江 晨，林榮麗，畢 潔，于麗娜，張初署，王明清，馮楚楚，張建成，孫 杰*，徐同城

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266600；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南 250100)

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微波輔助酶解花生粕同步提取多糖和抗氧化肽的工藝研究

江 晨1，林榮麗2，畢 潔1，于麗娜1，張初署1，王明清1，馮楚楚1，張建成1，孫 杰1*，徐同城3

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266600；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東 濟(jì)南 250100)

本文以花生餅粕為原料通過微波輔助堿性蛋白酶(Alcalase)水解技術(shù)同步提取花生多糖和抗氧化肽，研究了提取反應(yīng)時間、底物濃度、加酶量及pH值等因素對提取花生多糖和抗氧化肽抗氧化活性的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面分析實驗。結(jié)果表明，花生多糖和抗氧化肽的最佳同步提取條件為：底物濃度12%，加酶量0.8mL，反應(yīng)液pH值8.0，溫度50℃。

花生粕；響應(yīng)面實驗；多糖；抗氧化肽；提取工藝

花生粕是花生仁經(jīng)壓榨煉油后的副產(chǎn)品，花生榨油后的花生粕中含蛋白質(zhì)44%以上[1]，大部分作動物飼料利用。國內(nèi)外研究表明[2-4]，花生蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解得到的多肽類具有特殊的生理功能，如抗高血壓、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)生長、抗血栓、激素作用、降膽固醇、改善元素吸收和礦物質(zhì)運輸、抑制細(xì)菌、病毒和抗癌作用等?；ㄉ嚯幕钚愿?、應(yīng)用范圍廣，近年來成為研究和應(yīng)用的熱點[5-8]?；ㄉ芍谐写罅康牡鞍踪|(zhì)外，糖類物質(zhì)也是花生粕中主要組成成分，僅次于蛋白質(zhì)?；ㄉ芍锌扇芙庑蕴呛扛哌_(dá)32.50%[9]。大量臨床以及藥理研究表明，多糖具有降血糖、調(diào)節(jié)免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)造血系統(tǒng)、保護(hù)肝臟等多種生物活性[10-13]。花生粕中多糖提取工藝有傳統(tǒng)的熱水浸提、酸提法、堿提法，但是傳統(tǒng)方法對多糖結(jié)構(gòu)有一定的破壞，提取效率低。近幾年來用酶解技術(shù)和超聲技術(shù)提取多糖成為熱點；其中酶解法提取多糖的條件比較溫和，可加速多糖的釋放或提取[14]。

花生多肽和多糖都是具有多種生物功能的活性物質(zhì)，之前有大量關(guān)于花生多肽及多糖的提取以及抗氧化性的研究[15-22]，但是沒有二者同步提取技術(shù)的報道，本文以花生粕為原料，探討了利用微波輔助酶解技術(shù)同步提取花生多糖和抗氧化肽的工藝條件，為花生粕中同步提取多糖和抗氧化肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

DE-500g萬能高速粉碎機(衢州普潤日用品有限公司)；KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)； XH-100A型祥鵠電腦微波催化合成/萃取儀 (北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)； WFZ UV-4802 型紫外可見分光光度計 (尤尼可儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生粕同步提取多糖和抗氧化肽基本工藝

花生粕→脫脂→抽濾→收集濾液→濾渣按實驗設(shè)計提取→抽濾→收集濾液→活性檢測

① 花生粕脫脂：取200g花生粕，于烘箱中烘干。烘干后的花生粕研磨成粉末，以1∶10(m/v)的比例加入石油醚，30℃震蕩5h，隨后抽濾。濾渣置于通風(fēng)櫥內(nèi)去除殘余石油醚，收集脫脂后的花生粕，于干燥器中備用。

② 超聲溶解：取脫脂后的花生粕28.8g，加入480mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌溶解。然后在超聲波清洗器中，在一定條件下超聲溶解30min。

③ Alcalase蛋白酶水解花生粉：將上述液體在一定pH值下，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)，在微波催化/合成儀中以微波反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅活10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。

④ 制備抗氧化肽和多糖溶液：酶解溶液經(jīng)3000r/min離心10min，上清液倒入100mL三角瓶中，離心后的沉淀用少量蒸餾水洗滌后，再經(jīng)3000r/min離心10min，上清液與第一次離心的上清液合并后，倒入100mL容量瓶中，用少量蒸餾水清洗三角瓶，清洗液也倒入100mL容量瓶，用蒸餾水定容，作為酶解液待測樣品。

