宋 倫， 吳 景， 宋永剛， 劉衛(wèi)東， 楊國(guó)軍

1．遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院， 遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116023 2．大連海洋大學(xué)， 遼寧 大連 116023

褐潮致災(zāi)種抑食金球藻在遼東灣的分布

宋 倫1， 吳 景1， 宋永剛1， 劉衛(wèi)東1， 楊國(guó)軍2

1．遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院， 遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116023 2．大連海洋大學(xué)， 遼寧 大連 116023

抑食金球藻可產(chǎn)生一種抑制雙殼類動(dòng)物攝食的胞外多糖，導(dǎo)致貝類大量死亡．由于抑食金球藻個(gè)體微小、形態(tài)學(xué)鑒定困難，故在遼東灣海域鮮見(jiàn)其分布報(bào)道，而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了微型微微型浮游植物的鑒定研究．以18S rDNA V4區(qū)作為目標(biāo)基因，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，設(shè)計(jì)了微型微微型浮游植物鑒定引物V4(FR)，并對(duì)遼東灣2014年四季海水中微型和微微型浮游植物多樣性進(jìn)行了檢測(cè)．結(jié)果表明，遼東灣抑食金球藻春季密度(7．743×103L-1)最高，夏季(2．094×103L-1)、秋季(0．392×103L-1)、冬季(0．053×103L-1)密度逐漸下降，水溫是影響該藻暴發(fā)的主要因素，也驗(yàn)證了渤海褐潮多暴發(fā)在春季的原因．抑食金球藻密度高值區(qū)主要分布在與河北秦皇島交界的綏中海域，該地區(qū)與實(shí)際暴發(fā)褐潮海域相鄰，驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性．春季抑食金球藻在西南海域優(yōu)勢(shì)度(平均40%)最高，其密度最高達(dá)78．128×103L-1，雖未達(dá)到警戒標(biāo)準(zhǔn)，但分布擴(kuò)散較廣，致災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)引起足夠的重視．

抑食金球藻； 褐潮； 微微型浮游植物； 高通量測(cè)序； 遼東灣

褐潮作為我國(guó)新型海洋生態(tài)災(zāi)害，2009年起開(kāi)始入侵渤海，我國(guó)也是繼美國(guó)和南非之后，第三個(gè)暴發(fā)褐潮的國(guó)家，其中河北秦皇島海域貝類養(yǎng)殖受災(zāi)最為嚴(yán)重[1- 2]．渤海褐潮致災(zāi)種主要為抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)，屬棕鞭藻門(原歸類金藻門)、海金藻綱，球形或橢球形、金褐色、無(wú)細(xì)胞壁、單個(gè)葉綠體、細(xì)胞無(wú)鞭毛、不能運(yùn)動(dòng)且生命周期簡(jiǎn)單[3]．由于其個(gè)體微小(2～3 μm)，依據(jù)形態(tài)學(xué)等常規(guī)鑒定較為困難．隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，微型藻類的分子檢測(cè)手段也在不斷進(jìn)步和完善[4- 9]，相關(guān)的基因文庫(kù)也在逐步更新和擴(kuò)充．近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了微型藻類的高效檢測(cè)研究[10- 11]，該技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、測(cè)序通量高、錯(cuò)誤率低和成本低等特點(diǎn)，為微型藻類的高效檢測(cè)提供了新思路[12]．核糖體小亞基基因18S rDNA存在于所有真核生物中，是同時(shí)具有信息和功能兩種作用的核糖體編碼基因[13]，其數(shù)據(jù)庫(kù)豐富、基因序列種類廣泛，對(duì)引物設(shè)計(jì)、構(gòu)建物種親緣關(guān)系等方面都具有不可替代的優(yōu)勢(shì)．18S rDNA由保守區(qū)和可變區(qū)交替排列組成，具有9個(gè)可變區(qū)[14]，可作為種屬鑒定的分子標(biāo)記．V4區(qū)和V9區(qū)是目前廣泛應(yīng)用于真核生物多樣性研究的目標(biāo)基因[8，15- 16]．

