徐可成, 董躍麗, 楊子祥, 韋永貴, 黃 瓊*, 孫躍先*

(1. 云南農業(yè)大學植物保護學院, 昆明 650201; 2. 云南省農業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農業(yè)研究所,元謀 651300; 3. 文山州農業(yè)科學院, 文山 663099)

Chelex-100法提取甘薯小象甲DNA及云南地區(qū)甘薯小象甲的分子鑒定

徐可成1, 董躍麗1, 楊子祥2, 韋永貴3, 黃 瓊1*, 孫躍先1*

(1. 云南農業(yè)大學植物保護學院, 昆明 650201; 2. 云南省農業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農業(yè)研究所,元謀 651300; 3. 文山州農業(yè)科學院, 文山 663099)

甘薯小象甲是國內外重要的檢疫性害蟲,除本身為害薯塊外,引起的傷口還會誘致病菌侵入,使受害薯塊發(fā)生惡臭和苦味無法食用。準確鑒定云南地區(qū)的甘薯小象甲,特別是研究其遺傳變異可為檢疫提供依據。本研究采集了云南元謀縣甘薯小象甲,采用Chelex-100法快速提取甘薯小象甲基因組DNA,分別對雌雄成蟲rDNA ITS-1序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析,首次發(fā)現云南元謀縣的甘薯小象甲屬于東亞分支的東南亞亞支,與我國之前報道的甘薯小象甲屬于東亞分支的東北亞亞支不同,說明云南元謀縣的甘薯小象甲種群來源與中國廣東、福建、浙江和重慶的種群來源不同。

甘薯小象甲; Chelex-100法; ITS-1; 系統(tǒng)發(fā)育

甘薯Ipomoeabatatas(L.)Lam.是旋花科番薯屬一年生或多年生塊根作物,其分布廣泛、適應性強,經濟價值高,廣泛種植于世界上100多個國家[1]。我國是世界上最大的甘薯生產國,每年種植面積約600萬hm2,年生產量約1.2億t,在我國糧食生產中的面積僅次于水稻、小麥和玉米,位居第4位[2]。

甘薯小象甲Cylasformicarius又稱甘薯蟻象甲,隸屬鞘翅目錐象科,是國內外重要的檢疫性害蟲[2]。甘薯小象甲成蟲啃食甘薯的嫩芽梢、莖蔓與葉柄的皮層,并將塊根咬食成許多小孔,嚴重影響甘薯的生長發(fā)育和薯塊的質量與產量。其幼蟲鉆蛀匿居于塊根或薯蔓內,不但能抑制塊薯的發(fā)育膨大,且其排泄物充塞于潛道中,助長病原侵染,導致薯塊腐爛霉壞,變黑發(fā)臭[3-4]。

ITS序列在昆蟲學、植物學和分類學方面具有重要應用價值[5-6]。其作為一種分子標記,主要應用于昆蟲的品系鑒定、親緣關系鑒定及系統(tǒng)發(fā)育、進化與擴散及昆蟲與生態(tài)環(huán)境的關系等方面[7-14]。

昆蟲基因組DNA的提取方法有很多,傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法是DNA提取的經典方法,但是該方法操作步驟復雜、耗時長,容易產生交叉污染,殘留在DNA溶液中的有機物質對DNA聚合酶有抑制作用。試劑盒法相對來說操作簡單、高效,提取的DNA質量較高,但價格昂貴,提取量少。安瑞生等[15]和陳保鋒等[16]分別通過改變研磨方式以及改進蛋白酶K法提高昆蟲基因組DNA提取效率,但是操作仍較為復雜。另外,酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染,有損操作者健康。因此尋求一種簡單、快速并且高效的甘薯小象甲DNA提取方法,顯得尤為重要。

Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯組成的獨特螯合樹脂,可以高選擇性地結合多價陽離子,去除樣品和緩沖液中的金屬離子,避免煮沸過程中模板DNA的降解。目前Chelex-100法廣泛應用于醫(yī)學微量血痕DNA[17]和微生物DNA提取[18],以及植物轉基因檢測模板DNA的制備[19],而很少用于昆蟲DNA的提取,對于甘薯小象甲DNA的提取更是未見報道。本試驗首次利用Chelex-100法快速提取甘薯小象甲DNA,使其ITS基因的PCR擴增更加簡便、省時。

