鄒 雪 鄧孟勝 李立芹 余金龍 丁 凡 黃雪麗 彭 潔 帥 禹 蔡誠(chéng)誠(chéng) 王西瑤,*

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油菜素內(nèi)酯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在馬鈴薯塊莖貯藏期間的表達(dá)變化及對(duì)萌芽的影響

鄒 雪1,2鄧孟勝2李立芹2余金龍1丁 凡1黃雪麗2彭 潔2帥 禹2蔡誠(chéng)誠(chéng)2王西瑤2,*

1綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 四川綿陽(yáng) 621023;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 四川成都 611130

為探明油菜素內(nèi)酯BR在塊莖萌芽中的作用, 建立更有效的種薯催芽調(diào)控體系, 選擇了休眠期不同的3個(gè)品種, 利用qRT-PCR分析與BR合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控有關(guān)的9個(gè)基因在貯藏期間及抑芽處理下的表達(dá)模式; 同時(shí)檢測(cè)BR類(lèi)似物24-表油菜素內(nèi)酯(24-eBL)及其與赤霉素GA3對(duì)塊莖萌芽的影響。結(jié)果表明, 涉及BR合成的4個(gè)基因表達(dá)量均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)升高, 短休眠品種升高的時(shí)間點(diǎn)早于中、長(zhǎng)休眠品種; 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因中和的變化與合成基因相似,和的表達(dá)量則在中、長(zhǎng)休眠期品種中保持恒定。抑芽處理在貯藏前期能刺激這些基因的表達(dá)升高, 但之后都迅速下降并保持低水平。轉(zhuǎn)錄因子在各品種中以及抑芽處理下均沒(méi)有明顯變化。24-eBL利于塊莖解除休眠, 但不促進(jìn)芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng), 與GA3互配效果更佳, 單株塊莖增重37.92%~98.41%。結(jié)論表明, BR合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是塊莖從休眠向萌芽轉(zhuǎn)變的必經(jīng)生理過(guò)程, 它與GA3互配用于催芽更利于種薯萌芽的整齊、健壯并促進(jìn)塊莖形成。

馬鈴薯; 塊莖萌芽; 油菜素內(nèi)酯; 基因表達(dá)

馬鈴薯(L.)具有穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、生育期短、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn), 是我國(guó)第四大糧食作物之一。馬鈴薯通常以塊莖無(wú)性繁殖, 塊莖具休眠期, 且不同基因型間的休眠期存在較大差異, 同時(shí)受種植季節(jié)等環(huán)境因素影響[1-2]。處于休眠期的種薯播種后出苗不齊或爛薯, 發(fā)芽過(guò)久的老化種薯則導(dǎo)致減產(chǎn)10%~30%[3], 所以種薯在播種前能整齊萌芽, 達(dá)到最佳生理狀態(tài), 是保證產(chǎn)量的關(guān)鍵, 特別是在春、秋、冬三季能夠種植馬鈴薯的西南地區(qū), 其對(duì)種薯萌芽時(shí)間的要求更為靈活。

內(nèi)源激素是調(diào)控塊莖從休眠向萌芽狀態(tài)轉(zhuǎn)變的重要物質(zhì), 各激素間存在復(fù)雜互作。Aksenova等[4]認(rèn)為脫落酸(ABA)、乙烯(Eth)、油菜素內(nèi)酯(BR)促進(jìn)塊莖休眠, 生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素(CTK)和赤霉素(GA)解除休眠促進(jìn)萌芽, CTK和GA促進(jìn)芽生長(zhǎng), 其中GA3是生產(chǎn)上常用的馬鈴薯種薯催芽劑。Hartmann等[5]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)降低馬鈴薯的CTK含量能延長(zhǎng)塊莖休眠并且對(duì)外源施加GA3無(wú)反應(yīng), 證實(shí)兩者對(duì)解除塊莖休眠同等重要并相互影響。Korableva等[6]用人工合成的BR類(lèi)似物24-表油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide, 24-eBL)約21 nmol L–1處理塊莖可延遲萌芽36~38 d, 增加乙烯形成及ABA的含量, 使分生組織各細(xì)胞體積縮小, 并增加液泡數(shù)目, 認(rèn)為BR促進(jìn)休眠。

