邢 奕,王志強,李益飛,洪 晨,3*,沈 茜,楊 強

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不同粒度CuO及與乙基黃原酸鉀復(fù)合污染對土壤脲酶和微生物多樣性的影響

邢 奕1,2,王志強1,李益飛1,洪 晨1,3*,沈 茜1,楊 強1

(1.北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083；2.北京科技大學(xué)工業(yè)典型污染物資源化處理北京市重點實驗室,北京 100083；3.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085)

納米氧化銅不同于常規(guī)的氧化銅,納米氧化銅的尺寸小,比表面積大,對生態(tài)環(huán)境存在潛在危害.本次通過向土壤中加入不同比例的納米氧化銅(N CuO)和微米氧化銅(M CuO)(0,50,200,800,1600mg/kg干土)觀察它們對土壤脲酶活性和細(xì)菌群落的影響.同時,進一步研究了N CuO和M CuO分別與乙基黃原酸鉀(PEX)復(fù)合污染對土壤微生物的影響.N CuO較M CuO對脲酶活性有更強的抑制作用,只有M CuO濃度為1600mg/kg對脲酶的影響較明顯.N CuO對脲酶活性的抑制可能與破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜或刺激細(xì)菌產(chǎn)生活性氧,造成細(xì)菌細(xì)胞的衰退有關(guān),N CuO對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響也較大.N CuO與PEX復(fù)合污染加劇了N CuO對土壤微生物的毒性,使脲酶的活性大幅度降低,細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了較大的變化.N CuO及其復(fù)合污染對土壤微生物的作用機制需進一步研究.通過比較研究N CuO和M CuO的生態(tài)毒性,納米顆粒的生態(tài)毒性更需要引起足夠的重視.

納米氧化銅顆粒；微米氧化銅顆粒；乙基黃原酸鉀；脲酶活性；微生物多樣性

土壤中的納米顆粒比空氣和水中的要多,具有潛在的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險[1-4].目前,有關(guān)納米顆粒的研究多集中在單一或多種工程納米顆粒對土壤微生物量、酶活性、微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響[5-7].而納米顆粒作為礦山開采活動中的一種特殊排放[8],會與礦山藥劑對礦區(qū)土壤造成復(fù)合污染,目前這方面的研究較少.礦區(qū)土壤的復(fù)合污染研究多集中在多種金屬離子和金屬離子與選礦藥劑的復(fù)合污染[9-12].

土壤酶直接參與土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量代謝過程,能反映土壤微生物總體活性,研究表明,脲酶活性與微生物的數(shù)量呈正相關(guān),在土壤氮元素的循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色[13].土壤微生物是氣候和土壤環(huán)境條件變化的敏感指標(biāo),微生物群落的改變是影響土壤功能的簡單又靈敏的指示[14-15].高通量測序技術(shù)具有成本低、通量高和信息豐富等特點[16],實現(xiàn)了大尺度空間上土壤微生物物種和結(jié)構(gòu)多樣性的研究[17-19].與微米顆粒相比,納米顆粒有更大的比表面積、更強的反應(yīng)能力和更大的溶解性,決定了納米顆?？赡軐Νh(huán)境中的微生物有更強的毒性.本次研究了不同尺寸的CuO及與選礦藥劑乙基黃原酸鉀復(fù)合污染對土壤脲酶和微生物多樣性的影響.為金屬納米材料及與其他物質(zhì)復(fù)合污染對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供一定的基礎(chǔ)信息和理論依據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

納米氧化銅(<100nm)、微米氧化銅(500nm~10mm)和乙基黃原酸鉀購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,納米氧化銅(N CuO)為近圓球形粒子,微米氧化銅(M CuO)為不規(guī)則顆粒狀,樣品純度>99.8%.

供試土壤:采樣地區(qū)是位于中國東北部內(nèi)蒙古自治區(qū)的滿洲里市西南方約22km處烏奴格吐山的銅鉬礦周邊的天然牧場.采集五個不同位置的表層土壤(￡20cm),密封于塑料封口袋內(nèi)進行儲存和運輸,運輸過程中將土壤放入加滿冰塊的保溫箱中.帶回實驗室后,將5個土樣混合均勻,一部分在室溫(20°C~25°C)下風(fēng)干,研磨,經(jīng)過2mm的尼龍篩用作土壤理化性質(zhì)的分析,另一部分混合后的土壤稍加研磨過2mm尼龍篩后裝入塑料袋中置于4℃的冰箱內(nèi)保存,用作酶活性及微生物多樣性的分析.