目前關于甘薯小象甲研究主要集中在生物學、發(fā)生特點調查[20-21]及綜合防治方面[22-23],對于甘薯小象甲的rDNA-ITS序列研究較少,Kiyohisa等[24]基于rDNA-ITS序列對世界主要疫區(qū)的甘薯小象甲作了遺傳變異研究,國內僅有于海濱等[25]對中國4個省市6個地區(qū)的甘薯小象甲rDNA-ITS序列進行了分析,關于云南甘薯小象甲種群的ITS序列尚未有報道。為了明確云南的甘薯小象甲的遺傳變異及來源,本研究采集了云南元謀縣的甘薯小象甲,分別對雌雄成蟲rDNA ITS-1序列進行了分析。

1 材料與方法

1.1 甘薯小象甲

甘薯小象甲采自云南省元謀縣,在實驗室內采用甘薯塊根飼養(yǎng)多代,飼養(yǎng)條件如下:溫度為(28±0.5)℃,相對濕度為75%±5%,光周期為L∥D=0 h∥24 h。分別取雌雄成蟲各3頭用于測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2 基因組DNA的提取

1.2.1 Chelex-100法提取

取甘薯小象甲成蟲除去鞘翅,用滅菌ddH2O清洗干凈后在滅菌濾紙上干燥,干燥后取單頭甘薯小象甲置于1.5 mL的離心管中,用滅菌玻璃棒充分研磨,加入150 μL懸浮好的5% Chelex-100溶液,100℃金屬浴5 min,漩渦溶液5 s,12 000 r/min 離心5 min,上清液即可作為PCR反應的DNA模板。

1.2.2 試劑盒提取

取甘薯小象甲成蟲用ddH2O清洗干凈后在濾紙上干燥,按基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司生產)說明提取DNA。

1.3 試驗處理

1.3.1 Chelex-100法提取和試劑盒提取對比

分別采用Chelex-100法和試劑盒法提取單頭甘薯小象甲,各重復3次。

1.3.2 不同保存方式標本提取對比

分別以新鮮活蟲、干制標本以及75%乙醇保存的甘薯小象甲為材料用Chelex-100法提取DNA,各重復3次。

1.3.3 模板保存時間的探索

將單頭提取的甘薯小象甲DNA模板保存在-20℃冰箱中,分別對保存0、30、60、90 d的模板進行PCR擴增。

1.4 ITS-1區(qū)PCR擴增

ITS-1區(qū)PCR擴增引物:正向 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′;反向 5′-ACG AGC CGA GTG ATC CAC CG-3′[8],引物由上海生工生物工程有限公司合成。擴增反應在30 μL反應體系中進行:11 μL ddH2O,15 μL 2×TaqPCR StarMix,正反引物各1.5 μL,DNA模板1 μL。擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性60 s,55℃退火90 s,72℃延伸90 s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min,置于4℃冰箱保存。

取2 μL PCR擴增產物和3 μL核酸染料混合,于1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測,電泳緩沖液為0.5×TBE,在120 V電壓下進行45 min,置于UPV紫外成像系統(tǒng)上觀察成像,并拍照。目的條帶的純化、測序和序列正反拼接均由華大基因完成。

1.5 數據分析

將測得的6個甘薯小象甲ITS-1序列在NCBI上進行比對,選取GenBank中同源性較高的甘薯小象甲以及中國6個地區(qū)甘薯小象甲的ITS-1序列(表1),采用MEGA 6.06進行同源性比較,以稻水象甲序列為外群,用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,遺傳距離采用p-distance法,空位成對刪除,用自展法對構建的系統(tǒng)發(fā)育樹進行內部分支檢驗,重復1 000次。

表1 甘薯小象甲來源、ITS-1序列長度以及GenBank登錄號1)

1) “-”表示暫無基因登錄號。 “-” indicate no accession number.

