史 麗，張夢(mèng)靖，申榮榮，李順德，白 娟，王永杰，何國(guó)瑋，崔 悅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019)

同脈縞蠅亞屬種團(tuán)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系初探

史 麗*，張夢(mèng)靖，申榮榮，李順德，白 娟，王永杰，何國(guó)瑋，崔 悅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019)

選取2個(gè)線粒體基因COI和16S-rRNA，2個(gè)核基因Elongation factor 1-α和28S-rRNA，初步探討同脈縞蠅亞屬種團(tuán)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，研究表明，翅斑的減少是趨于原始的性狀；基于線粒體基因COI和16S-rRNA構(gòu)建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹(shù)中，MP樹(shù)更與形態(tài)分類(lèi)的研究結(jié)果一致；而基于Elongation factor 1-α和28S-rRNA基因構(gòu)建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹(shù)反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系完全相同；以同脈縞蠅亞屬18種為代表構(gòu)建的6個(gè)種團(tuán)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并沒(méi)有呈現(xiàn)出一致的規(guī)律性，不能從分子水平驗(yàn)證根據(jù)已有的外部形態(tài)特征劃分種團(tuán)的可靠性。

縞蠅科；同脈縞蠅亞屬；系統(tǒng)發(fā)育；種團(tuán)

縞蠅主要營(yíng)菌食性和腐食性生活，在降解有機(jī)質(zhì)、保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡中起著非常重要的作用；部分屬的成蟲(chóng)可訪花，有助于植物傳粉(Silva and Mello, 2008)?？c蠅對(duì)環(huán)境變化敏感，是陸生生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境變化評(píng)價(jià)的指示生物之一(Reddersen, 1995)。同脈縞蠅亞屬隸屬于雙翅目縞蠅科Lauxaniidae同脈縞蠅亞科Homoneurinae同脈縞蠅屬，是縞蠅科中具有生態(tài)和經(jīng)濟(jì)重要性的一大類(lèi)群，物種多樣性豐富。我國(guó)已知20種團(tuán)，145種(Shi and Yang, 2009, 2014)。種團(tuán)的建立是基于翅斑和雄性外生殖器相結(jié)合的特征進(jìn)行人為劃分的，本實(shí)驗(yàn)旨在從分子手段，檢驗(yàn)已劃分種團(tuán)的可靠性，并依據(jù)分子數(shù)據(jù)，推導(dǎo)種團(tuán)間鑒別的關(guān)鍵形態(tài)特征，這對(duì)于深入分析同脈縞蠅亞科同脈縞蠅屬不同亞屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野外采集的標(biāo)本，直接浸泡于無(wú)水乙醇中保存，回到實(shí)驗(yàn)室后，更換一次無(wú)水乙醇，然后，置于-20℃冰箱中保存。標(biāo)本信息見(jiàn)下表1。

表1 物種信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本解剖和鑒定

在光學(xué)解剖鏡下，用眼科專(zhuān)用手術(shù)剪刀小心剪下腹部相應(yīng)部分或從胸部和腹部連接處取下整個(gè)腹部；將解剖后的腹部置于10% NaOH溶液中，8 h，待腹部大部分肌肉和脂肪溶解后取出，用清水小心漂洗，并將其置于盛有適量水或甘油的培養(yǎng)皿內(nèi)的小脫脂薄棉層上，以待觀察；在觀察結(jié)束后，用解剖針將剝離的外生殖器輕輕撥入后腹部，用蘸有適量甘油的小包裹，將之轉(zhuǎn)入外生殖器專(zhuān)用塑料小管中保存。結(jié)合相關(guān)種類(lèi)鑒定資料，最終鑒定到種。

1.2.2 DNA提取

采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)TIANGEN(李軒昆，2015)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

引物合成和雙向測(cè)序均由上海生物工程有限公司完成。長(zhǎng)度在1 kb以內(nèi)的片段，釆用PCR反應(yīng)體系(50 μL)擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，48℃-55℃退火45 s，72℃延伸1-2 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min，4℃保存；長(zhǎng)度在1 kb以上的片段，釆用PCR反應(yīng)體系(25 μL)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，48℃-55℃退火50 s，65℃延伸2-6 min，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，65℃終延伸10 min，4℃保存(張廣宇，2014)。

表2 用于擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析

選取縞蠅亞科Lauxaniinae雙鬃縞蠅屬Sapromyza和黑縞蠅屬M(fèi)inettia、斑腹蠅科Chamaemyiidae斑腹蠅屬Chamaemyia和沼蠅科Sciomyzidae沼蠅屬Sciomyza作外群，將同脈縞蠅亞科Homoneurinae同脈縞蠅亞屬Homoneura的種類(lèi)的序列，用Mega 7.0中的CLUSTALX進(jìn)行序列比對(duì)(均用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置)。將比對(duì)后的結(jié)果轉(zhuǎn)換成Mega格式，用Mega 7.0基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型，計(jì)算兩兩個(gè)體之間的遺傳距離，使用1000次重復(fù)檢測(cè)的Bootstrap值表示樹(shù)上各節(jié)點(diǎn)的支持率，采用鄰接法(NJ)、最小進(jìn)化法(ME)、最簡(jiǎn)約法(MP)構(gòu)建同脈縞蠅亞屬種團(tuán)間系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