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤的理化性質(zhì)采用常規(guī)的測試方法[20],測定方法和結(jié)果如表1.

表1 土壤基本的理化性質(zhì)

1.3 實驗設(shè)計

取出冷藏于冰箱中的土樣,使其含水率保持在45%,在25℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)7d,以恢復(fù)土壤中微生物的活性.7d之后將土樣繼續(xù)放在25℃的培養(yǎng)箱中,至土樣可以成為粉末狀.將N CuO和M CuO分別以0,50,200,800,1600mg/kg干土的比例加入到土壤中混勻.乙基黃原酸鉀(PEX)配成各種低濃度的母液后,分別以0,10,50,100, 300mg/kg干土的比例加入到土壤樣品中,以不加任何污染物質(zhì)的土壤作為空白對照土壤.加入的方式分為兩種,一種為N CuO、M CuO和PEX單獨加入到土壤中,另一種是加入N CuO和M CuO后再加入PEX進行復(fù)合污染.不同處理后的土壤樣品加入去離子水,使含水率保持在45%,放在溫度為25℃的培養(yǎng)箱中進行黑暗培養(yǎng).在第1,7,14, 21,28d時測定每個土壤樣品的脲酶活性,每個處理設(shè)置三次重復(fù).由于土壤中細(xì)菌的種類較多,為了更明顯的觀察不同污染物對土樣群落結(jié)構(gòu)造成的影響,選擇加入較高濃度污染物的土樣在較長的培養(yǎng)時間后,測定細(xì)菌組成的變化.因此,在培養(yǎng)60d后,測定空白對照土樣Blank和單一污染N CuO(1600mg/kg)、M CuO(1600mg/kg)和PEX(300mg/kg)以及復(fù)合污染的N CuO+PEX (1600+300mg/kg)和M CuO+ PEX(1600+300mg/ kg)這6種加入不同污染物的樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異,每個樣本3次重復(fù),測定結(jié)果取平均值.其中,原始土壤的脲酶活性為0.474mg NH3-N/ (g·h),原始土壤門水平及屬水平的細(xì)菌群落組成情況如圖1.

1.4 土壤酶活性及微生物多樣性的測定方法

本次研究中,脲酶的測定使用靛酚藍(lán)比色法[21].微生物群落多樣性采用高通量測序技術(shù).土壤DNA的提取及PCR擴增如下:土壤DNA使用試劑盒提取.PCR擴增區(qū)域為16S V3-V4,擴增引物為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT).PCR反應(yīng)體系包括:30ngDNA模板、dNTPs(2.5mM) 4μL、10 ×Pyrobest Buffer 5μL、Pyrobest DNA聚合酶0.3μL、正反向引物(10uM) 各2μL和蒸餾水共50μL.PCR擴增程序為:95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s,56℃退火30s和72℃延伸40s共25個循環(huán),72℃最終延伸10min,4℃保溫.配制2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗結(jié)果并純化PCR擴增產(chǎn)物.建立MiSeq文庫并通過Illumina平臺(MiSeq)進行Paired-end 測序.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1 土壤酶活性的數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理使用Microsoft excel 2010和SPSS 21,作圖使用Origin 8.0.酶活性抑制率的計算公式:

酶活性抑制率(%)=100%′(對照-處理)/對照

式中:對照為空白對照組中脲酶的活性,處理為加入不同的污染物后的脲酶活性.

為了進一步了解N CuO、M CuO與PEX是否存在交互作用,計算酶活性的凈變化量△U;

△=(CuO+PEX-blank)-(CuO-blank)-

(PEX-blank)

其中:CuO+PEX表示N CuO或M CuO與PEX復(fù)合污染后測得的土壤脲酶活性;CuO為N CuO和M CuO單獨污染時的土壤脲酶活性;blank表示空白對照土壤的脲酶活性.△=0,表示PEX與N CuO或M CuO之間無交互作用;△>0,二者存在拮抗作用;△<0,二者表現(xiàn)為協(xié)同作用.

