周大祥, 殷幼平, 王中康, 熊 書

(1. 重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院, 萬州 404100; 2. 重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室, 重慶 400030; 3. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 萬州 404120)

實驗方法與技術(shù)
ExperimentalMethod&Technology

利用EMA-qPCR建立快速檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法

周大祥1,2, 殷幼平2, 王中康2, 熊 書3*

(1. 重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院, 萬州 404100; 2. 重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶市基因功能與調(diào)控重點實驗室, 重慶 400030; 3. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 萬州 404120)

利用疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA)與實時熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合(EMA-qPCR),建立了一種有效快速檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法。以獼猴桃潰瘍病菌ITS序列為檢測靶標(biāo),菌體經(jīng)EMA滲透處理,再進行qPCR特異性擴增。結(jié)果顯示,qPCR檢測靈敏度為2 cfu;當(dāng)EMA的濃度為2.0 μg/mL時,能有效抑制1.0×107cfu/mL經(jīng)高溫滅活的死菌的擴增,對活菌的擴增沒有影響。當(dāng)活菌數(shù)在1.0×101～1.0×105cfu范圍內(nèi),每個qPCR反應(yīng)體系中活菌數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)(R2=0.988)。不同溫度處理活菌菌懸液后用EMA-qPCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的存活情況并與平板計數(shù)法進行比較,結(jié)果表明待檢樣品可在4℃和20℃短期保存。對疑似帶病獼猴桃材料進行EMA-qPCR檢測,結(jié)果表明能減少獼猴桃潰瘍病菌PCR的假陽性結(jié)果。本研究建立的EMA-qPCR方法是一種有效檢測獼猴桃潰瘍病菌活菌的方法,能有效避免PCR檢測實際樣品可能造成的假陽性結(jié)果。

獼猴桃潰瘍病菌; 疊氮溴乙錠; 實時熒光定量PCR; 活菌檢測

獼猴桃潰瘍病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)引起,是獼猴桃生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一[1]。目前,獼猴桃潰瘍病菌的檢測主要采用PCR技術(shù),常規(guī)的PCR技術(shù)不能區(qū)分樣品中病原菌的生活狀態(tài),在對活菌DNA進行擴增時,也會擴增自由狀態(tài)的DNA或死菌的DNA[2],導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性,因此急需建立一種快速有效檢測待檢樣品中獼猴桃潰瘍病菌的方法。

疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)是一種插入型熒光核酸結(jié)合染料,其光解后生成的氮賓化合物能夠穿過死菌的細胞膜,與菌體DNA發(fā)生不可逆共價結(jié)合,因而可抑制死菌中DNA的擴增,但不會抑制細胞膜完整的活菌DNA的擴增[3-5]。EMA-PCR方法僅以活菌DNA分子為檢測靶標(biāo),克服了傳統(tǒng)PCR檢測假陽性較高的缺點,使結(jié)果更加有效、可靠,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測[6-7]。本研究擬通過EMA-qPCR對獼猴桃潰瘍病菌進行快速檢測,分析EMA對PCR檢測獼猴桃潰瘍病菌死活細菌的影響;同時,初步優(yōu)化了枝條中獼猴桃潰瘍病菌活菌的EMA-qPCR檢測體系,為獼猴桃潰瘍病的檢驗檢疫提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiae菌株C33從重慶黔江染病獼猴桃枝條上分離,由西南大學(xué)植物保護學(xué)院提供,本實驗室保存。

試劑:疊氮溴乙錠(ethidium monoazide bromide,EMA,Invitrogen)、SYBR?PremixExTaqTMⅡ Mix (TaKaRa)、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BPA)、LB液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌活菌和死菌的制備

從BPA培養(yǎng)基上挑取獼猴桃潰瘍病菌,接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中,25℃下250 r/min培養(yǎng)過夜,調(diào)整菌懸液濃度為1.0×107cfu/mL。取一半活菌懸液100℃水浴加熱10 min,得到死菌懸液。

1.2.2 DNA模板制備

將獼猴桃潰瘍病菌接種至LB液體培養(yǎng)基,25℃下250 r/min培養(yǎng)過夜,A600值在0.4～0.8時,根據(jù)《新編分子生物學(xué)實驗指南》提供的方法提取DNA[8]。