2 結果與分析

2.1 Chelex-100法提取與試劑盒提取對比

電泳檢測結果顯示(圖1:泳道編號1～6):試劑盒提取單頭甘薯小象甲DNA經ITS-1 PCR擴增,電泳條帶較暗,其中一個重復沒有條帶,而Chelex-100法則均獲得清晰明亮的電泳條帶,表明試劑盒提取單頭甘薯小象甲基因DNA的效果沒有Chelex-100法理想,甚至有可能存在失敗的情況,而Chelex-100法可抽提到適于PCR擴增反應的DNA模板,可為后續(xù)PCR試驗提供足量的模板。

2.2 不同保存條件標本Chelex-100法抽提效果對比

結果表明(圖1:泳道編號7～9)3種保存方式保存的樣品采用Chelex-100法均能抽提到有效的DNA模板,但是電泳條帶亮度顯示:新鮮活蟲>干制標本>75%乙醇保存標本。

2.3 模板保存時間對PCR效果的影響

Chelex-100使用說明上指出該法所獲得模板應當于1周內使用,保存時間較短。而本試驗結果顯示(圖1:泳道編號10～13):置于-20℃下保存1～3個月后的模板經PCR擴增,仍能獲得較為清晰的電泳條帶,但是電泳條帶的亮度變暗,表明Chelex-100法提取的單頭甘薯小象甲DNA模板在-20℃下可以保存較長的時間。

圖1 不同處理下甘薯小象甲rDNA ITS-1 序列PCR擴增凝膠電泳Fig.1 Results of PCR amplification of rDNA ITS-1 sequences from Cylas formicarius by different treatments

2.4 甘薯小象甲rDNA ITS-1系統(tǒng)發(fā)育分析

由于有些地區(qū)的甘薯小象甲序列相似度較高,差異不明顯,因此系統(tǒng)發(fā)育樹的部分分支自展值偏低,但是3個地域性分支的自展值都在90以上(圖2)。

圖2 基于NJ法構建的甘薯小象甲rDNA ITS-1序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS-1 sequences of Cylas formicarius from different areas using the NJ method

該樹表明甘薯小象甲被分為東亞分支和印度分支兩大主支,東亞分支又分為東北亞亞支和東南亞亞支,其中東北亞亞支包括日本各地區(qū),中國臺灣、浙江、廣東、福建和重慶地區(qū),越南河內,美國佐治亞州、夏威夷島以及圣基茨和尼維斯的圣基茨島;東南亞亞支包括越南胡志明市,菲律賓呂宋島,印度尼西亞蘇門答臘島,泰國以及中國云南地區(qū),其中云南地區(qū)3個甘薯小象甲序列長度和泰國一致,且雌雄成蟲的ITS-1序列長度并無明顯差異,同源性達到100%。

3 結論

與傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法相比,Chelex-100法未使用苯酚去除蛋白,因此DNA純度不高,但PCR對模板純度的要求較低,Chelex-100法獲得的DNA足以擴增出所需的基因片段,因此結果是可靠的[26]。本試驗首次利用Chelex-100法快速提取甘薯小象甲DNA,與試劑盒法需裂解3 h相比較,Chelex-100法提取的整個過程只需15 min左右,使其ITS基因的PCR擴增更加簡便、省時,克服了利用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的困難,在快速鑒定甘薯小象甲以及大規(guī)模提取其基因組DNA等方面具有重要意義。但是PCR-RFLP等精細分子試驗以及其他昆蟲的基因組DNA的提取能否采用Chelex-100法還有待進一步的研究。