BR是一類(lèi)甾醇類(lèi)植物激素, 參與調(diào)控多種生理過(guò)程, 如氣孔形成、植株形態(tài)建成、開(kāi)花、維管束發(fā)育、種子萌發(fā), 外源BR能提高脅迫抗性[7-9]。對(duì)擬南芥和水稻BR的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程已有較為深入的研究。BR合成酶基因的缺失突變體大多矮化、生長(zhǎng)緩慢, 如Δ(7)-甾醇-5-脫氫酶(delta (7)- sterol-c5(6)-desaturase, SC5DL或STE1或ERG3)、Δ24-甾醇還原酶1 (delta24-sterol reductase, DWF1)、BR-6-氧化酶1/2 (brassinosteroid-6-oxidase1/2, BR6OX1/2或cytochrome, P45085A1/2 CYP85A1/2)的突變體[10-12]。如圖1所示, BR受體為BRI1 (protein brassinosteroid insensitive 1), 此外還有共受體BAK1及其同源蛋白SERKs家族, 在這些共受體的配合下, BRI1感知BR信號(hào), 并激活激酶BSK (BR-signaling kinase)來(lái)啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程, 通過(guò)一系列磷酸化和去磷酸化激活細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子, 活化的轉(zhuǎn)錄因子BZR1/2可促進(jìn)與細(xì)胞分裂及生長(zhǎng)相關(guān)的基因表達(dá), 而在調(diào)節(jié)葉片角度方面, 活化的轉(zhuǎn)錄因子LIC則對(duì)BZR1/2起拮抗作用[13-15]。編碼細(xì)胞周期蛋白(D-type cyclin family 3)參與細(xì)胞分裂調(diào)控, 基因編碼木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶(xyloglucan endotransglycosylase, XTH)能松弛細(xì)胞壁使細(xì)胞得以伸長(zhǎng), 已知這2個(gè)基因都受BR信號(hào)激活表達(dá)[16-17]。

前期分析休眠和萌芽塊莖的基因表達(dá)譜, 發(fā)現(xiàn)BR合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的大多數(shù)基因表達(dá)量在萌芽塊莖中顯著升高, 這與Korableva認(rèn)為BR促進(jìn)塊莖休眠的結(jié)論不同[6]。同時(shí), 生產(chǎn)上常用的催芽劑GA3存在對(duì)中、長(zhǎng)休眠期品種的催芽效果弱且處理濃度和時(shí)間不易掌控, 造成芽細(xì)弱等問(wèn)題。為進(jìn)一步確認(rèn)BR在塊莖休眠、萌芽中的作用, 評(píng)價(jià)其調(diào)節(jié)種薯萌芽的潛力, 尋找更為有效的催芽方法。本研究選擇休眠期不同的3個(gè)品種為材料, 以qRT-PCR檢測(cè)與BR合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的9個(gè)基因的表達(dá)量在塊莖貯藏期間以及抑芽物質(zhì)處理下的變化特點(diǎn)。這9個(gè)基因分別是與BR合成相關(guān)的、、、, BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成員、, 信號(hào)激活的基因、(圖1中的實(shí)心框)。同時(shí), 比較24-eBL及其與GA3配合處理對(duì)塊莖萌芽和后期生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

短休眠期品種費(fèi)烏瑞它(Favorita, FR)、中等休眠期品種米拉(Mira, MR)、長(zhǎng)休眠期品種壩薯10號(hào)(Bashu 10, BS)的脫毒薯, 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究開(kāi)發(fā)中心提供。

TRIzol、焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自Invitrogen, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis購(gòu)自Thermo, 引物及熒光染料SGExcel FastSYBR Mixture購(gòu)自上海生工。24-eBL、油菜素內(nèi)酯專(zhuān)一性抑制劑蕓苔吡咯(Brassinazole, BRZ)購(gòu)自Sigma- Aldrich。其他常規(guī)試劑如氯仿、乙醇、赤霉素(GA3)等購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。

1.2 塊莖貯藏和取樣

分別挑選3個(gè)品種的新收原原種(約7~10 g 粒–1), 常溫下愈傷化14 d后裝入密封硬紙盒貯藏, 每盒約80~100粒, 各5盒。另選費(fèi)烏瑞它, 裝盒后加入前期項(xiàng)目組篩選的揮發(fā)性抑芽物質(zhì)A和B處理。在(23±2)℃室內(nèi)貯藏以上樣品。另選費(fèi)烏瑞它放于4℃冷庫(kù)貯藏。取樣時(shí)間如表1所示, 在萌芽(芽長(zhǎng)2~3 mm, 塊莖解除休眠)時(shí)間點(diǎn)取樣后即結(jié)束該品種的貯藏, 3個(gè)品種約在49、70和98 d結(jié)束貯藏。以頂部芽眼為中心, 用直徑3 mm, 高5 mm圓管打孔取圓柱體, 用液氮速凍后保存于–80℃用于RNA提取。