抑食金球藻褐潮1985年首次發(fā)生在美國(guó)東北部的納拉干塞特灣、大南灣、長(zhǎng)島灣以及巴尼加特灣，此后一直到1995年，幾乎每年長(zhǎng)島灣都有褐潮發(fā)生，2000年后，褐潮沿著美國(guó)東海岸向南擴(kuò)張到新澤西州、特拉華州、馬里蘭州以及弗吉尼亞州的海灣．除此之外，1997年南非的薩爾達(dá)尼亞灣也開(kāi)始暴發(fā)了褐潮，文獻(xiàn)記錄持續(xù)到2005年[17]．我國(guó)在2009年渤海暴發(fā)褐潮之前鮮有該種的報(bào)道[18]，該種褐潮一直持續(xù)到2015年，最大面積達(dá)3 400 km2，分布于遼東灣西南側(cè)的河北和遼寧交界海域，褐潮期間養(yǎng)殖貝類滯長(zhǎng)、部分死亡，生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，旅游業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大[12]．遼東灣為我國(guó)最北端半封閉內(nèi)海，航運(yùn)較為頻繁，加之富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，發(fā)生外來(lái)有害微藻入侵的風(fēng)險(xiǎn)較高，危害較大，目前該海域已發(fā)現(xiàn)外來(lái)有害微藻抑食金球藻的擴(kuò)散跡象，因此亟需了解其生態(tài)分布狀況．鑒于此該研究采用高通量測(cè)序平臺(tái)，結(jié)合生物信息學(xué)方法，以18S rDNA的V4區(qū)為目標(biāo)基因?qū)|東灣海域的微型和微微型浮游植物進(jìn)行多樣性檢測(cè)，以期為外來(lái)海洋微藻研究提供參考．

1 材料與方法

1．1 樣品采集

為了解褐潮致災(zāi)種抑食金球藻的分布及擴(kuò)散情況，在遼東灣海域網(wǎng)格化設(shè)置16個(gè)站位(見(jiàn)圖1)，分別于2014年5月(春季)、8月(夏季)、10月(秋季)、12月(冬季)采集表層海水1 L，首先經(jīng)20 μm微孔濾膜過(guò)濾去除小型及大型浮游生物，然后經(jīng)0．22 μm微孔濾膜收集微型和微微型浮游生物，最后將濾膜轉(zhuǎn)移至1．5 mL無(wú)菌離心管中，置于-20 ℃或-80 ℃冷凍保存、運(yùn)輸．

圖1 采樣站位分布Fig．1 Sampling station locations

1．2 分析方法

1．2．1 基因組 DNA 的提取

1．2．2 18S rDNA可變區(qū)V4的PCR擴(kuò)增

1．2．3 引物篩選優(yōu)化

于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取相關(guān)序列，其中包括微微型真核藻類45種、我國(guó)近岸赤潮生物71種及常見(jiàn)真核藻類73種，涵蓋8個(gè)門、18個(gè)綱、179條序列．利用MEGA 4軟件對(duì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，找到對(duì)應(yīng)的V4區(qū)，同時(shí)結(jié)合Hiseq 2500 PE250測(cè)序技術(shù)要求進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，片段長(zhǎng)度為300～450 bp，為增加測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，充分利用測(cè)序技術(shù)，以V4區(qū)為核心區(qū)及兩側(cè)的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，獲得兩對(duì)引物V4(FR)，使用FPCR軟件檢測(cè)引物的熔解溫度、GC含量，以及是否會(huì)產(chǎn)生二聚體，利用Oligo Calc軟件檢測(cè)引物自身的互補(bǔ)性，包括潛在的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、3′端的互補(bǔ)性、自身退火位點(diǎn)個(gè)數(shù)等基本參數(shù)．根據(jù)核糖體基因數(shù)據(jù)庫(kù)采用在線軟件Taxman，以多來(lái)源的rDNA為模板，通過(guò)多序列全局比對(duì)，對(duì)引物擴(kuò)增的生物類群和未擴(kuò)增的生物類群物種數(shù)量進(jìn)行預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)、比較，進(jìn)而對(duì)3對(duì)引物的敏感性、特異性進(jìn)行評(píng)估[19]．

