張一鳴，林昱星，張璐，肖澤豐，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

?

奇異南星再生體系的建立

張一鳴，林昱星，張璐，肖澤豐，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

為了保護(hù)和利用野生奇異南星資源，建立了奇異南星的再生體系.以奇異南星葉柄作為外植體，通過器官發(fā)生途徑，探討了不同植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織、不定芽及不定根的誘導(dǎo)效應(yīng).研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L；誘導(dǎo)不定芽和不定根分化的適宜培養(yǎng)基均為MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)82%，生根率達(dá)到100%.

奇異南星；愈傷組織；不定芽誘導(dǎo)；生根培養(yǎng)

奇異南星(ArisaemadecipiensSchott)又稱鐵燈臺、青腳蓮，是天南星科(Araceae)天南星屬(Arisaema)植物，產(chǎn)于云南西北部(貢山、德欽至騰沖)和廣西容縣，生于海拔880～3 400 m的山坡灌叢中.印度也有分布.奇異南星的根莖入藥，主治無名腫毒、乳腺炎、癰疽、毒蛇咬傷、蜂蝎螫傷、蜘蛛及老鼠咬傷[1]168.

天南星屬約有150余種植物，大都分布于亞洲熱帶、亞熱帶和溫帶，少數(shù)產(chǎn)于熱帶非洲，中美和北美也有數(shù)種.中國有82種，其中59種系中國特有，以云南分布的種類最為豐富(40種)，其次為四川(33種)、西藏(19種)、湖北(14種)[1]116.中國藥典收載了天南星(Arisaemaerubescens)、異葉天南星(A.heterophyllum)、東北天南星(A.amurense)3 種植物.

為了有效擴(kuò)大奇異南星種源，可以通過組織培養(yǎng)技術(shù)，建立奇異南星高效再生體系.目前已有多種植物通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立了再生體系，如新疆雪蓮[2]、胭脂花[3]、長春花[4]、Harpagophytumprocumbens[5]、Violauliginosa[6]等.

本研究的目的在于以野生奇異南星為材料，建立組織培養(yǎng)再生體系，為奇異南星開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料的選取與消毒處理

奇異南星種子采于廣西壯族自治區(qū)靖西縣龍邦鎮(zhèn).將采集的種子先用流動自來水沖洗 1 h，再用蒸餾水浸泡24 h后，于超凈工作臺內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡30 s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的 HgCl2消毒7 min，最后用無菌水沖洗3次.

1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH值為5.8～6.2，121 ℃滅菌20 min.將消毒后的種子接種于上述培養(yǎng)基中，在溫度為(25±2) ℃、光照時間為12 h/d、光照強(qiáng)度為3 000～4 000 lx條件下進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后可獲得無菌苗.

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

在超凈工作臺內(nèi)，將奇異南星無菌苗的葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的切塊，將葉柄切成0.5 cm長的切段，分別接種到MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo).

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)

將愈傷組織分別接種于單獨(dú)添加6-BA、TDZ(0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或接種到MS+IAA+6-BA和MS+IAA+TDZ培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo).每個處理接種50塊愈傷組織，重復(fù)3次.30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果.

1.2.3 生根培養(yǎng)

以MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基.選取3 cm左右生長茁壯的不定芽接入培養(yǎng)基中，每次接種50個不定芽，重復(fù)3次.30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及根長.

1.2.4 煉苗與移栽

將生根后的再生植株移栽至V(泥炭土)∶V(珍珠巖)∶V(沙)=4∶3∶2的混合基質(zhì)中，置于相對濕度為80%～90%、溫度為20 ℃左右的環(huán)境中培養(yǎng).移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率.

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，葉片外植體先膨大，2周后逐漸褐化死亡，這表明葉片不適合做外植體.葉柄外植體則可誘導(dǎo)出愈傷組織.培養(yǎng)1周后，葉柄外植體開始膨大，2周后切口2端開始出現(xiàn)愈傷組織.4周后將愈傷組織在MS+6-BA 1.0 mg/L +2,4-D 1.0 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織可快速增殖(圖1a)，每4周繼代1次.