1.3 用qRT-PCR測(cè)定基因表達(dá)變化

用TRIzol法提取RNA并用低濃度乙醇、高鹽、凍融等方式去除多糖。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 在20 μL體系中依次加入Oligo dT 1 μL、RNA 3 μL、DEPC處理水8 μL, 65℃5 min, 冰上急冷2 min; 再按序加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL、RNase抑制劑 (20 U μL–1) 1 μL、10 mmol L–1dNTPs混合物2 μL、Reverse Transcriptase ( 200 U μL–1) 1 μL。42℃60 min, 72℃10 min終止反應(yīng)。參考http://solanaceae.plantbiology. msu.edu/cgi-bin/annotation_report.cgi基因序列, 利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)各基因的特異性引物(表2)。根據(jù)基因表達(dá)譜, 選擇表達(dá)量在休眠、萌芽和抑芽3種狀態(tài)下都穩(wěn)定的基因作內(nèi)參。

熒光定量PCR體系25 μL, 含RNase-Free ddH2O 10.5 μL、2× SGExcel FastSYBR混合物12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 20 s; 40循環(huán), 95℃3 s, 退火/延伸58~60℃ 30 s。熔解曲線分析為95℃ 10 s, 65℃ 5 s, 95℃5 s。Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀檢測(cè), 采用2–ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[18], 以貯藏0 d時(shí)費(fèi)烏瑞它的ΔCt值為對(duì)照。將3次試驗(yàn)重復(fù)所提的3管RNA混合后反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作3次熒光定量技術(shù)重復(fù)。由于一些基因的相對(duì)表達(dá)量在品種間的變化幅度大(如0.10~229.11), 為同時(shí)反映低數(shù)值間的高幅度變化, 在品種間比較時(shí)將相對(duì)表達(dá)量換算成以10為底的對(duì)數(shù)值, 以體現(xiàn)貯藏初、中期表達(dá)量數(shù)值低時(shí)的變化趨勢(shì)。

表1 各處理在貯藏期間的取樣時(shí)間

表2 用于qRT-PCR檢測(cè)的基因引物序列

1.4 用24-eBL和BRZ處理塊莖離體芽眼部位

以費(fèi)烏瑞它原原種的芽眼為中心, 取直徑4 mm, 高5 mm的圓柱體, 分別用500 nmol L–124-eBL、60 μmol L–1GA3、24-eBL+GA3、100 μmol L–1BRZ+GA3浸泡20 min, 以蒸餾水為對(duì)照, 放入培養(yǎng)皿中于黑暗(22± 2)℃下離體保濕培養(yǎng)3 d后在體視鏡下觀察萌動(dòng)情況。

1.5 24-eBL及其與GA3互配對(duì)塊莖萌芽和植株生長(zhǎng)的影響

取費(fèi)烏瑞它、米拉的原原種和費(fèi)烏瑞它的原種, 用GA3、24-eBL和24-eBL+GA3浸泡種薯, 濃度同1.4, 每處理3盒, 在(23±2)℃下放置, 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、芽直徑。待對(duì)照芽長(zhǎng)約2~5 mm時(shí)將薯塊露天盆栽, 生育期為9月初至12月初, 測(cè)定單株結(jié)薯重量。另取費(fèi)烏瑞它原原種用相同溶液浸泡后于(10±2)℃黑暗貯藏60 d, 散射光下放置約10 d, 比較芽的萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種萌芽比較和BR合成基因表達(dá)量變化

3個(gè)品種的休眠期明顯不同, 費(fèi)烏瑞它在50 d時(shí)有70%左右薯塊萌芽, 多數(shù)芽長(zhǎng)為1~3 mm, 而此時(shí)另2個(gè)品種沒(méi)有萌動(dòng)跡象。70 d時(shí)費(fèi)烏瑞它芽長(zhǎng)已有7~8 mm, 米拉可見(jiàn)明顯的芽萌發(fā), 壩薯10號(hào)部分薯塊的芽眼開(kāi)始露白(圖2)。