采用MEGA 7.0系統(tǒng)發(fā)育分析軟件，構(gòu)建同脈縞蠅亞屬種團(tuán)間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.1 基于COI基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖1顯示，系統(tǒng)樹(shù)的最頂部聚類(lèi)的是新北區(qū)分布的種類(lèi)(philadelphica，fraterna，bispina，incerta，biumbrata)，包括了abnormisgroup[H.(H.)philadelphica和H.(H.)incerta]與singularisgroup[H.(H.)fraterna]，sauterigroup[H.(H.)bispina]，quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]；其中，abnormisgroup[H.(H.)philadelphica]和singularisgroup[H.(H.)fraterna]聚為一支，abnormisgroup[H.(H.)incerta]與quinquenotatagroup聚為一支。中部是印度馬來(lái)亞區(qū)分布的種類(lèi)(dorsacerba，apicitrunctata，fengyangshanica)，包括了singularisgroup [H.(H.)dorsacerba和H.(H.)fengyangshanica]，calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]，這一支的特點(diǎn)是縱脈R4+5上有2個(gè)以上的褐色中斑或端前斑。下部是古北區(qū)分布的種類(lèi)(pictipennis，stackelbergiana，patelliformis，septentrionalis)，包括了tibetensisgroup[H.(H.)pictipennis]，quinquenotatagroup[H.(H.)stackelbergiana]，unguiculatagroup[H.(H.)patelliformis]，sauterigroup[H.(H.)septentrionalis]；其中，tibetensisgroup和quinquenotatagroup聚為一支，而H.(H.)patelliformis單獨(dú)為一支，可能是因?yàn)槠涑崆熬壓谏套撞簧爝_(dá)R4+5，這一特征也為Sapromyza屬的部分種類(lèi)所特有。從樹(shù)的頂端至底端，種團(tuán)內(nèi)種類(lèi)的翅斑數(shù)量呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。這4個(gè)系統(tǒng)樹(shù)中，MP樹(shù)更與形態(tài)分類(lèi)相吻合。

2.2 基于16S-rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2顯示，僅有H.(H.)apicitrunctata和H.(H.)dorsacerba是印度馬來(lái)亞區(qū)分布，其余種類(lèi)均為古北區(qū)分布。頂部一支包括calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]或singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]，sauterigroup[H.(H.)remmi]，quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]，singularisgroup[H.(H.)dilecta]；底部一支包括unguiculatagroup[H.(H.)thalhammeri和H.(H.)patelliformis]，sauterigroup[H.(H.)mediospinosa]。而singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]或calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]單獨(dú)一支，可能是與其印度馬來(lái)亞區(qū)分布有關(guān)，但證據(jù)不充分。這4個(gè)系統(tǒng)樹(shù)中，MP樹(shù)更與形態(tài)分類(lèi)相吻合。

圖2 基于16S-rRNA基因的系統(tǒng)樹(shù)Fig.2 Cladistic tree based on the 16S-rRNA gene

2.3 基于28S-rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3顯示，系統(tǒng)樹(shù)頂部quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]與sauterigroup[H.(H.)remmi]、singularisgroup[H.(H.)dilecta]聚為一支，singularisgroup[H.(H.)dorsacerba]和calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]聚為一支，而sauterigroup[H.(H.)mediospinosa和H.(H.)septetrionalis]、unguiculatagroup[H.(H.)thalhammeri和H.(H.)patelliformis]、tibetensisgroup[H.(H.)pictipennis]分別聚為一支。與COI和16S-rRNA基因的系統(tǒng)樹(shù)相比，所選四種方法的系統(tǒng)樹(shù)呈現(xiàn)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系完全相同，且有一定的規(guī)律性，比如翅斑減少這一特征更為原始，或許在自然界中，昆蟲(chóng)翅斑增加，呈現(xiàn)擬態(tài)或保護(hù)色，更容易繁衍生息。

2.4 基于Elongation factor 1-α基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4顯示，singularisgroup[H.(H.)dilecta]和quinquenotatagroup[H.(H.)biumbrata]的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，calopteragroup[H.(H.)apicitrunctata]與sauterigroup[H.(H.)interstincta，H.(H.)mediospinosa，H.(H.)remmi]和unguiculatagroup[H.(H.)patelliformis]的關(guān)系最遠(yuǎn)。與28S-rRNA基因的系統(tǒng)樹(shù)相比，所選4種方法的系統(tǒng)樹(shù)呈現(xiàn)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系也是完全相同，且有一定的規(guī)律性。但是，由于這個(gè)基因比前述3個(gè)基因更難擴(kuò)增，因此，可選昆蟲(chóng)種類(lèi)明顯少。