⑤ 清除DPPH自由基及清除羥自由基抗氧化活性檢測參照Amarowicz[23]及徐懷德方法[24]。

1.2.2 單因素實驗

分別以不同反應(yīng)時間、底物濃度、加酶量、微波功率、pH值和溫度為因素，考察各單因素對花生多糖和抗氧化肽的清除DPPH自由基及清除羥自由基抗氧化活性的影響。

① 反應(yīng)時間對花生多糖和抗氧化肽提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)0.8mL(底物濃度為6%)，在微波催化/合成儀中以700W微波功率，50℃ 的溫度，微波反應(yīng)時間分別為6、8、10、12、14和16min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.2.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

② 底物濃度對花生多糖和抗氧化肽提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)0.8mL(調(diào)節(jié)底物濃度分別為4%，6%，8%，10%，12%，14%)，調(diào)節(jié)在微波催化/合成儀中以700W微波功率，50℃的溫度，微波反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.2.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

③ 加酶量對花生多糖和抗氧化肽提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到8.0，分別加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1) 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6mL(底物濃度為6%)，在微波催化/合成儀中以700W微波功率，50℃的溫度，微波反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.2.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

④ pH值對花生多糖和抗氧化肽的提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH到7.0，7.5，8.0，8.5，9.0和9.5，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)0.8mL(底物濃度為6%)，在微波催化/合成儀中以700W微波功率，50℃ 的溫度，微波反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.2.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

⑤ 微波功率對花生多糖和抗氧化肽提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)0.8mL(底物濃度為6%)，在微波催化/合成儀中分別以500W，600W，700W，800W，900W和1000W微波功率，50℃ 的溫度，微波反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.2.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

⑥ 反應(yīng)溫度對花生多糖和抗氧化肽提取率的影響。超聲溶解后的花生餅粕溶液用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，加入Alcalase酶液(溶液∶酶液=100∶1)0.8mL(底物濃度為6%)，在微波催化/合成儀中以700w微波功率，分別以45℃，50℃，55℃ ，60℃ 和65℃ 的溫度，微波反應(yīng)時間為10min。反應(yīng)結(jié)束后，放入100℃水浴中滅酶10min。滅酶結(jié)束后，立即用冰水浴冷卻到室溫。按照1.3.1方法制備抗氧化肽和多糖溶液，檢測抗氧化活性。

1.2.3 Alcalase 蛋白酶水解花生粕響應(yīng)面涉及實驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定微波催化儀的功率為700W，反應(yīng)時間為14min，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案，以底物濃度、加酶量、pH、微波反應(yīng)溫度4個因素，用Design expert 7.0軟件設(shè)計了四因素三水平的試驗組合，實驗設(shè)計見表1。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 反應(yīng)時間對多糖和多肽抗氧化活性影響

圖1可看出，提取液的羥基自由基清除率隨著反應(yīng)時間延長出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在反應(yīng)時間為14 min的時候，提取液的羥基自由基清除率高達(dá)99.707%，DPPH清除率達(dá)92.29%，提取液的DPPH清除和羥基自由基清除率都是最高的，故這時候多糖和多肽的抗氧化活性最大。

圖1 反應(yīng)時間對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.1 Effect of reaction time on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

2.1.2 底物濃度對多糖和多肽抗氧化活性影響

由圖2可以看出，羥自由基清除率在不同的底物濃度下變化相對明顯，有先升高后降低的趨勢，而DPPH清除率呈逐漸降低的趨勢，最高為90.03%，最低為89.12%，前后變化不大。綜合兩個抗氧化活性檢測結(jié)果，當(dāng)待測樣品底物濃度為12%的時候，羥基自由基清除率高達(dá)99.23%，DPPH清除率是89.27%，此時多糖和多肽的抗氧化性最大。

2.1.3 加酶量對多糖和多肽抗氧化活性影響

由圖3可以看出，隨著Alcalase蛋白酶加入量的提高，羥自由基清除率和DPPH清除率都有略微先升高后下降的趨勢，但是兩者在達(dá)到最高清除率時加酶量是不同的。加酶量為0.8mL時，DPPH清除率最高達(dá)88.194%，此時羥基自由基清除率為97.56%；而加酶量為0.4mL時，羥基自由基清除率達(dá)到最高是98.407%，此時DPPH清除率為87.40%。綜合兩個抗氧化活性檢測結(jié)果，加酶量為0.6～0.8 mL時多糖和多肽抗氧化活性較大。