如圖3所示, 4個(gè)基因的表達(dá)量在品種間的變化趨勢(shì)一致, 均隨時(shí)間升高, 只是升高的時(shí)間點(diǎn)和幅度不同。短休眠品種費(fèi)烏瑞它在7 d時(shí)就開(kāi)始升高, 21 d時(shí)非常明顯, 為0 d的3~7倍。中、長(zhǎng)休眠品種米拉和壩薯10號(hào)的這4個(gè)基因表達(dá)量直到49 d 時(shí)才開(kāi)始有2~5倍的小幅上升。費(fèi)烏瑞它的這4個(gè)基因表達(dá)量在萌芽時(shí)(49 d)均達(dá)到最高, 米拉和壩薯10號(hào)則在63 d后才大幅上升。推測(cè)BR合成與塊莖由休眠狀態(tài)向萌芽轉(zhuǎn)變密切相關(guān), 中、長(zhǎng)休眠品種的BR合成明顯晚于短休眠品種。

FR: 費(fèi)烏瑞它; MR: 米拉; BS: 壩薯10號(hào)。FR: Favorita; MR: Mira; BS: Bashu 10.

同時(shí)可以看出參與BR前體物質(zhì)菜油甾醇(Campesterol)合成的基因、和變化模式相似。費(fèi)烏瑞它和壩薯10號(hào)萌芽前, 3個(gè)基因的表達(dá)均存在平臺(tái)期或小幅下滑, 到萌芽時(shí)又迅速升高; 而米拉則是在萌芽前達(dá)到最高, 到萌芽時(shí)反而略有下降。參與BR合成最后幾步反應(yīng)的在米拉中的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于另2個(gè)品種, 由此推測(cè)米拉萌芽所需的BR水平可能低于另2個(gè)品種, 所以即使壩薯10號(hào)的基因轉(zhuǎn)錄升高的時(shí)間點(diǎn)略早于米拉, 但萌芽時(shí)間仍晚于米拉。

2.2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因的表達(dá)變化

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控的5個(gè)基因中,和在品種間均呈升高的趨勢(shì), 而和在費(fèi)烏瑞它中變幅大, 在另2個(gè)品種中變化小(圖4)。在費(fèi)烏瑞它和壩薯10號(hào)萌芽前有小幅下滑, 短休眠品種的轉(zhuǎn)錄本積累早于中、長(zhǎng)休眠品種, 這同BR合成基因的變化相似; 并且1從初始到萌芽升高倍數(shù)在品種間相似。變化具有很強(qiáng)的品種特異性, 在費(fèi)烏瑞它中呈線性升高, 萌芽時(shí)為初始的70倍; 而另2個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄本在整個(gè)貯藏期間均保持較恒定水平。貯藏期間在3個(gè)品種中的變化均較小, 費(fèi)烏瑞它萌芽與初始相比也僅提高2倍(圖未列出)?？赡茉撧D(zhuǎn)錄因子已存在于分生組織中, 只是處于非活性狀態(tài), 合成BR后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)讓其活化進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)。

表達(dá)變化的規(guī)律性差, 在費(fèi)烏瑞它中呈N字型, 在米拉和壩薯10號(hào)中表達(dá)量低, 除萌芽前有明顯下降, 其余時(shí)間保持恒定水平。貯藏21 d前, 費(fèi)烏瑞它的低于米拉和壩薯10號(hào), 但之后三者的表達(dá)量呈近乎一致的升高, 在費(fèi)烏瑞它萌芽后, 米拉和壩薯10號(hào)的表達(dá)量繼續(xù)上升, 但費(fèi)烏瑞它的升幅最大, 為59倍。

2.3 抑芽處理對(duì)基因表達(dá)的影響

如圖5所示, 貯藏50 d時(shí)CK有1~3 mm完整小芽, 處理A使芽畸形, 且頂端有壞死, 處理B的芽組織此時(shí)已完全壞死, 即抑芽物質(zhì)B的抑芽能力明顯強(qiáng)于A。圖6列出了4種典型的基因表達(dá)變化模式,在早期便受物質(zhì)A刺激, 到7 d時(shí)達(dá)到最高值并高于同期CK值, 之后一直處于低水平; 抑芽能力更強(qiáng)的物質(zhì)B處理則使該基因的轉(zhuǎn)錄本在整個(gè)貯藏期間都保持極低水平(0.16~1.70)。其他3個(gè)涉及BR合成的基因表達(dá)模式與之相似。