1.5.2 細(xì)菌多樣性 通過Illumina平臺(MiSeq)進行Paired-end 測序,下機數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除低質(zhì)量的reads,然后根據(jù)PE數(shù)據(jù)之間的overlap關(guān)系將成對的reads拼接成一條序列.為了得到高質(zhì)量的序列,去除tags兩端的barcode序列及引物序列,引物錯配數(shù)最高為2,利用Mothur軟件去除長度小于200bp的序列及其maxhomop大于10的序列,用Usearch(vertion8.0)軟件去除嵌合體最終得到clean_tags.拼接過濾后的clean_tags,在0.97相似度下利用QIIME (v1.8.0)軟件將16s序列聚類為用于物種分類的OTU,并構(gòu)建稀釋曲線.利用Mothur計算不同隨機樣本的shannon值,各個樣品的物種組成使用QIIME軟件得到,使用R(v3.1.1)軟件繪制稀釋曲線、Shannon-Wiener曲線、韋恩圖和物種組成柱形圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 單一污染對土壤脲酶活性的影響

不同濃度的N CuO、M CuO和PEX單獨加入到土壤后,土壤脲酶的變化見圖2.由圖2a可知,加入不同濃度的N CuO,培養(yǎng)1d后,土壤脲酶活性有所增加,可能是加入N CuO后,殺死部分土壤微生物,從而釋放出一些胞內(nèi)酶,導(dǎo)致脲酶活性暫時升高[13].培養(yǎng)時間越長、濃度越高,N CuO對脲酶的抑制作用越明顯,在培養(yǎng)的第28d時,與空白對照土壤相比,脲酶的活性均顯著降低(￡0.05),抑制率分別為6.18%、8.31%、14.01%和16.32%,可能是由于N CuO的抑菌作用,導(dǎo)致產(chǎn)生脲酶的微生物的活性降低、數(shù)量減少.有研究發(fā)現(xiàn)N CuO對多種細(xì)菌的生長都有抑制作用[22-24],這種抑制作用與N CuO引起細(xì)胞膜損傷有關(guān)[25].同時,納米顆粒會導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生,微生物細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞衰退,最終導(dǎo)致土壤酶的產(chǎn)生和分泌減少[26-27].與N CuO相比,M CuO對土壤脲酶活性的影響較小,如圖2b.M CuO濃度為1600mg/kg時,在整個培養(yǎng)期間對土壤脲酶一直表現(xiàn)為抑制作用.在培養(yǎng)28d時,濃度為50和200mg/kg的M CuO對土壤的抑制減弱抑制率分別為2.11%和3.61%,而濃度為800和1600mg/kg的M CuO對土壤的抑制率分別是10.19%和8.40%.高濃度的M CuO釋放的Cu2+較多,有研究表明M CuO對土壤脲酶活性的影響是通過釋放Cu2+實現(xiàn)的,M CuO本身的毒性很小[28];圖2c為加入不同濃度的PEX對土壤脲酶活性的影響.第7d時,不同處理土壤樣品的脲酶活性達到最高,可能是由于PEX的加入,改變了酶促反應(yīng)的平衡,導(dǎo)致微生物分泌的脲酶增加[28],從培養(yǎng)的第14d起,加入PEX的土壤脲酶活性與空白土樣相比顯著降低(￡0.05),可能是由于高濃度PEX的毒性作用,殺死了部分土壤微生物,導(dǎo)致土壤中的微生物數(shù)量減少.

2.2 復(fù)合污染對土壤脲酶活性的影響

圖3為N CuO和M CuO分別與PEX復(fù)合脅迫對土壤脲酶的影響.由圖3a和3b可知,N CuO與M CuO分別與PEX復(fù)合脅迫下,在加入污染物1d后,土壤脲酶的活性均有所降低.在培養(yǎng)時間為7d時,土壤脲酶活性最高.與M CuO和PEX復(fù)合污染相比,N CuO與PEX復(fù)合污染對土壤脲酶的抑制作用更明顯.

復(fù)合污染的作用機制與污染物的種類及濃度組合、污染物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、污染時間以及生物種類等多種因素相關(guān)[30].表2為復(fù)合污染后的凈變化量,低濃度N CuO (50mg/kg)與PEX (10mg/kg)復(fù)合脅迫對土壤脲酶活性主要表現(xiàn)為拮抗作用,可能是由于加入的N CuO含量較少,部分N CuO與土壤有機質(zhì)和黏土礦物結(jié)合[30],N CuO溶出的部分Cu2+與PEX反應(yīng).

