, histology type and smoking condition (P<0.05). There was no association between mutation of EGFR gene with the age, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). The mutations rate of KRAS gene was higher in adenocarcinoma patients than that in squamous carcinoma (P<0.01). There was no relationship between mutation of KRAS gene with the gender, age, smoking condition, differentiation, lymph node metastasis and TNM stages (P>0.05). Conclusion In NSCLC, EGFR gene mutations rate is higher than KRAS gene mutation. The mutation rate of EGFR gene is higher in female, adenocarcinoma and never smokers; the mutations rate of KRAS mutations is higher in patients with adenocarcinoma. The mutations in EGFR and KRAS can exist at the same time.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; EGFR; KRAS; gene mutations

河北省臨床醫(yī)學優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究項目(361036)

華北理工大學附屬醫(yī)院病理科，唐山 063000

王 珊，女，碩士研究生。E-mail: 496874845@qq.com 宋旭東，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，通訊作者。E-mail: songxd2002@sina.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.006.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)04-0379-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.006

接受日期：2017-02-20