和變化相似, 在貯藏早期均受2種抑芽物質(zhì)的誘導(dǎo), 在7 d或21 d達(dá)到最高值, 并高于同期CK, 之后下降并一直處于低水平, 遠(yuǎn)低于同期CK。物質(zhì)A處理極大地刺激表達(dá), 在整個(gè)貯藏期間都高于CK, 甚至70 d時(shí)仍高于CK萌芽時(shí)的表達(dá)量; B處理則在7 d時(shí)達(dá)到最高, 為同期CK的7倍, 之后一直處于低水平。物質(zhì)A處理似乎對(duì)的轉(zhuǎn)錄影響較小, 它的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)與CK的幾乎一致, 只是在70 d時(shí)顯著下降到49 d的27.66%, 這與該處理能觀察到畸形芽形成, 但后期死亡的情況相符; 物質(zhì)B刺激該基因表達(dá)升高, 在21 d最大, 是同期CK的3倍, 之后迅速下降并維持在低水平。與BR合成基因的表達(dá)一直受到物質(zhì)B較強(qiáng)的抑制作用不同, 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)基因的表達(dá)被刺激升高, 且升高的時(shí)間點(diǎn)早于物質(zhì)A處理; 同時(shí), 下游響應(yīng)基因受2種物質(zhì)刺激升高的倍數(shù)遠(yuǎn)大于合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。除外, 其余基因的表達(dá)在4℃低溫下明顯受抑, 49 d時(shí)表達(dá)量只有同期CK的0.64%~13.73%。的表達(dá)量在各抑芽處理下仍然沒(méi)有明顯變化。

2.4 BR處理對(duì)塊莖萌芽和生長(zhǎng)的影響

上述結(jié)果表明BR合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控活動(dòng)在塊莖從休眠到萌芽過(guò)程中呈增強(qiáng)趨勢(shì), 抑芽處理在貯藏中、后期顯著抑制這些生理過(guò)程, 那么外源BR對(duì)塊莖萌芽是否有促進(jìn)作用？試驗(yàn)用24-eBL處理不同品種、不同級(jí)別的種薯, 以探明BR在塊莖萌芽中的作用及其對(duì)植株后續(xù)生長(zhǎng)的影響。

2.4.1 對(duì)塊莖離體芽眼部位萌芽的影響 在預(yù)試驗(yàn)中用5、50、500、5000 nmol L–124-eBL處理薯塊, 發(fā)現(xiàn)5 nmol L–1對(duì)塊莖休眠影響不大, 而50 nmol L–1和500 nmol L–1均有促進(jìn)塊莖解除休眠的作用, 并且后者的效果和整齊度更好, 而5000 nmol L–1可能因濃度過(guò)高造成內(nèi)源BR的代謝紊亂而表現(xiàn)出抑制作用, 所以本試驗(yàn)選擇500 nmol L–1。離體培養(yǎng)費(fèi)烏瑞它的芽眼部位, 3 d后如圖7, 24-eBL和GA3都能解除芽眼部位的休眠狀態(tài), 促進(jìn)萌芽。在GA3中添加BRZ則減弱了前者促芽生長(zhǎng)的作用。24-eBL和GA3配合處理在此時(shí)看不到與單獨(dú)使用時(shí)的差異。

2.4.2 對(duì)塊莖萌芽和芽生長(zhǎng)的影響 表3列出在(23±2)℃貯藏, 費(fèi)烏瑞它原原種的發(fā)芽率、芽長(zhǎng)和直徑在各自差異最明顯時(shí)期的對(duì)比。各處理都能促進(jìn)塊莖解除休眠, 在35 d時(shí)的發(fā)芽率均極顯著高于CK, 24-eBL+GA3配合處理的效率最高。GA3不僅利于解除休眠還促進(jìn)芽生長(zhǎng), 55 d時(shí)長(zhǎng)度約為CK的5倍, 但CK和GA3均有芽長(zhǎng)不整齊的問(wèn)題。24-eBL處理的長(zhǎng)度與CK相似, 但表現(xiàn)更整齊, 對(duì)比發(fā)芽率和芽長(zhǎng)可以看出24-eBL雖促進(jìn)休眠解除但不支持芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。24-eBL+GA3的芽長(zhǎng)介于單獨(dú)處理之間, 芽最為健壯, 整齊性較好。

FR: 馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它; A和B為不同的抑芽物質(zhì)。

FR: potato variety Favorita; A and B represent different sprouting-inhibitor.

