白玲玲，仲茂鳳，杜娟，凌昌全

第二軍醫(yī)大學中醫(yī)系,上海200433

老年高血壓患者肝腎陰虛證的特征

白玲玲，仲茂鳳，杜娟，凌昌全

第二軍醫(yī)大學中醫(yī)系,上海200433

目的觀察老年高血壓患者肝腎陰虛證臨床特征及外周血標識基因表達，為中醫(yī)辨證論治老年高血壓提供依據(jù)。方法本研究首先分析老年高血壓患者高血壓分級和病程與肝腎陰虛證的相關性；再根據(jù)全基因組芯片在原發(fā)性肝癌患者的肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證組中篩選的具有差異表達的17個基因mRNA的表達，基于異病同證原理，應用實時熒光定量PCR技術探索性觀察老年高血壓肝腎陰虛證患者的外周血單個核細胞中是否存在同樣的17個差異基因mRNA的表達。并應用受試者特征性操作曲線（ROC曲線）構建肝腎陰虛證的診斷模型。結果研究共納入老年高血壓患者（＞65歲）60名，其中肝腎陰虛證患者30名，非肝腎陰虛證患者30名，隨著高血壓病程延長，老年高血壓肝腎陰虛證患者更多；與非肝腎陰虛證患者相比，老年高血壓肝腎陰虛證患者外周血單個核細胞中MLH3表達減少，CD55表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義，進一步采用ROC分析，AUCMLH3=0.783，AUCCD55=0.737，MLH3和CD55作為老年高血壓肝腎陰虛證診斷模型的靈敏度分別為63.5%、57%，特異度分別為93%，90%。結論MLH3和CD55可能是老年高血壓肝腎陰虛證的標識基因。

老年；高血壓；肝腎陰虛證；錯配修復基因3；促衰變因子

隨著老齡化社會的到來，老年高血壓患者的數(shù)量近年來也持續(xù)增多，長期服用降壓藥物及高血壓所帶來的并發(fā)癥，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，尤其是老年高血壓患者[1]。有報道，高血壓發(fā)病率隨年齡增長而增加[2]。高血壓在傳統(tǒng)祖國醫(yī)學中屬于“眩暈”、“頭痛”、“中風”、“痰飲”、“水腫”、“耳鳴”等疾病范疇，其病理機制與肝、腎相關，多肝腎陰虛表現(xiàn)，這一點最早可追溯至《黃帝內(nèi)經(jīng)》[3]成書時期。現(xiàn)代著名醫(yī)家郭士魁[4]對原發(fā)性高血壓的發(fā)病認為是“肝火可見于高血壓初期，熱證時久必損陰液形成陰虛陽亢，病情再發(fā)展，陰虛更甚，腎陰虛影響到肝陰虛，出現(xiàn)肝腎陰虛?！庇捎诶夏耆说纳頇C能特點，肝腎陰虛證在老年高血壓患者中更為多見，接近17%的老年高血壓患者表現(xiàn)為肝腎陰虛[5]。本文基于“異病同治”的思想，在既往 mRNA芯片篩選出的肝癌肝腎陰虛標識基因的基礎上，對老年高血壓患者肝腎陰虛進行臨床癥狀分析，并探討其可能的物質(zhì)基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例病例來源2013年1月—2015年2月期間就診于第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院心內(nèi)科、上海市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科和上海龍華醫(yī)院的高血壓患者。按照中醫(yī)辨證 [辨證標準參考2002年版《中藥新藥臨床研究指導原則 (試行)》]，分為肝腎陰虛組30例和非肝腎陰虛組30例。

1.2 診斷及分級標準 參照《中國高血壓防治指南》2010年修訂版[6]制定的診斷標準:（1）年齡＞65歲、血壓持續(xù)或 3次以上非同日坐位血壓收縮壓＞l40 mmHg和（或）舒張壓＞90mmHg。（2）l級高血壓收縮壓：140～159mmHg和（或）舒張壓90～99mmHg；2級高血壓:收縮壓160～179 mmHg和（或）舒張壓100～109 mmHg。(當收縮壓與舒張壓屬不同分級時,按較高的級別診斷)。辨證標準:參照國家藥品監(jiān)督管理局2002年制定發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]按癥狀分級量化標準采樣歸納。