1.2.3 獼猴桃潰瘍病菌特異性檢測引物以及熒光定量PCR反應(yīng)條件

獼猴桃潰瘍病菌的ITS序列特異引物[9]PsaF1(5′-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3′)和PsaR2(5′- CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′)由北京華大基因公司合成。擴增目的片段長度為280 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL: 12.5 μL SYBR PremixExTaqMix,10 mmol/L PsaF1/PsaR2各0.75 μL,模板DNA 2 μL,加超純水補至25 μL。qPCR反應(yīng)在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad,USA)中進行,PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃30 s, 30個循環(huán),qPCR擴增完成后隨即分析熔解曲線,擴增特異性驗證。

1.2.4 熒光定量PCR靈敏度檢測

將新鮮培養(yǎng)的獼猴桃潰瘍病菌進行稀釋,取稀釋后的菌液2 μL直接進行熒光定量PCR擴增,同時取對應(yīng)稀釋菌液1 mL涂布BPA平板,25℃培養(yǎng)48～72 h計數(shù),重復(fù)3次。

1.2.5 EMA-qPCR條件優(yōu)化

于黑暗中分別取1 mL獼猴桃潰瘍病菌的活菌和死菌懸液(1.0×107cfu/mL)避光加入不同濃度的EMA,避光室溫靜置5 min,將離心管置于冰上,打開管蓋,距離650 W鹵鎢燈15 cm,持續(xù)曝光10 min[10-11],激活EMA,取2 μL EMA處理的菌液進行熒光定量PCR擴增。

1.2.6 死活菌混合體系中EMA-qPCR的選擇性擴增

將1.0×107cfu/mL的死菌懸液0.5 mL分別與1.0×1010、5×108、1.0×108、5×107、1.0×107、5×106、1.0×106、5×105、1.0×105、5×104、1.0×104cfu/mL的活菌懸液0.5 mL混合均勻,形成不同比例的死、活菌混懸液,取1 mL混合的菌液按1.2.5的方法,用優(yōu)化濃度的EMA處理菌懸液,取2 μL菌液進行熒光定量PCR擴增。

1.2.7 EMA-qPCR法和平板計數(shù)法比較不同溫度處理后獼猴桃潰瘍病菌的存活情況

取1 mL濃度為1.0×107cfu/mL的新鮮獼猴桃潰瘍病菌活菌懸液,10 000 r/min離心5 min,然后加1 mL的超純水中混勻,分別進行-20℃冷凍、4℃冷藏和20℃常溫各處理24 h、48 h和72 h后,按1.2.5的方法,用優(yōu)化濃度的EMA處理菌懸液,取2 μL菌液進行熒光定量PCR擴增。同時取相應(yīng)的菌液涂板,25℃培養(yǎng)48～72 h計數(shù)。

1.2.8 EMA-qPCR檢測方法的假陽性驗證

按1.2.1制備濃度為107、106、105cfu/mL的獼猴桃潰瘍病菌死菌溶液,比較常規(guī)qPCR法、EMA-qPCR法和平板計數(shù)法對滅活獼猴桃潰瘍病菌的檢測差異,驗證EMA-qPCR方法檢測是否存在假陽性。

1.2.9 獼猴桃枝干樣品中獼猴桃潰瘍病菌的EMA-qPCR擴增

將四川、重慶等地采集的10份疑似獼猴桃潰瘍病癥狀的枝干洗凈后切成4 mm×4 mm的小塊,無菌水沖洗3次,置于無菌試管中用玻璃棒碾碎,隨后加入800 μL無菌水浸泡2 h,將上層浸泡液分成3部分,一部分進行6 h增殖培養(yǎng)備用；一部分直接加入終濃度為3.0 μg/mL的EMA,按1.2.5的方法進行靜置曝光處理；第三部分浸泡液經(jīng)熱致死處理后再添加3.0 μg/mL的EMA(對照),并按1.2.5的方法進行靜置曝光處理,提取DNA,按1.2.3的方法進行PCR擴增。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR靈敏度