甘薯小象甲起源于印度[27],由于其飛行能力差[28],主要通過人為運輸帶蟲甘薯傳播[27]。經與國內外的甘薯小象甲序列進行比較分析,研究結果與Kiyohisa等[24]的研究結果基本一致,甘薯小象甲可以分成兩個明顯的地域性主支,即印度分支和東亞分支,東亞分支又分為東北亞亞支和東南亞亞支。此外,印度分支和東亞分支的序列長度差異較大,東亞分支的甘薯小象甲ITS-1序列長度范圍在557～574 bp,明顯短于印度地區(qū)的甘薯小象甲。其中云南地區(qū)的3個甘薯小象甲ITS-1序列長度和泰國地區(qū)的一致,且位于東南亞亞支的同一分支上,由此說明云南地區(qū)3個甘薯小象甲很有可能是由泰國傳入的。與于海濱等[25]的報道不同,他們的研究表明中國甘薯小象甲至少有兩個來源,但都處于東北亞亞支上。本研究首次發(fā)現中國云南地區(qū)的甘薯小象甲處于東南亞亞支上,也就是說,云南元謀縣的甘薯小象甲種群來源與中國廣東、福建、浙江和重慶的不同。至于云南的甘薯小象甲是否還存在其他的遺傳變異,還有待更多地區(qū)的標本進行分析。

[1] 陸漱韻, 劉慶昌, 李惟基. 甘薯育種[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 1998.

[2] 張世祎, Talekar N S, 李正躍, 等. 甘薯小象甲成蟲對甘薯植株不同部位的選擇行為[J]. 云南大學學報(自然科學版)，2008, 30(S1): 127-129.

[3] 張裕君,劉躍庭,廖芳,等.DNA條形碼技術研究進展及其在植物檢疫中的應用展望[J].中國植保導刊,2010,30(4):15-17.

[4] Elder J R, Turner B J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes [J]. Quarterly Review of Biology, 1995, 70: 297-319.

[5] 王建波,張文駒,陳家寬.核rDNA的ITS序列在被子植物系統(tǒng)與進化研究中的應用[J]. 植物分類學報, 1999, 37(4): 407-416.

[6] 任國棟, 寧靖. 基于18S rDNA的全變態(tài)類昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 科技導報, 2011, 29(22): 38-41.

[7] Manonmani A, Townson H, Adeniran T, et al. rDNA-ITS2 polymerase chain reaction assay for the sibling species ofAnophelesfluviatilis[J]. Acta Tropica, 2001, 78(1): 3-9.

[8] 周水森, 湯林華, 顧政誠, 等. 不同地區(qū)微小按蚊rDNA ITS2序列差異[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2002, 20(1): 29-31.

[9] Alvarez J M, Hoy M A. Evaluation of the ribosomal ITS2 DNA sequences in separating closely related populations of the parasitoidAgeniaspis(Hymenoptera: Encyrtidae) [J]. Annals of the Entomological Society of America, 2002, 95: 250-256.

[10]De Barro P J, Driver F, Trueman J, et al. Phylogenetic relationships of world populations ofBemisiatabaci(Gennadius) using ribosomal ITS1 [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2000, 16: 29-36.

[11]Honda J Y, Nakashima Y, Yanase T, et al. Use of the internal transcribed spacer (ITS-1) region to inferOrius(Hemiptera: Anthocoridae) species phylogeny [J]. Applied Entomology Zoology, 1998, 33: 567-571.

[12]Marinucci M, Romi R, Mancini P, et al. Phylogenetic relationships of seven palearctic members of themaculipenniscomplex inferred from ITS2 sequence analysis [J]. Insect Molecular Biology, 1999, 8(4): 469-480.

[13]Thomson L J, Rundle B J, Carew M E, et al. Identification and characterization ofTrichogrammaspecies from south-eastern Australia using the internal transcribed spacer 2 (ITS-2) region of the ribosomal gene complex [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 2003, 106: 235-240.

[14]Perrin A, Cetre-sossah C, Mathieu B. Phylogenetic analysis ofCulicoidesspecies from France based on nuclear ITS1-rDNA sequences [J]. Medical and Veterinary Entomology, 2006, 20: 219-228.

[15]安瑞生, 譚聲江, 陳曉峰. 小型昆蟲DNA提取時勻漿方法的改進[J]. 昆蟲知識, 2002, 39(4): 311-312.

[16]陳保鋒, 章歡, 申躍武, 等. 一種簡潔實用的昆蟲基因組DNA提取方法[J]. 醫(yī)學動物防治, 2013, 29(6): 647-648.

[17]許金朋, 郝永清. Chelex-100法直接提取乳樣中奶牛乳房炎主要致病菌DNA方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(11): 25-29.