1.3 外周血單個核細胞（PBMCs）的分離及RNA抽提采集每例患者外周血3m L，EDTA抗凝，PBS稀釋，緩慢加入另一已加入淋巴細胞分離液的離心管中，3 000 g離心30 min；分離PBMCs，加入Trizol，按照5:1的體積加入氯仿，室溫靜置，離心，提取上層水相，等體積加入異丙醇，離心，提取總RNA[8-9]。

1.4 RTPCR檢測參照文獻[10]，將提取的RNA反轉錄為cDNA，加入引物（見表1），SYBRGreen，ddH2O補足體積，配成20L反應體系，進行定量PCR檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)運用IBM SPSS Statistic17.0進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式以平均值±標準差為主,組間基因相對表達差異的比較，選用檢驗，統(tǒng)計結果以＜0.05為有統(tǒng)計學意義。對上述篩選的陽性差異表達基因，以非參數(shù)法構建各自的受試者工作特征ROC曲線，計算曲線下面積 (Area under the Curve of ROC,簡稱AUC)，從而構建肝腎陰虛證的診斷模型。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物序列

2 結果

2.1 老年高血壓患者肝腎陰虛證的臨床特點 在肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證患者中，依據(jù)高血壓診斷標準中的分級標準，2組患者中診斷為高血壓1級的各1例，高血壓2級的分別為8例和10例，診斷為高血壓3級的分別為20例和19例。見表2。

表2 高血壓分級與證候

對入組患者原發(fā)性高血壓發(fā)病病程進行了統(tǒng)計，并以＜5年、5～10年、11～15年、＞15年4個不同階段進行分層，發(fā)現(xiàn)隨著老年患者病程的延長，表現(xiàn)為肝腎陰虛者更多。見表3。

表3 高血壓病程與證候

2.2 老年高血壓患者肝腎陰虛證的標識基因 既往采用mRNA芯片篩選肝癌患者肝腎陰虛證標識基因，發(fā)現(xiàn)表達下調(diào)的是：SEC62、ACSL6、PDE3B、BIRC3、TCF7、CR1、CCNB1、PAICS、PSPH、CD55、NT5E和MLH3（＜0.05）；表達上調(diào)的是PSMD6、KRAS、TRPC1、CTSK和XRCC4（＜0.05）；根據(jù)“異病同證”思想，其他疾病肝腎陰虛證患者可能存在相同的物質(zhì)基礎，檢測這17個基因在老年高血壓肝腎陰虛證患者的表達，結果發(fā)現(xiàn)，與非肝腎陰虛證組相比，肝腎陰虛證患者外周血單個核細胞中僅有MLH3表達下調(diào)（＜0.05），CD55表達上調(diào)（＜0.05）。其余基因的表達2組間差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 17個基因在老年高血壓肝腎陰虛證組與非肝腎陰虛證組的表達

2.3 構建老年高血壓患者肝腎陰虛證證候診斷模型 根據(jù) MLH3和 CD55的受試者特征曲線，AUCMLH3=0.783,AUCCD55=0.737，MLH3和 CD55作為老年高血壓肝腎陰虛證診斷模型的靈敏度分別為63.5%和57%，特異度分別為93%和90%。見圖2。

圖2 MLH3和CD55的ROC曲線

3 討論

高血壓病按其臨床表現(xiàn)可歸屬于祖國醫(yī)學“眩暈”、“頭痛”等范疇。老年高血壓病是高血壓病的一種特殊類型，其臨床表現(xiàn)多樣，病因病機復雜，發(fā)病與臟腑功能虛損的關系極為密切。肝腎虧虛、陰陽失調(diào)，是為本虛；肝陽上亢、痰濁閉阻，是為標實。盧燦輝總結盧永兵治療老年高血壓病經(jīng)驗，認為老年高血壓是虛實夾雜、上實下虛之病，初病常以實為主，病久以虛為主，虛以肝腎陰虛、心脾氣虛多見，實以風、火、痰、疲為主[11]。本研究的結果也正說明這一點,隨著患者年齡的增長及病程的延長，患者證型多呈現(xiàn)出由實證向虛證轉化的趨勢。高血壓病程較長的患者表現(xiàn)為肝腎陰虛的比例略高。