隨著qPCR反應(yīng)體系中獼猴桃潰瘍病菌活菌數(shù)減少,Ct值逐漸增大,當(dāng)qPCR反應(yīng)體系中的活菌數(shù)為1 cfu時,熒光定量PCR檢測結(jié)果為陰性,因此,熒光定量PCR檢測靈敏度為2 cfu(圖1)。

圖1 熒光定量PCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的靈敏度Fig.1 The detection limit of qPCR for Psa

2.2 抑制純培養(yǎng)死菌DNA擴增的最適EMA濃度

對死菌的qPCR檢測結(jié)果顯示,添加EMA的各組Ct值與未添加EMA的對照組相比均顯著增加(P<0.05),當(dāng)EMA終濃度≥2.0 μg/mL時,死菌的PCR擴增被徹底抑制(圖2)。低濃度的EMA(≤10 μg/mL)對活菌PCR擴增抑制不顯著 (P>0.05)。但是,當(dāng)EMA≥20 μg/mL時,可顯著抑制活菌的PCR擴增(P<0.05)(圖2)?？梢?抑制死菌DNA擴增的最低EMA濃度(2.0 μg/mL)遠遠小于影響活菌DNA擴增的最小EMA濃度(20 μg/mL)。因此,我們使用終濃度為2.0 μg/mL的EMA作為純菌培養(yǎng)后續(xù)試驗的最佳濃度。

圖2 獼猴桃潰瘍病菌EMA-qPCR檢測體系中EMA濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the EMA concentration in EMA-qPCR

2.3 死活菌混合體系中EMA-qPCR選擇性擴增活菌

用5.0×106cfu的死菌與不同數(shù)量的活菌混合后加入EMA(終濃度為2.0 mg/L)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),死菌DNA的擴增被徹底抑制,隨著活菌數(shù)目的降低,Ct值逐漸增加,檢測最低限度達到1.0×101cfu (Ct為35.12)(圖3a)。在活菌數(shù)為1.0×101～1.0×105cfu范圍內(nèi),其cfu數(shù)與Ct值呈線性相關(guān),y=-1.915 8x+37.546,相關(guān)系數(shù)為R2=0.988(圖3b)。此時,通過Ct值可對qPCR中活菌cfu數(shù)進行快速定量測定。

2.4 EMA-qPCR檢測不同溫度處理后獼猴桃潰瘍病菌的存活情況

當(dāng)檢測實際樣品時,可能需要暫時保存待檢樣品,為了明確保存溫度對待檢樣品檢測結(jié)果的影響,設(shè)計了-20℃、4℃和20℃ 3個常規(guī)保存溫度分別保存24、48和72 h,EMA-qPCR檢測獼猴桃潰瘍病菌的存活情況并與平板培養(yǎng)計數(shù)法進行比較。結(jié)果表明,-20℃冷凍處理時間越長,EMA-qPCR和平板計數(shù)結(jié)果越低,處理72 h后,EMA-qPCR檢測活菌數(shù)為3.7×105cfu,平板計數(shù)檢測活菌數(shù)為4.1×103cfu,兩種結(jié)果顯著差異(P<0.05),顯示獼猴桃潰瘍病菌低溫處理會部分死亡。4℃冷藏和20℃常溫放置24、48和72 h后,兩種方法的活菌測定結(jié)果無顯著性差異(P>0.05),且接近對照活菌數(shù),結(jié)果表明待檢樣品可在4℃和20℃短期保存(表1)。

圖3 qPCR反應(yīng)體系中活菌數(shù)與Ct值的關(guān)系Fig.3 Relationship between the Ct values from EMA-qPCR and the varying number of genomic targets per PCR

處理時間/hTreatmenttime-20℃EMA-qPCR/cfu平板計數(shù)/cfu·板-1Platecounting4℃EMA-qPCR/cfu平板計數(shù)/cfu·板-1Platecounting20℃EMA-qPCR/cfu平板計數(shù)/cfu·板-1Platecounting01.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA1.0×107aA243.8×106bA6.9×105bB9.9×106aA1.0×107aA9.9×106aA9.9×106aA487.2×105cA6.3×104cB9.9×106aA9.8×106aA1.0×107aA9.8×106aA723.7×105dA4.1×103dB1.0×107aA9.9×106aA9.9×106aA1.0×107aA

1) 同列不同小寫字母表示不同時間處理之間差異顯著(P<0.05);同行不同大寫字母表示相同溫度處理下兩種方法之間差異顯著(P<0.05)。 Different small letters in the same column indicated significant differences between different time treatments (P<0.05); Different capital letters in the same line indicate significant differences between two methods under the same temperature (P<0.05).

