羅卿權(quán), 路廣亮, 王 鳳, 周 坤,劉亞杰, 吳時(shí)英, 季國(guó)輝, 徐 穎*

(1. 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院, 上海 200232;2. 上海申迪園林投資建設(shè)有限公司, 上海 201205; 3. 上海市浦東新區(qū)林業(yè)站, 上海 201210)

‘芽黃’紅瑞木枝干潰瘍病病原菌的鑒定及藥劑防治

羅卿權(quán)1, 路廣亮1, 王 鳳1, 周 坤2,劉亞杰2, 吳時(shí)英3, 季國(guó)輝3, 徐 穎1*

(1. 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院, 上海 200232;2. 上海申迪園林投資建設(shè)有限公司, 上海 201205; 3. 上海市浦東新區(qū)林業(yè)站, 上海 201210)

‘芽黃’紅瑞木枝干潰瘍病在上海發(fā)生嚴(yán)重。本研究通過(guò)病原菌分離,致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)特征觀察,將引起此病害的病原菌鑒定為擬盤多毛孢屬一種Pestalotiopsissp.。通過(guò)擴(kuò)增病原菌的rDNA-ITS序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,其在系統(tǒng)發(fā)育樹上與擬盤多毛孢屬中分生孢子中間三個(gè)細(xì)胞異色的類群處于同一分支,此結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。5種殺菌劑室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明,對(duì)Pestalotiopsissp.的抑制中濃度(EC50)為0.639～1.787 μg/mL。4種殺菌劑室外藥效試驗(yàn)結(jié)果表明,在發(fā)病初期,25%丙環(huán)唑乳油和25%嘧菌酯懸浮劑防治效果可達(dá)80%以上,當(dāng)病害發(fā)展后,供試4種殺菌劑對(duì)病害的防治效果均小于50%。

‘芽黃’紅瑞木; 枝干潰瘍; 擬盤多毛孢屬; 藥劑篩選; 藥效試驗(yàn)

‘芽黃’紅瑞木Cornusalba‘Bud’s Yellow’是山茱萸科梾木屬落葉灌木,其葉片卵圓形,花白色,莖稈終年呈黃綠色,冬季落葉后,莖稈金黃,鮮明突出[1]。因花與枝條皆具有較高的觀賞價(jià)值,逐漸成為園林造景中優(yōu)良的彩色樹種。紅瑞木在我國(guó)原分布于東北、華北和西北地區(qū)[2],因其具觀賞價(jià)值,其引種分布區(qū)域逐漸擴(kuò)大,近年來(lái)在上海乃至華東地區(qū),紅瑞木也被廣泛種植。

‘芽黃’紅瑞木在上海迪士尼樂(lè)園園區(qū)被廣泛種植,近兩年在園區(qū)調(diào)查中發(fā)現(xiàn), ‘芽黃’紅瑞木上一種莖稈病害發(fā)生嚴(yán)重,此病害在小枝和主枝上均可發(fā)生。上海梅雨季節(jié)后,植株莖稈上始現(xiàn)病斑;此后,隨著病害發(fā)展,病斑逐漸增大或增多,造成小枝枯死,發(fā)生嚴(yán)重者甚至危害基部主枝,導(dǎo)致整株植物枯萎死亡。此病害不僅對(duì)‘芽黃’紅瑞木危害程度較嚴(yán)重,而且其危害率也較高,夏末調(diào)查顯示,苗圃區(qū)株發(fā)病率達(dá)60%以上。

鑒于此病害對(duì)‘芽黃’紅瑞木造成的嚴(yán)重危害,本研究對(duì)其危害癥狀等進(jìn)行了觀察描述,對(duì)病原菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)和致病性測(cè)定,利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定,結(jié)合核糖體 DNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS,internal transcribed spacer)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析,對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定;并進(jìn)行了藥劑篩選和藥效防治試驗(yàn),以期科學(xué)有效地指導(dǎo)該病害的識(shí)別與防控。