3 結(jié)論與討論

選取4種基因，對(duì)同脈縞蠅亞屬內(nèi)種團(tuán)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行初探，結(jié)果表明，翅斑的減少是趨于原始的形狀；基于線粒體基因COI和16S-rRNA構(gòu)建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹(shù)中，MP樹(shù)更與形態(tài)分類(lèi)的研究結(jié)果一致；而基于Elongationfactor 1-α和28S-rRNA基因構(gòu)建的NJ、ME、MP、ML系統(tǒng)樹(shù)反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系完全相同；以同脈縞蠅亞屬18種為代表構(gòu)建的6個(gè)種團(tuán)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并沒(méi)有呈現(xiàn)出一致的規(guī)律性，不能從分子水平驗(yàn)證根據(jù)已有的外部形態(tài)特征劃分種團(tuán)的可靠性。

圖3 基于28S-rRNA基因的系統(tǒng)樹(shù)Fig.3 Cladistic tree based on the 28S-rRNA gene

圖4 基于Elongation factor 1-α基因的系統(tǒng)樹(shù)Fig.4 Cladistic tree based on the Elongation factor 1-α gene

標(biāo)本野外采集過(guò)程中，使用了乙酸乙酯，可能存在使用過(guò)量的問(wèn)題，且蟲(chóng)體接觸到了乙酸乙酯，因此，盡管實(shí)驗(yàn)采用了當(dāng)年采集的新鮮標(biāo)本，提取DNA后，測(cè)序結(jié)果并不如預(yù)期的那么理想，這大大的限制了原實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中的樣本的選擇。Elongation factor 1-α基因片段較難擴(kuò)增成功，需要在引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增條件方面進(jìn)行改進(jìn)。文中涉及的Homoneura(H.)incerta、Homoneura(H.)fraterna、Homoneura(H.)bispina在Miller(1977)的新北區(qū)同脈縞蠅亞屬種團(tuán)劃分的研究論著中，分別隸屬于incertagroup、fraternagroup和bispinagroup中；而Homoneura(H.)dilecta、Homoneura(H.)remmi在Papp(1978)關(guān)于古北區(qū)同脈縞蠅種團(tuán)劃分的研究論文中，分別隸屬于notatagroup和minorgroup；這兩位學(xué)者的種團(tuán)劃分標(biāo)準(zhǔn)主要是依據(jù)雄性外生殖器各部分的特征。同脈縞蠅屬是縞蠅科中最大的屬，而同脈縞蠅亞屬是這個(gè)屬中最大的亞屬，世界已知600余種，如果能選擇合適的特征形狀，正確劃分種團(tuán)，將為同脈縞蠅亞屬世界區(qū)系的修訂奠定基礎(chǔ)。

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Preliminary study on phylogeny of species groups in subgenusHomoneura

SHI Li*, ZHANG Meng-Jing, SHEN Rong-Rong, LI Shun-De, BAI Juan, WANG Yong-Jie, HE Guo-Wei, CUI Yue

(College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China)

Based on two mitochondrial genes (COI and 16S-rRNA) and two nuclear genes (Elongation factor 1-alpha and 28S-rRNA), the phylogenetic relationships among six species groups of subgenusHomoneurawere preliminarily studied. The results showed that decreasing in quantity of wing spots is a trend to origin; the phylogeny presented from MP could keep better accord with morphological taxonomy than others among the NJ, ME, MP and ML builted by mitochondrial genes (COI and 16S-rRNA), while all NJ, ME, MP and ML builted by the nuclear genes (Elongation factor 1-alpha and 28S-rRNA) phylogeny reflected the same phylogenetic relationships. The phylogenetic relationships from 18 representative species of 6 species groups of subgenusHomoneuracould not show some consistent regularity, so the reliability of the existing species group constructed with artificial classification could not be verified from the molecular level.

Lauxaniidae;Homoneura; phylogeny; species groups

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260525)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生科學(xué)創(chuàng)新基金(DC201506)；內(nèi)蒙古杰出青年培育基金(2015JQ03)

史麗，女，1976年生，教授，研究方向?yàn)槔ハx(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化與生物多樣性

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: lirui2003@imau.edu.cn

Received: 2016-12-30; 接受日期Accepted: 2017-02-17

Q963

A

1674-0858(2017)02-0351-06

史麗，張夢(mèng)靖，申榮榮，等.同脈縞蠅亞屬種團(tuán)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系初探[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(2):351-356.