2.5 EMA-qPCR檢測方法的假陽性驗證

以常規(guī)qPCR法、EMA-qPCR法和平板計數(shù)法檢測3個不同濃度的滅活獼猴桃潰瘍病菌,驗證EMA-qPCR 方法對該菌的測定是否會出現(xiàn)假陽性。結(jié)果表明,除了常規(guī)qPCR法測定到獼猴桃潰瘍病菌外,平板計數(shù)法和EMA-qPCR法的測定結(jié)果皆為陰性(表2)。表明獼猴桃潰瘍病死菌DNA在短時間內(nèi)也可作為PCR擴增的模板,常規(guī)qPCR法不能有效區(qū)分獼猴桃潰瘍病菌死活菌。而EMA-qPCR法僅以活菌DNA為檢測靶標(biāo),不會擴增死菌DNA,沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果,平板計數(shù)法進一步證明了EMA-qPCR法的可靠性。

表2 常規(guī)qPCR方法、EMA-qPCR方法和平板計數(shù)法測定滅活獼猴桃潰瘍病菌數(shù)的比較1)

1) NA: 陰性。 NA: Negative.

2.6 EMA-qPCR檢測疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品

對四川、重慶等地采集的10份疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品(浸泡液未經(jīng)增殖培養(yǎng))進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照EMA-qPCR測定結(jié)果均為陰性,說明獼猴桃枝干樣品中獼猴桃潰瘍病死菌DNA的擴增被完全抑制。來自重慶萬州、四川邛崍和四川崇州的樣品EMA-qPCR檢測結(jié)果為陰性,與平板培養(yǎng)結(jié)果一致,這3份樣品經(jīng)過培養(yǎng)后,EMA-qPCR檢測結(jié)果還是陰性(數(shù)據(jù)未列出),而qPCR檢測結(jié)果均為陽性,說明這3份樣品中的獼猴桃潰瘍病菌雖然已經(jīng)死亡，但DNA序列還沒有完全降解。結(jié)果表明EMA-qPCR法可以代替平板培養(yǎng)法快速檢驗獼猴桃潰瘍病。

表3 疑似感染獼猴桃潰瘍病的枝干樣品的檢測

3 討論

普通PCR技術(shù)可以快速鑒定細菌,但不能將死菌和活菌區(qū)分開。由于EMA具有選擇性[12-13],它只能進入細胞壁(膜)不完整的死細胞內(nèi),不能進入細胞壁(膜)完整的活細胞。因此,將EMA與qPCR方法相結(jié)合,能快速、準(zhǔn)確地區(qū)分實際樣品中的死菌和活菌,有效降低傳統(tǒng)PCR檢測的假陽性。EMA-qPCR目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源致病微生物[14-16]和醫(yī)學(xué)病原微生物[17]的檢測中,但在果樹病原菌的檢測上報道極少[18]。

本研究首先選用純化的獼猴桃潰瘍病菌進行EMA-qPCR方法研究,結(jié)果表明,當(dāng)EMA終濃度≥2.0 μg/mL時,107cfu/mL濃度死菌的DNA擴增可被徹底抑制。死菌和活菌混合試驗表明,檢測最低限度為1.0× 101個活菌,在活菌數(shù)為1.0×101～1.0×105cfu內(nèi),其cfu與Ct值呈線性相關(guān),此時,以Ct值可對qPCR中活菌cfu進行快速定量測定。