2.2 不定芽的誘導(dǎo)

2.2.1 單一植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽誘導(dǎo)的影響

在單獨(dú)添加6-BA質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的MS培養(yǎng)基中，2周后愈傷組織可以分化出不定芽(圖1 b)，其誘導(dǎo)率為15.67%～36.67%.當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)率最高，為36.67 %.當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度升高到4.0 mg/L時，誘導(dǎo)率最低，僅為15.67%(圖2).

a.愈傷組織；b.不定芽；c.不定根；d.移栽后的植株.圖1 奇異南星愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生Fig.1 Callus induction and plant regeneration of Arisaema decipiens

將愈傷組織分別接種于TDZ質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種1周左右，愈傷組織逐漸變綠，表面有顆粒狀突起，2周后，形成不定芽，其誘導(dǎo)率為21.33%～48.67%.當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)到48.67%(圖3).

數(shù)據(jù)以表示，P<0.05，標(biāo)有相同字母的數(shù)據(jù)表示差異不顯著，標(biāo)有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著.

2.2.2 IAA與6-BA組合對不定芽分化的影響

將愈傷組織分別接種于含有0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L IAA和6-BA的MS培養(yǎng)基中，愈傷組織表面出現(xiàn)球狀突起，很快形成不定芽(圖1b).當(dāng)IAA和6-BA的質(zhì)量濃度均為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)82.00 %(圖4)，并且不定芽的生長狀況良好，葉柄較粗，葉片較大，生長旺盛.因此，誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L.

2.2.3 IAA與TDZ組合對不定芽分化的影響

在添加IAA和TDZ(0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，不定芽的誘導(dǎo)率為18.00%～66.00%.當(dāng)IAA和TDZ的質(zhì)量濃度均為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)到66 .00%(圖5).該組合的誘導(dǎo)效果不及IAA+6-BA.

圖4 IAA與6-BA組合對不定芽誘導(dǎo)的影響Fig.4 Effects of IAA in combination with 6-BA on adventitious shoots induction

圖5 IAA與TDZ組合對不定芽誘導(dǎo)的影響Fig.5 Effects of IAA in combination with TDZ on adventitious shoots induction

2.3 生根培養(yǎng)

選取3 cm左右的不定芽接種到MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，5～7 d開始出現(xiàn)白色根尖，隨后根尖伸長，30 d時長出10條左右淡黃色的不定根，呈輻射狀分布，生根率達(dá)100%.大多數(shù)根長為7～10 cm，粗壯(圖1c).

2.4 煉苗及移栽

將三角瓶的瓶口打開，再生苗煉苗1周.然后小心洗凈根部的培養(yǎng)基，盡量減少對根系的損傷，將再生植株移栽至V(泥炭土)∶V(珍珠巖)∶V(沙)=4∶3∶2的混合基質(zhì)中，置于相對濕度為80%～90%、溫度為20 ℃左右的環(huán)境中培養(yǎng)，30 d后成活率達(dá)100%(圖1d).

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，將奇異南星葉柄外植體在MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)時，可誘導(dǎo)出愈傷組織，在此培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，愈傷組織可快速增殖.梁宇等[7]以東北天南星嫩葉為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，在添加2.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L 2,4-D的1/2MS培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率為85%.這表明6-BA和2,4-D配合有利于天南星屬植物愈傷組織的誘導(dǎo).王俊麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA與低濃度2,4-D配合使用時，對華北大黃愈傷組織的增殖效應(yīng)十分明顯，其中MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L培養(yǎng)基的增殖效果最好.這些研究結(jié)果表明，6-BA和2,4-D配合有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但植物種類不同，對其濃度要求也不同.

在不定芽誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)基中單獨(dú)添加6-BA或TDZ均可誘導(dǎo)出不定芽，但最高誘導(dǎo)率分別為36.67%和48.67%，誘導(dǎo)率較低.研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基同時添加較低濃度的IAA和6-BA或TDZ時，不定芽的誘導(dǎo)率明顯提高.當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/L時，不定芽的誘導(dǎo)率為59.33%～82.00%.當(dāng)IAA質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/L、TDZ質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，不定芽的誘導(dǎo)率為60.67%～66.00%.可見，IAA與6-BA配合使用時更有利于奇異南星不定芽的誘導(dǎo).

李卉等[9]以峨眉山野生一把傘南星莖尖作為外植體，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)MS+IAA 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基對莖尖誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，這表明IAA與6-BA配合使用時，對不同植物、不同外植體的誘導(dǎo)作用是不同的.