1 材料與方法

1.1 采樣與分離

從上海迪士尼樂(lè)園西北苗圃‘芽黃’紅瑞木上采集發(fā)病枝條,對(duì)癥狀典型的病枝進(jìn)行病原菌分離[3]:取發(fā)病枝條病健交界處表面積4 mm×2 mm植物組織,70%乙醇消毒2～3 s,5%次氯酸鈉消毒2 min,在無(wú)菌水中漂洗3次后晾干,置于含0.2%乳酸的PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng),5 d后挑取組織塊周圍的菌絲轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)、純化,必要時(shí)用孢子稀釋法進(jìn)行單孢分離。對(duì)分離物歸類、編號(hào)和轉(zhuǎn)管4℃保存。

1.2 致病性測(cè)定

將菌株于PDA平板上25℃恒溫培養(yǎng)5 d,用無(wú)菌手術(shù)刀將菌絲塊切成5 mm×3 mm大小。選取‘芽黃’紅瑞木健康植株,用無(wú)菌手術(shù)刀輕輕劃傷枝條表皮,將菌絲塊正面朝向傷口,用已浸濕無(wú)菌水的脫脂棉保濕傷口,并對(duì)接種枝條套袋保濕24 h。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù),并設(shè)置清水對(duì)照。接種后分別于7 d和14 d觀察并記錄發(fā)病情況,對(duì)發(fā)病枝條進(jìn)行病原菌再分離及再次進(jìn)行致病性測(cè)定。

1.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將致病菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng)3～7 d,觀察菌落形態(tài)特征,在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子形態(tài),并測(cè)量其大小,鑒定。

1.4 病原菌rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增與序列分析

1.4.1 基因組DNA提取

將致病菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上,于25℃培養(yǎng)5～7 d,在平板上倒入液氮,用滅菌的載玻片刮取菌絲至研缽研磨,采用改良的CTAB法提取基因組DNA[4]。

1.4.2 rDNA-ITS PCR擴(kuò)增和純化

采用真菌核糖體rDNA ITS區(qū)域通用引物ITS1-fungl和ITS4 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列如下:ITS1-fungl(5′-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3′),ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系總體積25 μL,包括:10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP mix(各25 mmol/L)2 μL,MgCl2(25 mmol/L)1.5 μL,真菌通用引物ITS1/ITS4(20 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板0.5 μL(50 ng/μL),rTaq(5 U/μL)0.125 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性15 s,50℃退火45 s,72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,并用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)切膠純化后獲得目的基因片段。

1.4.3 目的片段的克隆測(cè)序及序列分析

通過(guò)pMD19-T Vector(TaKaRa)對(duì)純化后DNA片段進(jìn)行克隆,藍(lán)白斑篩選后將陽(yáng)性單克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.gov)中Blast同源比對(duì),向GenBank提交基因序列。參照J(rèn)eewon等[5]對(duì)Pestalotiopsis部分種構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,使用Mega5.0軟件Maximum likelihood分析方法,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。相關(guān)序列基本信息見表1。

表1 本研究中參與系統(tǒng)發(fā)育樹分析的序列1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

種類Species寄主Host地理來(lái)源GeographicoriginGenBankaccessionno.PestalotiopsismicrosporaAegicerascornilatum中國(guó)香港HongKong,ChinaAF409958Pestalotiopsisneglecta省藤屬Calamussp.澳大利亞AustraliaAF409975Pestalotiopsispalmarum棕櫚樹Palm澳大利亞AustraliaAF409990Pestalotiopsispauciseta荊豆Ulexeuropaeus新西蘭NewZealandAF409972Pestalotiopsisrhododendri方葉五月茶Antidesmaghaesembilla澳大利亞AustraliaAF409986Pestalotiopsissydowiana密花普羅梯亞木Proteamellifera南非SouthAfricaAF409970Pestalotiopsistheae密花普羅梯亞木Proteamellifera南非SouthAfricaAF405297Pestalotiopsisversicolor1Garciamangostana澳大利亞AustraliaAF409993Pestalotiopsisversicolor2番石榴Psidiumguajava澳大利亞AustraliaAF405298Pestalotiopsisvismiae針墊花屬Leucospermumsp.美國(guó)夏威夷Hawaii,USAAF409977Pestalotiopsissp.1Garciamangostana澳大利亞AustraliaAF409984Pestalotiopsissp.2甘蔗Saccharumofficinarum中國(guó)香港HongKong,ChinaAF409968Pestalotiopsissp.3紅千層屬Callistemonsp.澳大利亞AustraliaAF409985Pestalotiopsissp.4卡西豬籠草Nepentheskhasiana澳大利亞AustraliaAF409989Pestalotiopsissp.5/中國(guó)香港HongKong,ChinaAF409992Pestalotiopsissp.6寶特豬籠草Nepenthestruncata 菲律賓PhilippinesAF409991Pestalotiopsissp.7針墊花屬Leucospermumsp.南非SouthAfricaAF409961Pestalotiopsissp.EN8小草海桐Scaevolahainanensis中國(guó)香港HongKong,ChinaAF405294Pestalotiopsissp.8針墊花屬Leucospermumsp.南非SouthAfricaAF409980Pestalotiopsissp.EN9小草海桐Scaevolahainanensis中國(guó)香港HongKong,ChinaAF409963Pestalotiopsissp.9針墊花屬Leucospermumsp.南非SouthAfricaAF409979Pestalotiopsissp.EN12小草海桐Scaevolahainanensis中國(guó)香港HongKong,ChinaAF409994SeiridiumcardinaleCupressocyparisleylandii新西蘭NewZealandAF409995UnculturedPestalotiopsiscloneC138O9*高良姜Alpiniaofficinarum中國(guó)ChinaKF718252Pestalotiopsissp.C6b2b*檸檬Citruslimon喀麥隆CameroonJX436803Pestalotiopsissp.14JAES*Maytenusilicifolia巴西BrazilEF45179915SH-W2*‘芽黃’紅瑞木Cornusalba‘Bud’sYellow’中國(guó)ChinaKT953379