在實際樣品測定時,可能需要暫時保存待檢樣品。我們測試了不同溫度短時間保存獼猴桃潰瘍病菌后其存活情況。結(jié)果表明,活菌經(jīng)過-20℃保存72 h后,EMA-qPCR法檢出的活菌數(shù)高于平板計數(shù)法,原因可能是低溫短期處理后的死亡菌體仍能保持細胞壁(膜)完整,使EMA染料無法滲透進入[19-20]。4℃和20℃保存72 h,兩種方法的活菌檢測結(jié)果一致,且接近對照活菌數(shù),但EMA-qPCR法耗時更短,大大縮短了測定時間。綜合試驗結(jié)果表明,獼猴桃潰瘍病待檢樣品可在4℃和20℃短期保存,不會影響測定結(jié)果,但不能在-20℃冷凍短期保存。

目前,EMA結(jié)合PCR技術(shù)檢測實際樣品中的病原菌報道極少[18]。EMA-qPCR檢測疑似獼猴桃潰瘍病枝干樣品時,因為獼猴桃枝干中未經(jīng)增殖培養(yǎng)的浸泡液細菌總濃度不會超過1.0×107cfu/mL,同時獼猴桃枝干中的非靶標(biāo)死菌可能會消耗掉一部分EMA,因此我們選擇的EMA濃度為3.0 μg/mL(比純菌條件下稍高)。結(jié)果表明,10份對照樣品EMA-qPCR檢測結(jié)果都是陰性,說明EMA在獼猴桃枝干樣品檢測中抑制獼猴桃潰瘍病菌死菌DNA被擴增的效果比較理想。其中3份樣品的EMA-qPCR測定結(jié)果與qPCR測定結(jié)果不同,與平板培養(yǎng)結(jié)果相同,表明EMA-qPCR方法比qPCR法更能克服假陽性的出現(xiàn),準(zhǔn)確反映實際樣品的帶菌情況,并且比平板培養(yǎng)法檢測時間更短。

有時,實際樣品中存在的活菌數(shù)可能非常少,低于qPCR的最低檢測下限,這樣EMA-qPCR檢測可能會出現(xiàn)假陰性[21]。因此當(dāng)未經(jīng)增殖培養(yǎng)的浸泡液檢測結(jié)果為陰性時,必須經(jīng)過增殖培養(yǎng)后再次進行EMA-qPCR檢測,才能確定實際樣品中是否有活菌存在。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Establishment of a method to rapidly detect only viable cells ofPseudomonassyringaepv.actinidiaeby EMA-qPCR

Zhou Daxiang1,2, Yin Youping2, Wang Zhongkang2, Xiong Shu3

(1. College of Life Science & Engineering, Chongqing Three Gorges University, Wanzhou 404100, China; 2. College ofLife Science, Chongqing University, Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation, Chongqing 400030, China;3. Department of Basic Medicine, Chongqing Three Gorges Medical College, Wanzhou 404120, China)

A method to rapidly detect only viable cells ofPseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa) was established by EMA-qPCR. The ITS sequence was used as the target gene for qPCR detection of Psa. Samples were treated with EMA prior to DNA extraction. DNA was then amplified by qPCR to detect only viable Psa cells. The sensitivity of qPCR detection was 2 cfu. 2 μg/mL EMA could completely inhibit the PCR amplification of DNA derived from dead cells with the concentration of 1.0×107cfu/mL, but no inhibition to viable cells. A standard curve was generated relating the number of viable cells to theCtvalues of the EMA-qPCR. A linear range of DNA amplification was observed from 1.0×101-1.0×105cfu genomic targets per PCR. EMA-qPCR method was used to evaluate the survival rate of Psa treated with different temperatures for a short time, and compared with the method of plate counting. The results indicated that samples can be stored for a short time under 4℃ and 20℃. The data of EMA-qPCR detection on kiwifruit field samples indicated that 3 μg/mL EMA could successfully inhibit PCR amplification of DNA from dead bacteria in filed samples. The EMA-qPCR method established in this study can effectively avoid false positive results of Psa detection.

Pseudomonassyringaepv.actinidiae; ethidium monoazide bromide; real-time PCR; detection of viable bacteria

2016-05-21

2016-07-20

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA2026);重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1502601);重慶三峽學(xué)院校級重點項目

S 436.634.12

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.024

* 通信作者 E-mail: dqzhou79@163.com