圖2 底物濃度對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

圖3 加酶量對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.3 Effect of enzyme adding amount on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

圖4 pH對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.4 Effect of pH on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

2.1.4 pH對多糖和多肽抗氧化活性影響

圖4可見，羥自由基清除率隨pH增大而呈現(xiàn)總體增大，而DPPH清除率隨pH增大呈現(xiàn)不斷減小?？傮w來說，pH在7.0～9.0時，提取液的羥自由基清除率保持在97%以上，DPPH清除率保持在75%以上，花生多糖和多肽抗氧化活性較大。

2.1.5 微波功率對多糖和多肽抗氧化活性影響

由圖5可以看出，隨著微波功率的增大，羥自由基清除率和DPPH清除率都有總體的升高趨勢，但是升高的比例不大，考慮到功率的增大對于實驗來說成本比較高，選擇微波功率為700W進(jìn)行了后續(xù)的響應(yīng)面實驗。

圖5 微波功率對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.5 Effect of microwave power on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

2.1.6 溫度對多糖和多肽抗氧化活性影響

由圖6可以看出，不同反應(yīng)溫度下提取的花生多糖和多肽羥自由基清除率隨溫度升高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當(dāng)微波萃取的溫度在55℃時達(dá)到了最大值，高達(dá)99.05%。而DPPH清除率呈現(xiàn)不斷升高趨勢，在65℃時DPPH清除率最大，高達(dá)90.55%，在45℃時清除率為88.63%。其清除率的變化幅度較羥自由基清除率略強。

圖6 溫度對多糖和多肽抗氧化活性影響Fig.6 Effect of temperature on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗

用Design Expert軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對響應(yīng)值顯著的各項，可得樣品的抗氧化活性(Y)與底物濃度(A)、提取溫度(B)、pH值(C)和加酶量(D)之間的多項回歸方程，Y=12.448+2.983A+0.9593B+1.092C-0.678D+0.724AB+0.276AC+0.397AD+0.345BC-0.224BD+0.103CD+2.036A2-1.705B2-1.541C2-1.712D2回歸方程顯著性檢驗及方差分析結(jié)果見表3。

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果

注：Prob>F小于0.05說明模型或考察因素有顯著性影響；Prob>F小于0.01說明影響極顯著。

Note: Prob>F is less than 0.05, which shows that the model has a significant impact on the factors. Prob>F less than 0.01 indicating extremely significant effect.

圖7 加酶量和底物濃度對多糖含量的影響 圖8 溫度和底物濃度對多糖含量的影響Fig.7 Effect of enzyme amount and substrate Fig.8 Effect of temperature and substrate concentration on the antioxidant activity of concentration on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides non starch polysaccharides and peptides

圖9 pH和底物濃度對多糖含量的影響 圖10 pH和加酶量對多糖含量的影響Fig.9 Effect of pH and substrate concentration Fig.10 Effect of pH and enzyme amount on the antioxidant activity of non starch on the antioxidant activity of non starch polysaccharides and peptides polysaccharides and peptides

圖11 溫度和加酶量對多糖含量的影響圖12 溫度和pH對多糖含量的影響Fig.11 Effect of temperature and enzyme Fig.12 Effect of temperature and pH on amount on the antioxidant activity of non the antioxidant activity of non starch starch polysaccharides and peptides polysaccharides and peptides

由表3可見，模型Prob>F值小于0.01，表明該模型回歸方程極顯著，不同的實驗因子之間差異高度顯著，該實驗方法是可靠的。模型相關(guān)系數(shù)的平方即R2為93.42%，回歸方程擬合程度良好，失擬性較小，試驗誤差小，可用該方程代替真實試驗點進(jìn)行分析。各實驗因子對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系，其中A、C、A2、B2、C2、D2對Y值的影響極顯著，B、CD對Y值影響顯著。通過比較方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷影響因子的主次性，本實驗中對花生多糖和多肽提取率影響的大小依次為底物濃度、提取溫度、pH值和加酶量，其中底物濃度對花生多糖和多肽提取率的影響最大。

2.2.2 雙因素交互作用分析

RSM的圖形可以直觀地反應(yīng)各因素對響應(yīng)值的影響，從響應(yīng)面分析圖上可以解析他們之間的相互作用。圖7～12是根據(jù)分析結(jié)果繪制的雙因素交互作用圖譜。