1．2．4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，參照Qiime軟件質(zhì)量控制流程將拼接后的序列經(jīng)過(guò)截取、過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)．利用Uparse軟件對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類，采用RDP Classifier方法與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，同時(shí)對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析．鏡檢同期水樣中出現(xiàn)的所有浮游植物，篩選各站位出現(xiàn)頻度最高的角毛藻(Chaetocerossp．)作為基準(zhǔn)種類[20]，通過(guò)OTUs比例計(jì)算抑食金球藻密度，相關(guān)公式：

式中：NS為某站位抑食金球藻密度，L-1；NC為同一站位水樣中所有角毛藻密度，由鏡檢獲得，L-1；COTU為某站位水樣中所有角毛藻的OTUs數(shù)；SOTU為某站位抑食金球藻的OTUs數(shù)．

采用相對(duì)多度(RA)計(jì)算抑食金球藻密度在各季節(jié)的比例：

RA=niN

式中：ni為抑食金球藻在i站的密度，L-1；N為統(tǒng)計(jì)單元的總密度，L-1．

物種優(yōu)勢(shì)度(Y)表示微型微微型浮游植物群落中某一物種所占的優(yōu)勢(shì)程度：

式中，nx為第x種微型微微型浮游植物種類的OTUs數(shù)，N為OTUs總數(shù)，fx為第x種微型微微型浮游植物種類在各樣品中出現(xiàn)的頻率．

2 結(jié)果與討論

2．1 分子鑒定引物優(yōu)化

采用在線軟件Taxman對(duì)3對(duì)引物的敏感性、特異性進(jìn)行評(píng)估，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(見(jiàn)表1)顯示，引物V9(FR)的整體擴(kuò)增效率低于引物V4(FR)和C4(FR)，引物V4(FR)對(duì)真菌、后生動(dòng)物、領(lǐng)鞭毛蟲(chóng)目類群的擴(kuò)增特異性低于C4(FR)，對(duì)定鞭藻綱、綠藻門等生物類群的擴(kuò)增特異性高于C4(FR)，說(shuō)明V4(FR)在擴(kuò)增真核藻類類群中較有優(yōu)勢(shì)．

為了比較3對(duì)引物在實(shí)際樣品中對(duì)真核藻類擴(kuò)增特異性的差異，對(duì)2014年5—8月采集的8、11、12號(hào)站位環(huán)境樣品分別進(jìn)行引物擴(kuò)增，采用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)PE250測(cè)序，解析出在種的水平下每對(duì)引物對(duì)應(yīng)的平均微型微微型浮游植物OTUs數(shù)．結(jié)果顯示，3對(duì)引物在8、11、12號(hào)站位鑒定的微型微微型浮游植物OTUs數(shù)按序分別為：V4(68、73、92)、V9(37、46、44)、C4(33、59、81)，平均為78、42、58，引物V4(FR)鑒定出的浮游植物數(shù)量多于V9(FR)和C4(FR)．通過(guò)3對(duì)引物對(duì)優(yōu)勢(shì)種Dolichomastixtenuilepis、細(xì)小微胞藻(Micromonaspusilla)、金牛微球藻(Ostreococcustauri)、密球藻(Pycnococcusprovasolii)、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)、赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)等微型和微微型浮游植物的鑒定能力比較，顯示引物V4(FR)與C4(FR)相近，二者的鑒定效率強(qiáng)于V9(FR)．綜上，引物V4(FR)在微型微微型浮游植物種類數(shù)鑒定方面優(yōu)于其他兩對(duì)引物，故采用引物V4(FR)研究遼東灣海域微型微微型浮游植物的群落多樣性．

表1 引物對(duì)擴(kuò)增SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中真核生物類群的特異性統(tǒng)計(jì)