本研究以奇異南星葉柄為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，探索出了愈傷組織、不定芽和不定根誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，建立了再生體系，這為野生奇異南星的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ).

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第13卷：第2分冊)[M].北京：科學(xué)出版社，1979：116,168.

[2] GUO B,GAO M,LIU C Z.In vitro propagation of an endangered medicinal plant Saussurea involucrata Kar．et Kir [J].Plant Cell Rep,2007,26(3):261-265. DOI 10.1007/s00299-006-0230-6.

[3] 宋韻霏，王俊麗，畢凱麗，等.胭脂花的組織培養(yǎng)與植株再生[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，32(6)：630-634. SONG Y F,WANG J L, BI K L,et al.Tissue culture and plant regeneration ofPrimulamaximowiczii[J].Jornal of Hebei University (Natural Science Edition),2012,32(6):630-634.

[4] DHANDAPANI M,KIM D H,HONG S B.Efficient plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis from the explants ofCatharanthusroseus[J].In Vitro Cell Dev Biol- Plant,2007,44(1):18-25. DOI 10.1007/s11627-007-9094-x.

[5] GRABKOWSKA R,SITAREK P,WYSOKIN′SKA H.Influence of thidiazuron (TDZ) pretreatment of shoot tips on shoot multiplication and ex vitro acclimatization ofHarpagophytumprocumbens[J].Acta Physiol Plant,2014,36(7):1661-1672.DOI 10.1007/s11738-014-1541-9.

[6] SLAZAK B,SLIWINSKA E,SALUGA M,et al.Micropropagation ofViolauliginosa(Violaceae) for endangered species conservation and for somaclonal variation-enhanced cyclotide biosynthesis[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2014,120(1):179-190.DOI 10.1007/s11240-014-0592-3.

[7] 梁宇，顧地周，劉秀巖，等.東北天南星的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊，2008，44(4)：751-752.DOI 10.13592/j.cnki.ppj.2008.04.042. LIANG Y,GU D Z,LIU X Y,et al.In vitro culture and rapid propagation ofArisaemaamurenseMaxim [J].Plant Physiology Communications,2008,44(4):751-752. DOI 10.13592/j.cnki.ppj.2008.04.042.

[8] 王俊麗，陸遠(yuǎn)，劉坤，等.華北大黃愈傷組織培養(yǎng)及土大黃苷含量研究[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，31(2)：195-199. WANG J L,LU Y,LIU K,et al.Callus proliferation and rhaponticin accumulation ofRheumfranzenbachiiMunt [J].Jornal of Hebei University (Natural Science Edition),2011,31(2):195-199.

[9] 李卉，李仲芳，劉芳，等.一把傘南星組織培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(8)：2231，2236 . DOI 10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.08.016. LI H,LI Z F,LIU F,et al.Study on culture condition ofArisaemaerubescens(Wall.) [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2007,35(8):2231,2236.DOI 10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.08.016.

(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Establishment of regeneration system ofArisaemadecipiensSchott

ZHANG Yiming,LIN Yuxing,ZHANG Lu,XIAO Zefeng,WANG Junli
(College of Life and Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing 100081,China)

For protection and utilization of the wildArisaemadecipiensSchott,a regeneration system was developed.The effects of different plant growth regulators on callus,adventitious shoot and root induction were investigated by organogenesis using petiole as explants.The results showed that the optimal medium of callus induction was MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L.The suitable medium for adventitious shoots induction was MS+IAA 0.5 mg/L +6-BA 0.5 mg/L,and the induction rate of adventitious shoots reached at 82%.Up to 100% of the regenerated shoots formed complete plantlets on MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L medium.

Arisaemadecipiens;callus;adventitious shoots;rooting culture

2016-07-25

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2012YQ03026108);高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目(B08044);一流大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(YLDX01013)

張一鳴(1986—)，男，遼寧本溪人，中央民族大學(xué)在讀博士研究生.E-mail：61705358@qq.com

王俊麗(1964—)，女，河北新樂人，中央民族大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物細(xì)胞工程及資源利用研究. E-mail：wangjunli1698@163.com

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.007

Q945

A

1000-1565(2017)03-0262-05