近幾十年來，有關證的生物學基礎研究開展的很多，雖然有一些現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，但至今尚未有公認的結論。前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌肝腎陰虛證患者外周血單個核細胞中17個基因的mRNA表達與非肝腎陰虛證患者存在差異，為了體現(xiàn)中醫(yī)“異病同證”思想，減輕疾病本身對證候標識基因的影響，同時選擇了肝腎陰虛發(fā)病率較高的老年高血壓患者進行觀察，同樣檢測從肝癌患者中篩選出的這17個mRNA。與肝癌肝腎陰虛證相比，老年高血壓肝腎陰虛證與非肝腎陰虛證患者外周血單個核細胞的總RNA中僅發(fā)現(xiàn)MLH3和CD55這兩個基因的mRNA表達在2組之間存在差異。而CD55在高血壓肝腎陰虛證中的表達與肝癌中相反?？赡茉颍海?）原發(fā)性肝癌與原發(fā)性高血壓屬于兩種不同的疾病，老年高血壓更是存在特殊性，因此很多基因的表達可能與疾病的關系更為密切。（2）由于老年高血壓入組患者年齡都大于65歲，普遍高于肝癌患者，可能會影響某些基因的表達。（3）樣本量偏小，離散度偏大。

證候與疾病的發(fā)生、發(fā)展是密不可分的，證候學對人們預防疾病、治療及預后康復的調(diào)整方面均有著一定的指導意義。然而，證候理論尚未有、形成完整的體系，有待完善。應當在繼承、整理、總結前人經(jīng)驗的基礎上，將證候理論與現(xiàn)代醫(yī)學的新思路、新方法相結合，探索中醫(yī)證候的分子基礎，拓展中醫(yī)證候理論。此研究是在假設“異病同證”存在相同的差異基因表達的前提下進行的探索性研究，篩選出的標識基因只能說是與老年高血壓肝腎陰虛證密切相關，與其他疾病的肝腎陰虛證是否相關需要進一步驗證。

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Clinical Features of Elderly Hypertensive Patients w ith Deficiency Syndrome of Both Liver and Kidney Yin

Bai Lingling,Zhong Maofeng,Du Juan,Ling Changquan*
Department of TCM,Second M ilitary Medical University,Shanghai,200433,P.R.China

Objective To observe the clinical features and expression of marker genes in peripheral blood in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin.Methods The correlation of hypertension grades and the course of the disease to deficiency syndrome of both liver and kidney yin was first studied;17 mRNA expressions w ith differentia were screened out from primary liver cancer patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin and from primary liver cancer patients w ith no deficiency syndrome of both liver and kidney yin by chromosomal microarray,and then the real-time fluorescence quantitative PCR technology was applied in observing if there existed the mRNA expressions same w ith the 17 in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin;the diagnostic model was set up based on the Receiver Operating Characteristic(ROC)curves.Results In total,the study enrolled 60 elderly hypertensive patients(＞65 years old),30 patients w ith deficiency syndrome of both liver and kidney yin while 30 patients w ith no;more elderly hypertensive patients got deficiency syndrome of both liver and kidney yin w ith the course of hypertension lasting;the MLH3 expression in peripheral blood mononuclear cells of the elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin decreased much more than that in patients w ith no deficiency syndrome of both liver an kidney yin while CD55 expression was enhanced,the difference was of statistical significance;ROC analysis showed that AUCMLH3=0.783 and AUCCD55=0.737;the sensitivity of MLH3 and CD55 of the diagnostic model was 63.5% and 57%respectively.Conclusions MLH3 and CD55 may be the marker genes in elderly hypertensive patients w ith deficiency syndrome of both liver an kidney yin.

elderly;deficiency syndrome of both liver an kidney yin;MLH3;CD55

2016-11-25）

（本文編輯：夏世金）

國家自然基金面上項目（81273881）

凌昌全，電子信箱:lingchangquan@hotmail.com

*Corresponding author:Ling Changquan,E-mail:lingchangquan@hotmail.com