高濃度的N CuO與PEX復(fù)合污染對土壤脲酶表現(xiàn)為協(xié)同作用,可能是由于N CuO造成了細(xì)胞膜損傷,使PEX進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部,使胞內(nèi)代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂、生物化學(xué)成分發(fā)生改變,同時菌膜的損壞也會導(dǎo)致菌體內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生泄漏,使菌死亡[32-33].有研究表明,納米ZnO附著在菌膜上,對菌的形態(tài)產(chǎn)生一定的影響,如使菌膜某些部位變形或凹陷,改變菌膜的滲透性[34].與N CuO和PEX復(fù)合污染不同,M CuO和PEX復(fù)合污染對土壤脲酶活性主要表現(xiàn)為拮抗作用.可能是由于M CuO對脲酶活性的影響主要是由于釋放的Cu2+造成的,而釋放的Cu2+與PEX發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成黃原酸銅,黃原酸銅的溶解性很低,可能是造成兩者復(fù)合脅迫對脲酶產(chǎn)生拮抗作用的原因.有機酸可與金屬離子形成生物體幾乎不能吸收、蓄積的物質(zhì)形態(tài),這是減毒的重要機制[35].

表2 復(fù)合污染條件下脲酶活性的變化量

2.3 加入不同污染物后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 土壤樣品測序結(jié)果及取樣深度驗證 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表3.采用隨機取樣的方法抽取數(shù)據(jù),以抽到的序列數(shù)和它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線(圖4a),稀釋曲線可以反映取樣的深度,用來評價測序量是否覆蓋所有的類群.6個樣品的稀釋曲線均趨于平緩,但未達到飽和,說明取樣基本合理,能夠較真實的反應(yīng)土壤樣本的細(xì)菌群落.各樣本的覆蓋率指數(shù)顯示在相似度為0.97的條件下, OTUs涵蓋了土壤中85.97%~90.21%的細(xì)菌.Shannon-Wiener曲線(圖4b)是反映樣本微生物多樣性的指數(shù),指數(shù)越大表明群落的復(fù)雜程度越高[36].由圖4b看出,污染物N CuO和M CuO對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響不大, N CuO與PEX的復(fù)合污染造成了細(xì)菌群落多樣性的減少,可能是受到N CuO和PEX雙重篩選的結(jié)果.圖4c為在0.97的相似度下,繪出的韋恩圖,直觀展示樣品間OTU的重疊情況.其中5個土壤樣品有1672OTUs是相同的,由圖5a可知,相同的OTUs主要來源于Proteobacteria(變形菌門)和Actinobacteria(放線菌門),細(xì)菌類群具有良好的同源性,是由于供試的土壤是相同的[37].但是,每個樣品與對照樣品相比均有不同的OTU出現(xiàn),表明細(xì)菌多樣性受到了加入污染物不同程度的影響.

表3 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

注 :PN CuO表示PEX+ N CuO(300+1600mg/kg),PM CuO表示PEX +M CuO(300+1600mg/kg).

2.3.2 土壤細(xì)菌組成 圖5a為在門水平上群落結(jié)構(gòu)和分類結(jié)果.加入不同的污染物后,土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的變化.6個土壤樣品中,優(yōu)勢種群均為Proteobacteria和Actinobacteria.Proteobacteria和Actinobacteria在空白對照土壤中所占比例分別為30.28%和34.92%,在加入M CuO、N CuO、PEX、PEX +M CuO 和PEX+ N CuO后,Proteobacteria在土壤樣品中所占比例分別為27.98%、29.22%、34.02、37.89%和43.27%, Actinobacteria所占比例分別為34.92%、30.3%、18.96%、24.4%、22.96%和15.05%.在屬水平上,文章對細(xì)菌群落的變化又作出了更進一步的分析,如圖5b.可以看出,幾個樣品的優(yōu)勢屬沒有發(fā)生改變, DA101在空白樣中所占比例為2.27%,而加入M CuO、N CuO、PEX、PEX +M CuO 和PEX+ N CuO后,所占比例分別達到了2.67%、7.38%、5.32%、6.9%和4.34%,說明DA101對加入的污染物有一定的耐受性,其中加入N CuO時,DA101所占比例最高,說明DA101對N CuO有一定的耐受能力.而土樣中的和在加入污染物后均有所降低.納米顆粒對細(xì)菌的毒性作用,因菌種的不同而呈現(xiàn)一定的差異,這與細(xì)菌對納米顆粒的敏感性有關(guān).Yoon等[38]研究了大腸桿菌和枯草桿菌對Ag、Cu納米顆粒的敏感系數(shù),大腸桿菌的敏感系數(shù)小于枯草桿菌,表明大腸桿菌對Ag、Cu納米顆粒的耐受性更高.PEX分別與N CuO和M CuO復(fù)合污染會使土壤中的細(xì)菌受到雙重篩選的作用,同時,納米顆粒與有毒有機物相互作用會放大對細(xì)菌的毒性[38],造成細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較大的改變.