表3 各處理的原原種發(fā)芽情況對(duì)比

同一列不同字母表示差異達(dá)極顯著水平(0.01)。

Values followed by different letters within a column are significantly different at<0.01.

在(10±2)℃貯藏60 d后于散射光下放置10 d, 也得到了與上述相似的結(jié)果, 且芽長(zhǎng)和整齊度對(duì)比更為明顯(圖8)。CK有72.97%的薯塊發(fā)芽, 但芽長(zhǎng)不整齊。24-eBL使所有薯塊解除休眠, 84.61%的芽長(zhǎng)在5 mm左右, 生長(zhǎng)整齊。GA3處理芽細(xì)長(zhǎng), 超過(guò)40 mm。24-eBL+GA3的芽長(zhǎng)仍然介于單獨(dú)處理之間。

CK: 發(fā)芽不整齊, 其中27.03%未萌芽; 24-eBL: 薯塊整齊萌芽; GA3: 芽徒長(zhǎng)超過(guò)40 mm; 24-eBL +GA3: 芽更為健壯, 長(zhǎng)度介于GA3和24-eBL之間。

CK: irregular germination, 27.03% tuber was not germinated; 24-eBL: sprouting uniformly; GA3: shoot length was over 40 mm; 24-eBL+GA3: the bud grew stronger and the shoot length was between those of GA3treatment and 24-eBL treatment.

2.4.3 對(duì)植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響 無(wú)論是費(fèi)烏瑞它不同級(jí)別的種薯, 還是同一級(jí)別費(fèi)烏瑞它和米拉2個(gè)品種, 各處理均使結(jié)薯提前。圖9所示為米拉原原種植株的生長(zhǎng)情況, 可看到各處理均有匍匐莖和其頂端膨大形成的薯塊, 而CK還未形成匍匐莖或匍匐莖還未膨大結(jié)薯。各處理的結(jié)薯情況與其芽健壯程度密切相關(guān), 24-eBL+GA3處理的芽最為健壯, 其植株長(zhǎng)勢(shì)和結(jié)薯也最佳; GA3處理的植株地上部雖然比24-eBL的茂盛, 但結(jié)薯整齊性不如后者; CK萌芽時(shí)間和芽長(zhǎng)不整齊, 植株間的差異也非常明顯。各處理單株薯塊重量均高于CK, 在不同級(jí)別和不同品種中24-eBL+GA3的薯塊重量均最高, 相對(duì)于CK分別高75.20%、37.92%和98.41% (表4)。結(jié)薯增幅如此明顯除有激素處理影響塊莖形成外, 可能也與CK出苗晚結(jié)薯遲, 而秋季生長(zhǎng)季節(jié)偏短有關(guān)。24-eBL的產(chǎn)量與GA3的差異不顯著, 但各單株產(chǎn)量的整齊度高于GA3。

箭頭示匍匐莖頂端形成的膨大塊莖。

Arrows show enlarging tuber on the top of stolon.

表4 不同品種和級(jí)別的種薯收獲的單株薯塊重量比較

同一列不同大小寫(xiě)字母分別表示在0.01和0.05的水平上差異顯著。

Values followed by different capitals or lowercases in the vertical line are significant difference at the 0.01 or 0.05 probability levels.

3 討論

研究表明BR參與多種生理過(guò)程特別是生長(zhǎng)發(fā)育, 擬南芥缺失突變體矮化, 轉(zhuǎn)入酵母的基因能使其恢復(fù)生長(zhǎng)[19]。Δ24-甾醇還原酶(DWF1)催化合成BR前體油菜甾醇, 是BR合成中的關(guān)鍵酶, 擬南芥中其編碼基因突變體的BR含量降低且植株矮化[11]。BR6OX (亦寫(xiě)作CYP85A)催化合成BR, 擬南芥的和雙突變體表現(xiàn)出矮化表型[12]。本試驗(yàn)中參與BR合成的4個(gè)基因、、和表達(dá)量均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高, 抑制它們表達(dá)造成塊莖萌芽受阻, 說(shuō)明BR是塊莖解除休眠和萌芽所必需的信號(hào)物質(zhì)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因中和的表達(dá)模式在3個(gè)品種中相似,和則在品種間有明顯差異。在塊莖由休眠向萌芽轉(zhuǎn)變中, 品種間以及抑芽處理下表達(dá)量均無(wú)明顯變化, 推測(cè)它編碼的蛋白可能已隨塊莖膨大而積累, 只是處于磷酸化失活狀態(tài), BR信號(hào)激活蛋白而不是刺激轉(zhuǎn)錄, 來(lái)調(diào)控塊莖生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。對(duì)比這9個(gè)基因變化的幅度、品種間的規(guī)律性, 認(rèn)為在調(diào)控塊莖生理狀態(tài)上, 改變BR合成可能比調(diào)節(jié)信號(hào)因子和下游基因更直接有效。