注：引物對(duì)主要擴(kuò)增真核類群的頻數(shù)分布，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示擴(kuò)增該類群的序列數(shù)，括號(hào)外的數(shù)字表示擴(kuò)增序列數(shù)占該類群序列數(shù)的比例．

2．2 抑食金球藻的種屬確定

高通量測(cè)序獲得抑食金球藻部分18S rDNA序列的片段長(zhǎng)度為380 bp，通過(guò)NCBI Blast比對(duì)，其在抑食金球藻18S rDNA(KT585674．1)基因序列中對(duì)應(yīng)的位置為563～942 bp，與基因庫(kù)中抑食金球藻的部分18S rDNA序列相似度為100%，擬合度期望值(E-value)為0．采用鄰接法選擇棕鞭藻門中部分藻類的18S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)．建樹(shù)結(jié)果顯示，高通量測(cè)序獲得的遼東灣抑食金球藻18S rDNA V4區(qū)序列與基因庫(kù)中抑食金球藻(KT585674．1)聚在一個(gè)分支，其支持率為100%，確定該種為抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)．

注： 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示鄰接法的可靠性.圖2 抑食金球藻系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig．2 Aureococcus anophagefferens phylogenetic tree

2．3 藻密度平面分布

遼東灣春季檢出抑食金球藻密度最高，分布在0．001×103～78．128×103L-1之間，平均值為7．743×103L-1，最高值出現(xiàn)在10號(hào)站位，最低值出現(xiàn)在4號(hào)站位，高值區(qū)主要分布在遼東灣的西南、中部、東南海域(3、5、6、8、10、11、13、14、15、16號(hào)站位密度均超過(guò)103L-1，其中10、11、16號(hào)站位密度均超過(guò)104L-1)，遼東灣西北部海域密度相對(duì)較??；夏季密度分布在0．000 2×103～15．609×103L-1之間，平均值為2．094×103L-1，最高值出現(xiàn)在16號(hào)站位，最低值出現(xiàn)在9號(hào)站位，高值區(qū)主要分布在遼東灣的東南、西南兩側(cè)海域(10、16號(hào)站位密度均超過(guò)104L-1)，遼東灣北部海域密度相對(duì)較??；秋季密度分布在0．001×103～2．293×103L-1之間，平均值為0．392×103L-1，最高值出現(xiàn)在9號(hào)站位，最低值出現(xiàn)在1號(hào)站位，高值區(qū)主要分布在遼東灣的西南、中東兩側(cè)海域(9、10號(hào)站位密度均超過(guò)2×103L-1)，其他區(qū)域密度相對(duì)較??；冬季密度分布在0．000 1×103～0．345×103L-1之間，平均值為0．053×103L-1，最高值出現(xiàn)在4號(hào)站位，最低值出現(xiàn)在6號(hào)站位，高值區(qū)主要分布在遼東灣的中南部海域，冬季密度相對(duì)較小，各站位差異不大，分布較為均勻．各站位抑食金球藻密度占比的季節(jié)分布見(jiàn)圖3．

2．4 相對(duì)密度季節(jié)變化

統(tǒng)計(jì)各站位抑食金球藻季節(jié)相對(duì)密度(見(jiàn)圖4)發(fā)現(xiàn)，春季占比最高(平均61．4%)，夏季次之(平均19．3%)，依次為秋季(平均13．1%)，冬季最少(平均6．2%)．說(shuō)明春季為抑食金球藻主要繁殖季節(jié)，水溫為主要控制因素．

注： 圖中等值線表示抑食金球藻密度占比， %．圖3 抑食金球藻密度占比的季節(jié)分布Fig．3 The horizontal distribution of Aureococcus anophagefferens density ratio in different seasons

圖4 抑食金球藻季節(jié)相對(duì)密度分布Fig．4 Relative density of Aureococcus anophagefferens in different seasons