由圖7加酶量與底物濃度的響應(yīng)面圖可知，其交互作用顯著，在加酶量較小時，提取率隨著加酶量升高而增加，到達(dá)一定量后提取率又有減小的趨勢，變化幅度較??；但是隨著底物濃度的升高，變化幅度變大，說明在不同的加酶量條件下，底物濃度對提取率的影響也不同，因此兩者有顯著的交互作用。由圖8溫度與底物濃度的響應(yīng)面分析圖可知，隨著底物濃度的增加，提取率是不斷變大的，但在不同的溫度條件下，其變化的曲線是不相同的，二者交互作用顯著。由圖9 pH值與底物濃度的響應(yīng)面分析圖可知，隨著底物濃度的變化，提取率是不斷變化的，但隨著pH值的增加，其變化的幅度是不相同的，因此二者有明顯的交互作用。由圖10～12的響應(yīng)面分析圖可知，溫度與pH值、pH與加酶量及溫度與加酶量的交互作用明顯，存在極值的條件出現(xiàn)在圓心處。

根據(jù)分析結(jié)果，預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最佳工藝條件為：底物濃度11.89%，加酶量1.2 mL，反應(yīng)液pH值8.04，溫度50.1℃，在此條件下理論多糖提取率為17.95%。為了驗證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用得到的最佳工藝條件進(jìn)行了花生多糖和多肽同步提取實驗，考慮到實際操作的便利，將提取條件修正為將最佳反應(yīng)條件略微調(diào)整為底物濃度12%，加酶量1.2 mL，反應(yīng)液pH值為8.0，溫度50℃。三次平行實驗得到的提取率平均值為17.86%，與預(yù)測值相符，說明響應(yīng)面法對花生多糖和多肽同步提取條件的優(yōu)化是可行的，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

(1) 利用酶解法從花生餅粕中同步提取了花生多糖和多肽，單因素實驗結(jié)果表明在提取溫度40～60℃、底物濃度6%～12%、pH值7.0～9.0和加酶量0.6～1.2mL的范圍內(nèi)，不同提取條件對提取率有顯著影響。

(2) 利用響應(yīng)面分析優(yōu)化了花生多糖和多肽的同步提取條件，得到各因素間回歸方程：Y=12.448+2.983A+0.9593B+1.092C-0.678D+0.724AB+0.276AC+0.397AD+0.345BC-0.224BD+0.103CD+2.036A2-1.705B2-1.541C2-1.712D2

(3) 花生多糖和多肽同步提取的最佳工藝參數(shù)為：底物濃度12%，加酶量1.2 mL，反應(yīng)液pH值為8.0，溫度50℃。

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Microwave Assisted Enzymatic Hydrolysis Technology on Simultaneous Extraction of Polysaccharide and Antioxidant Peptide from Peanut Meal

JIANG Chen1, LIN Rong-li2, BI Jie1, YU Li-na1, ZHANG Chu-shu1, WANG Ming-qing1, FENG Chu-chu1, ZHANG Jian-cheng1, SUN Jie1*, XU Tong-cheng3

(1.Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China; 2. Qingdao Agri. Univ., Qingdao 266600, China; 3. Institute of Agricultural Products, Shandong Academy of Agri. Sci., Jinan 250100, China;)

Peanut polysaccharides and antioxidant peptides were extracted from peanut meal at the same time by using microwave assisted extraction and alkaline protease hydrolysis methods. The factors，such as reaction time, extraction temperature, volume of enzyme and the pH value, which influence the antioxidant activities of the extracted peanut polysaccharides and antioxidant peptides were systematically discussed in this article. Based on the single factor experiments, the response surface analysis results showed that the optimum extraction condition for peanut polysaccharides and antioxidant peptides is：substrate concentration 12%, volume of enzyme 0.8 mL, pH value 8.0, and extraction temperature of 50℃.

peanut meal; response surface experiment; polysaccharide; antioxidant peptide; extraction technology

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.01.008

2016-12-17

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)創(chuàng)新工程(CXGC2016B16)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)項目；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2014QNM22)；山東省自主創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化(2014CGZH0709)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GGX108006)；山東省基金(ZR2016YL021，ZR2016CM43)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2016CGPY10)；山東省農(nóng)科院重大科技成果培育計劃(2016CGPY10)

S565.2099;TS209

A

作者：江晨(1983-)，女，山東青島人，山東省花生研究所農(nóng)藝師，本科，主要從事花生營養(yǎng)與食品加工的研究。

*通訊作者：孫杰，博士，副研究員，主要從事功能食品方面的研究。Tel：0532-87611087，E-mail: sjj605@163.com