[18]周月琴, 朱偉, 劉志萍, 等. 用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J]. 復旦學報, 2003, 30(4): 379-380.

[19]王永, 張莉, 蘭青闊, 等. Chelex-100快速提取用于轉基因檢測DNA模板的研究[J]. 生物技術通報, 2008(2): 143-145.

[20]葉明鑫. 甘薯小象甲發(fā)生特點調查與原因分析[J]. 中國農學通報, 2015, 31(4): 195-199.

[21]潘初沂. 閩東南地區(qū)甘薯小象甲發(fā)生為害特點初探[J]. 福建農業(yè)科技, 2006(5): 59-61.

[22]徐三勤, 王海富, 陳時偉. 甘薯小象甲的發(fā)生規(guī)律與防控技術[J]. 現代園藝, 2015(7): 98-99.

[23]黃立飛, 黃世輝, 房伯平, 等. 甘薯小象甲的防治研究進展[J]. 廣東農業(yè)科學, 2011(S1): 77-79.

[24]Kiyohisa K, Tuyosi S, Koji K, et al. Genetic variation of sweet potato weevils,Cylasformicarius(Fabricius) (Coleoptera: Brentidae), in main infested areas in the world based upon the internal transcribed spacer-1 (ITS-1) region [J]. Applied Entomology and Zoology, 2007, 42(1): 89-96.

[25]于海濱, 沈衛(wèi)紅, 馬娟, 等. 中國甘薯小象甲的rDNA ITS-1遺傳變異及入侵來源研究[J]. 中國農學通報, 2011, 27(18): 282-287.

[26]Jinks D C, Minter M, Tarver D A, et al. Molecular genetic diagnosis of sickle cell disease using dried blood specimens on blotters used for newborn screening [J]. Human Genetics, 1989, 81(4): 363-366.

[27]Wolfe G W. The origin and dispersal of the pest species ofCylaswith a key to the pest species groups of the world [M]// Sweet potato pest management, a global perspective. Boulder: Westview Press, 1991.

[28]Moriya S. A preliminary study on the flight ability of the sweet potato weevil,Cylasformicarius(Fabricius) (Coleoptera: Apionidae) using a flight mill [J]. Applied Entomology Zoology, 1995, 30: 244-246.

(責任編輯：楊明麗)

DNA extraction fromCylasformicarius(Coleoptera: Brentidae) by Chelex-100method and molecular identification ofCylasformicariusin Yunnan

Xu Kecheng1, Dong Yueli1, Yang Zixiang2, Wei Yonggui3, Huang Qiong1, Sun Yuexian1

(1. College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;2. Tropical Eco-agriculture Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yuanmou 651300, China;3. Yunnan Wenshan Academy of Agricultural Sciences, Wenshan 663099, China)

Sweet potato weevil (Cylasformicarius) is an important quarantine pest in the world. It not only harms sweet potato tuber but also makes wounds that induced pathogen to infect, which caused infected sweet potato to send out offensive odor and turn bitter. Accurate identification of sweet potato weevils in Yunnan, especially its genetic variation, can provide a basis for quarantine. In this research, we collected sweet potato weevils from Yuanmou County, Yunnan Province, applied a rapid method for extracting the DNA ofC.formicariusby using Chelex-100 and analyzed the ITS-1 sequence of adult female and male insects. We first find that sweet potato weevils in Yuanmou County belong to the southeast subclade of the East Asia clade. This result differs from the previous report that sweet potato weevils belong to the Northeast subclade of the East Asia clade,suggesting that sweet potato weevils populations in Yuanmou County differs from those in Guangdong, Fujian, Zhejiang and Chongqing.

Cylasformicarius; Chelex-100 method; ITS-1; phylogeny

2016-07-09

2016-08-30

國家自然科學基金(31270067)

S 435.315

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.026

致 謝： 感謝河北大學生命科學院陳書龍研究員提供的中國6個地區(qū)的甘薯小象甲ITS-1序列。

* 通信作者 E-mail：huangqiong88hs@163.com；sunyx82114@gmail.com