2．5 優(yōu)勢(shì)度

春季抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度在0．004%～62．70%之間，平均值為7．92%，主要在遼東灣西南部占優(yōu)勢(shì)，各站位間極差較大，優(yōu)勢(shì)度最高值出現(xiàn)在11號(hào)站位，其次為10號(hào)站位(33．20%)、14號(hào)站位(25．20%)，上述3個(gè)站位抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度非常明顯，除4號(hào)站位外，其余站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)0．2%，其中5、9、10、11、14號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)1%；夏季抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度在0．003%～0．96%之間，平均值為0．26%，主要在遼東灣中南部占優(yōu)勢(shì)，各站位優(yōu)勢(shì)度不明顯，優(yōu)勢(shì)度最高值出現(xiàn)在14號(hào)站位，最低為4號(hào)站位，其中10、11、12、14、15、16號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)0．2%，所有站位優(yōu)勢(shì)度均未超過(guò)1%；秋季抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度在0．002%～1．98%之間，平均值為0．55%，主要在遼東灣中西、中東、東南部海域占優(yōu)勢(shì)，各站位優(yōu)勢(shì)度不明顯，優(yōu)勢(shì)度最高值出現(xiàn)在9號(hào)站位，最低為4號(hào)站位，其中7、9、10、11、12、14、15、16號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)0．2%，7、9、12、15號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)1%；冬季抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度在0．008%～1．05%之間，平均值為0．28%，主要在遼東灣中東、中南部占優(yōu)勢(shì)，各站位間極差較大，優(yōu)勢(shì)度最高值出現(xiàn)在11號(hào)站位，最低為1號(hào)站位，其中8、9、11、12、14、15號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度均超過(guò)0．2%，僅11號(hào)站位優(yōu)勢(shì)度超過(guò)1%(見(jiàn)圖5、6)．

圖5 抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度季節(jié)分布Fig．5 Aureococcus anophagefferens dominance in different seasons

2.6 討論

在選定18S rDNA為鑒定真核藻類目標(biāo)基因后，為了驗(yàn)證V4區(qū)和V9區(qū)對(duì)海水環(huán)境樣本中微量真核藻類的高效檢測(cè)能力，自行設(shè)計(jì)了引物V4(FR)，并選擇引物C4(FR)和V9(FR)作為分析比較對(duì)象．3對(duì)引物的敏感性、特異性評(píng)估結(jié)果顯示，V4(FR)對(duì)真核藻類的擴(kuò)增特異性優(yōu)于C4(FR)，尤其對(duì)甲藻、硅藻、綠藻、隱藻、定鞭藻等類群的擴(kuò)增效率更為高效．18S rDNA的V4區(qū)變異較大、長(zhǎng)度較長(zhǎng)、均一性好，適用于高通量測(cè)序技術(shù)，是真核藻類鑒定的良好目標(biāo)基因．隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序通量不斷增大，測(cè)序片段長(zhǎng)度也可逐漸增長(zhǎng)，物種注釋的準(zhǔn)確度也會(huì)逐漸提升．18S rDNA V4區(qū)片段長(zhǎng)度高于V9區(qū)，并且其測(cè)序結(jié)果更接近18S rDNA的全長(zhǎng)序列[21]，因此利用18S rDNA V4區(qū)作為目標(biāo)基因，通過(guò)宏基因組的高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)鑒定真核藻類更為準(zhǔn)確和高效．引物篩選結(jié)果顯示，該研究自行設(shè)計(jì)的引物—V4(FR)在微型微微型浮游植物群落鑒定方面更為高效．

注： 圖中等值線表示抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度， %．圖6 抑食金球藻優(yōu)勢(shì)度季節(jié)平面分布Fig．6 Aureococcus anophagefferens dominance horizontal distribution in different seasons