3 結(jié)論

3.1 N CuO較M CuO對土壤脲酶活性的抑制作用更明顯,可能由于 N CuO破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜或刺激細(xì)菌產(chǎn)生活性氧,造成細(xì)菌細(xì)胞的衰退,導(dǎo)致土壤脲酶的產(chǎn)生和分泌減少.

3.2 N CuO與PEX復(fù)合脅迫對土壤脲酶活性的影響與加入的物質(zhì)濃度有關(guān),低濃度時表現(xiàn)為拮抗作用,而高濃度時表現(xiàn)為協(xié)同作用.M CuO和PEX復(fù)合污染對土壤脲酶活性主要表現(xiàn)為拮抗作用.

3.3 加入不同的污染物質(zhì),土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變.N CuO、M CuO單一污染及與PEX復(fù)合污染均對土壤脲酶活性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)造成了不同程度的影響.N CuO對土壤脲酶活性及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響途徑和毒性機制需進一步研究.同時,N CuO的復(fù)合污染可能會放大對土壤的毒害作用,因此土壤納米顆粒的復(fù)合污染也應(yīng)得以重視.

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Effects of different sizes of CuO and potassium ethyl potassium compound pollution on soil urease and microbial diversity.

XING Yi1,2, WANG Zhi-qiang1, LI Yi-fei1, HONG Chen1,3*, SHEN Qian1, YANG Qiang1

(1.School of Energy and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；2.Beijing Key Laboratory of Resource-oriented Treatment of Industrial Pollutants, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；3.Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy Science, Beijing 100085, China).

Copper oxide nanoparticles are different from the conventional copper oxide nanoparticles. Due to their small size, large specific surface area, copper oxide nanoparticles have potential hazards to the ecological environment. This study was done by adding different proportions of copper oxide nanoparticles (N CuO ) and copper oxide microparticles (M CuO)to the soil (0、50、200、800、1600mgCuO /kg dry soil) to observe their effects on soil urease activity and bacterial communities.Meanwhile, the effects of N CuO and M CuO with the compound pollution of potassium ethyl xanthate (PEX) on soil microbial biomass were studied, respectively. Compared with M CuO, N CuO have stronger inhibition on the activity of urease.Only when the concentration of M CuO was 1600mg/kg, the effect of M CuO on urease activity was obvious. The inhibition of urease activity by N CuO may be related to the destruction of the cell membrane or the stimulation of the bacteria to produce reactive oxygen species, which caused the decline of bacterial cells. N CuO also has a greater influence on the bacterial community structure. Combined pollution of N CuO and PEX increased the toxicity of N CuO to soil microorganism, the activity of urease decreased greatly and the community structure of bacteria also changed greater. The mechanism of N CuO and its combined pollution on soil microbes need to be further studied. By comparing the ecological toxicity of N CuO and M CuO, the ecological toxicity of nanoparticles must be given high attention.

copper oxide nanoparticles；copper oxide microparticles；potassium ethyl xanthate；Ureaseactivity；Microbial diversity

X53

A

1000-6923(2017)04-1466-08

2016-09-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(41273091);科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程資助項目(LJ201620)

邢 奕(1976-),男,山西太原人,教授,博士,主要研究方向為重金屬土壤修復(fù)、固體廢棄物資源化處置.發(fā)表論文120余篇.

* 責(zé)任作者, 講師, hongchen000@126.com

, 2017,37(4)：1466~1473