抑芽物質(zhì)在貯藏期間極大地刺激了受BR調(diào)控的下游基因和的表達(dá), 它們的變幅遠(yuǎn)高于BR合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因, 這反映出下游基因受到除BR外的其他響應(yīng)脅迫因子的調(diào)控。已知編碼木葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶, 能松弛細(xì)胞壁, 這不僅關(guān)乎生長(zhǎng)發(fā)育所涉及的細(xì)胞分裂, 同時(shí)也與防御脅迫相關(guān)。通過(guò)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá), 發(fā)現(xiàn)該基因不僅受BR調(diào)控, 冷、熱、黑暗等均可刺激它表達(dá), 并且在BR合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)突變體中也能表達(dá)[20]。本試驗(yàn)中兩種抑芽物均可刺激升高, 并且它本身的變化在品種間的規(guī)律性不強(qiáng), 說(shuō)明該基因可能參與多個(gè)生理過(guò)程, 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄變化復(fù)雜。

種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)都離不開(kāi)內(nèi)源激素的調(diào)控, BR與ABA、GA互作共同調(diào)控上述生理過(guò)程。轉(zhuǎn)入BR合成關(guān)鍵酶基因4的擬南芥克服了ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[21], 同時(shí)外源BR處理還能提高番茄種子在脅迫下的萌發(fā)能力[22], 進(jìn)一步研究揭示BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2 和 ABSCISIC ACID INSENSITIVE5的互作, 使得BR在ABA抑制種子萌芽中起重要的拮抗作用[23]。除此以外, BR和GA在代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中存在多方面的互作, GA信號(hào)中的DELLAs 能直接結(jié)合BR信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子BZR1并抑制其DNA結(jié)合活性, GA信號(hào)能降解DELLAs, 解除其對(duì)BZR1的抑制作用使BR信號(hào)通路運(yùn)行[24-25]; 水稻中的BZR1能結(jié)合合成GA的重要基因的啟動(dòng)子, 促進(jìn)或抑制GA合成從而調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng); 同時(shí)GA能夠反饋抑制BR的生物合成和響應(yīng)[26]。已知ABA促進(jìn)馬鈴薯塊莖休眠, GA3則促進(jìn)萌芽, 塊莖從休眠向萌芽的轉(zhuǎn)變中ABA含量下降、GA3含量升高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BR在塊莖生理狀態(tài)轉(zhuǎn)變中扮演重要角色, 不僅其合成基因的表達(dá)量隨時(shí)間升高, 外源BR處理能促進(jìn)休眠解除和萌芽; 同時(shí)BR與GA3互配處理的發(fā)芽率高于單獨(dú)處理。BR促進(jìn)塊莖休眠解除是否是它對(duì)ABA有拮抗作用, 與GA在促進(jìn)萌芽方面有怎樣的特殊互作機(jī)制, 這些問(wèn)題都還需進(jìn)一步研究。Korableva等[6]用21 nmol L–124-eBL處理完整塊莖可延遲萌芽36~38 d, 與本試驗(yàn)BR處理所表現(xiàn)出的解除休眠作用相反, 兩者的差異可能是不同品種對(duì)外源24-eBL濃度響應(yīng)不同造成。