關(guān)于抑食金球藻的研究國(guó)外開(kāi)展較早，國(guó)內(nèi)自從褐潮暴發(fā)后才逐漸受到關(guān)注，目前已對(duì)其生理生化特征、暴發(fā)與消亡原因、生態(tài)危害及預(yù)防措施等方面開(kāi)展了大量研究[12，17]．抑食金球藻可產(chǎn)生一種抑制雙殼類動(dòng)物攝食的胞外多糖，通過(guò)刺激貝類鰓部肌肉收縮、干涉橫溝和腹溝的纖毛運(yùn)動(dòng)來(lái)阻止其攝食．研究[22- 23]證實(shí)，抑食金球藻可使硬殼蛤(Mercenariamercenaria)、海灣扇貝(Argopectenirradias)、紫貽貝(Mytilusedulis)、文蛤(Meretrixmeretrix)、牡蠣(ConchaOstreae)等纖毛活動(dòng)受到抑制，進(jìn)而停止攝食、減緩生長(zhǎng)、影響繁殖，最終大量死亡．

抑食金球藻環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，可在較廣的水溫范圍內(nèi)(0～25 ℃)發(fā)生褐潮，最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃左右，渤海褐潮主要發(fā)生在溫度達(dá)到15～20 ℃的5—6月，超過(guò)25 ℃的7—8月開(kāi)始衰退，然而溫度降至20 ℃的秋季也有可能發(fā)生褐潮，并持續(xù)到寒冷的冬季(0 ℃)[24]．抑食金球藻適鹽范圍(10～90)也非常寬泛，在25 ℃下最適生長(zhǎng)鹽度為20～70，因此遼東灣任何海域都有可能暴發(fā)褐潮．抑食金球藻能夠適應(yīng)低光照環(huán)境，可能其較小的葉綠體基因組完成光合作用更為高效．抑食金球藻不僅可利用無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，還可有效地利用有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因其含有更多與有機(jī)碳、有機(jī)氮化合物運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)基因，這也解釋了大粒徑赤潮生物衰敗分解后隨即暴發(fā)褐潮的原因[25]．

通過(guò)對(duì)遼東灣四季抑食金球藻的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，春季密度最高，夏、秋、冬季密度逐漸下降，說(shuō)明溫度是影響該藻繁殖的主要因素，也驗(yàn)證了渤海褐潮多暴發(fā)在春季的原因．抑食金球藻密度高值區(qū)主要分布在與河北秦皇島交界的綏中海域，與實(shí)際暴發(fā)褐潮海域相鄰，驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性．春季抑食金球藻在西南海域優(yōu)勢(shì)度非常高(平均40%)，其密度最高達(dá)78．128×103L-1，雖未達(dá)到警戒標(biāo)準(zhǔn)，但分布擴(kuò)散較廣，致災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)引起足夠重視．

抑食金球藻在我國(guó)海域近幾年才被報(bào)道，應(yīng)列為外來(lái)有害微藻進(jìn)行監(jiān)控管理．從目前遼東灣海域的抑食金球藻密度分布來(lái)看，該種已成為歸化種，2013年7月在長(zhǎng)興島近岸海域曾發(fā)生小范圍抑食金球藻褐潮，密度超過(guò)107L-1[26]．因此應(yīng)盡快開(kāi)展該藻的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，研究防控措施；跟蹤監(jiān)測(cè)各港口海域有毒微型微微型藻類的種群和分布；加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖區(qū)產(chǎn)毒微藻的監(jiān)測(cè)和管理，建立貝毒快速預(yù)警技術(shù)，減少對(duì)漁業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的危害[27- 30]．

3 結(jié)論

a) 遼東灣抑食金球藻春季密度最高，平均值為7．743×103L-1，高值區(qū)主要分布在遼東灣的西南、中部、東南海域；夏季密度平均值為2．094×103L-1，高值區(qū)主要分布在遼東灣的東南、西南兩側(cè)海域；秋季密度平均值為0．392×103L-1，高值區(qū)主要分布在遼東灣的西南、中東兩側(cè)海域；冬季密度平均值為0．053×103L-1，高值區(qū)主要分布在遼東灣的中南部海域．

b) 抑食金球藻相對(duì)密度春季最高(平均61．4%)，夏季次之(平均19．3%)，依次為秋季(平均13．1%)，冬季最少(平均6．2%)．說(shuō)明春季為抑食金球藻主要繁殖季節(jié)，水溫為主要控制因素．