在水稻中的研究表明0.1 nmol L–124-eBL促進(jìn)單個(gè)懸浮細(xì)胞伸長(zhǎng), 而1000 nmol L–1抑制細(xì)胞伸長(zhǎng), 但明顯促進(jìn)細(xì)胞和微絲骨架分裂[27], 這與本試驗(yàn)500 nmol L–124-eBL促進(jìn)塊莖解除休眠而萌芽, 但抑制芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)相似。此外, 24-eBL還能抑制GA3處理造成的芽徒長(zhǎng)現(xiàn)象, 兩者互配作用使芽長(zhǎng)介于單獨(dú)處理之間。Zullo和Adam發(fā)現(xiàn)24-eBL噴施植株可使單株水稻種子鮮重增加22.0%, 干重增加31.5%[28]。在小麥花期外施24-eBL能提高籽粒的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶活性, 提高淀粉含量和品質(zhì)[29]。改變內(nèi)源BR含量或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性可以獲得更高的產(chǎn)量并且植株表現(xiàn)更為整齊[30]。通過(guò)轉(zhuǎn)入基因提高BR含量, 可使水稻單株粒重增加15%~44%, 進(jìn)一步研究表明增加BR促進(jìn)了葡萄糖向淀粉的同化作用[31]。Schr?der等[32]通過(guò)分析BRZ處理和BR缺乏突變體, 認(rèn)為BR促進(jìn)生長(zhǎng)是靠增加碳源、能量的供應(yīng)和利用。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)24-eBL處理明顯促進(jìn)結(jié)薯提前, 增加單株薯塊重量相似, 推測(cè)BR可能促進(jìn)葉片中合成的蔗糖向塊莖轉(zhuǎn)運(yùn)以及向淀粉的同化、積累。

4 結(jié)論

BR是塊莖解除休眠和萌芽所必需的信號(hào)物質(zhì), 抑制它的合成基因表達(dá)會(huì)造成塊莖萌芽受阻, 而它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控則是塊莖生理狀態(tài)轉(zhuǎn)變所必經(jīng)的過(guò)程。外源24-eBL具有解除塊莖休眠作用, 但不促進(jìn)芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。24-eBL與GA3存在互作效應(yīng), 兩者配合處理可改變常規(guī)GA3單獨(dú)處理造成的種薯特別是原原種萌芽不整齊、芽徒長(zhǎng)問(wèn)題, 使塊莖達(dá)到更佳生理狀態(tài), 獲得更高產(chǎn)量。

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Expression Changes of Genes Related to Brassinosteroid Biosynthesis and Signal Transduction during Potato Storage and Its Effect on Tuber Sprouting

ZOU Xue1,2, DENG Meng-Sheng2, LI Li-Qin2, YU Jin-Long1, DING Fan1, HUANG Xue-Li2, PENG Jie2, SHUAI Yu2, CAI Cheng-Cheng2, and WANG Xi-Yao2,*

1Mianyang Academy of Agricultural Sciences, Mianyang 621023, China;2College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

To explore the role of brassinosteroid (BR) in tuber sprouting and establish effective sprouting regulation system for seed potato, three varieties and sprouting-inhibitor treatments were used to analyze expression characteristics of nine genes related to BR synthesis, signal transduction and regulation during storage. Effects of BR analogue 24-epibrassinolide (24-eBL) and gibberellin (GA3)on tuber sprouting were also studied. The transcript levels of four genes involved in BR synthesis increased with prolonging storage time, and the time points at which the expression levels began to increase in variety with short dormancy period were earlier than those in varieties with middle or long dormancy period. The expression patterns ofandwere similar to those of synthetic genes whileandremained constant in varieties with middle or long dormancy period. Sprouting-inhibitors stimulated transcripts of those genes to elevate in the earlier stage of storage, then rapidly decline and stay low levels. There was no significant expression change of transcription factorin varieties and sprouting-inhibitor treatments during storage. BR analogue 24-eBL was favorable to tuber dormancy release but shoot growth. The tuber weight per plant treated with 24-eBL and GA3mixture increased by 37.92% to 98.41% compared with CK. The conclusion, BR synthesis and its signal transduction are essential physiological processes from dormancy to sprouting in potato tuber. Mixture of 24-eBL and GA3can facilitate uniformity of seed potato sprouting, stronger growth and better tuberization.

Potato; Tuber sprouting; Brassinosteroid; Gene expression

本研究由現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川薯類(lèi)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(川農(nóng)業(yè)函[2014] 91號(hào)), 四川省科技廳公益性育種攻關(guān)項(xiàng)目(2016NYZ0032)和綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院創(chuàng)新基金項(xiàng)目(cxjj462016-2019) 資助。

This study was supported by the Sichuan Potato Innovation Team Program of Chinese Modern Agricultural Industrial Technology System (Agricultural Department of Sichuan Province Document [2014] No. 91), the Breeding Program for Public Welfare of Science & Technology Department of Sichuan Province (2016NYZ0032), and the Innovation Fund of Mianyang Academy of Agricultural Sciences (cxjj462016-2019).

(收稿日期): 2016-10-06; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00811

(Corresponding author): 王西瑤, E-mail: wxyrtl@163.com

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1001.008.html