c) 抑食金球藻春季優(yōu)勢(shì)度平均值為7．92%，主要在遼東灣西南部占優(yōu)勢(shì)；夏季優(yōu)勢(shì)度平均值為0．26%，主要在遼東灣中南部占優(yōu)勢(shì)；秋季優(yōu)勢(shì)度平均值為0．55%，主要在遼東灣中西、中東、東南部海域占優(yōu)勢(shì)；冬季優(yōu)勢(shì)度平均值為0．28%，主要在遼東灣中東、中南部占優(yōu)勢(shì)．

d) 抑食金球藻雖然在我國(guó)海域近幾年才被發(fā)現(xiàn)，但其環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，已在遼東灣海域廣泛分布，隨時(shí)都有大面積暴發(fā)的可能，因此應(yīng)加強(qiáng)有效監(jiān)控，研究應(yīng)急處置措施，減少漁業(yè)及生態(tài)損害．

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Distribution of Brown Tide SpeciesAureococcusanophagefferensin Liaodong Bay

SONG Lun1， WU Jing1， SONG Yonggang1， LIU Weidong1， YANG Guojun2

1．Key Laboratory of Marine Biological Resources and Ecology， Liaoning Province， Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute， Dalian 116023， China 2．Dalian Ocean University， Dalian 116023， China

Aureococcusanophagefferens(Ochrophyta，Pelagophyceae)inhibits bivalve feeding by producing a type of extracellular polysaccharide，and results in high shellfish mortality．Morphological identification ofA．a(chǎn)nophagefferensis difficult because of its small size，which has delayed research progress．In recent years，the development of high-throughput sequencing technologies has promoted research on nanophytoplankton and picophytoplankton．To identifyA．a(chǎn)nophagefferensand determine its distribution in Liaodong Bay，we used the 18S rDNA V4 region as the target gene to design the primer V4(FR)，and employed high-throughput sequencing technique to study nanophytoplankton and picophytoplankton diversity in Liaodong Bay．The results revealed thatA．a(chǎn)nophagefferensdensity was highest in the spring(7．743 × 103L-1)．Temperature was a significant factor inA．a(chǎn)nophagefferensreproduction．A．a(chǎn)nophagefferensdensity was high in Suizhong waters；this area is adjacent to Hebei Qinhuangdao，where the phytoplankton has caused brown tide outbreaks．The previous outbreak history supports our current results．A．a(chǎn)nophagefferenscommunity dominance was high in the southwest，averaging 40%，and its density was as great as 78．128 × 103L-1．In recent years，A．a(chǎn)nophagefferenswas found in the China Sea，where it has caused severe ecological impacts．According to our results，A．a(chǎn)nophagefferenscould be classified as a newly naturalized species based on its distribution in Liaodong Bay．The phytoplankton was responsible for a small-scale brown tide(>1．0 × 107L-1)in Changxingdao in July 2013．We recommend that measures be taken to preventA．a(chǎn)nophagefferensbrown tides rather than acting after the fact．First，we should monitor the types and distribution of toxic nanopicophytoplankton in port waters to supplement the invasive algae database．Second，we should enhance toxic microalgae monitoring and management in aquiculture areas．Finally，a brown tide early warning system should be established to avoid disasters in the fishery ecosystem．

Aureococcusanophagefferens； brown tide； picophytoplankton； high-throughput sequencing； Liaodong Bay

2016- 08- 19

2016- 12- 27

中國(guó)海洋發(fā)展研究會(huì)重大項(xiàng)目(CAMAZDA201605)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014020182)；遼寧省海洋與漁業(yè)科研項(xiàng)目(201611)

宋倫(1980-)，男，遼寧大連人，副研究員，主要從事海洋生物生態(tài)學(xué)研究，songlun@lnshky．com．

X171．1； Q89； P735

1001- 6929(2017)04- 0537- 08

A

10．13198j．issn．1001- 6929．2017．01．87

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