1) 未標(biāo)注*的種類,均參考Jeewon等[5]。 Refer to Jeewon et al[5]for the species (genus) without the label *.

1.5 藥劑防治試驗(yàn)

1.5.1 供試藥劑

25%嘧菌酯懸浮劑(SC)(先正達(dá)中國(guó)投資有限公司);10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(WG)(先正達(dá)中國(guó)投資有限公司);80%代森錳鋅可濕性粉劑(WP)(南通德斯益農(nóng)化工有限公司);50%多菌靈可濕性粉劑(WP)(上海悅聯(lián)化工有限公司);25%丙環(huán)唑乳油(EC)(先正達(dá)中國(guó)投資有限公司)。

1.5.2 室內(nèi)藥劑篩選

采用菌落生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試藥劑對(duì)致病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。將菌株接種在PDA培養(yǎng)基上,于25℃ 培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d,用直徑5 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌碟,菌絲面向下置于含質(zhì)量濃度 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2 μg /mL的PDA平板上,每處理重復(fù)3次,并設(shè)無(wú)藥空白對(duì)照。25℃黑暗培養(yǎng),待對(duì)照平板的菌落直徑長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑約 2/3 時(shí),用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(處理菌落直徑-菌餅直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成幾率值(y),藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(x),按濃度對(duì)數(shù)與幾率值回歸法求得線性回歸方程y=a+bx,并計(jì)算各供試藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度(EC50)、幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間回歸的相關(guān)系數(shù)r值。

1.5.3 田間藥效防治試驗(yàn)

于2014年在上海迪士尼西北苗圃進(jìn)行田間藥效防治試驗(yàn)。采用噴霧的方法,連續(xù)施藥3次,間隔期為14 d左右。每個(gè)藥劑處理100盆‘芽黃’紅瑞木,并設(shè)清水對(duì)照。第一次施藥前將所有具明顯病斑的枝條剪除。每次藥后14 d調(diào)查發(fā)病情況。并計(jì)算株發(fā)病率、病情指數(shù)及防治率。病害調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí), 無(wú)枝枯;1級(jí), 1枝無(wú)分枝的小枝枯萎;2級(jí), 無(wú)分枝的小枝枯萎,數(shù)目大于1枝;3級(jí), 1枝有頂級(jí)分枝的枝條枯萎;4級(jí), 有頂級(jí)分枝的枝條枯萎且枝條枯萎?dāng)?shù)目大于1枝;5級(jí), 1枝或1枝以上基部大枝(至少有兩級(jí)分枝)枯萎;6級(jí),整株枯萎。株發(fā)病率的計(jì)算公式為:株發(fā)病率(%)=發(fā)病株數(shù)×100/總株數(shù);株發(fā)病防治效果(%)=(1-處理株發(fā)病率/對(duì)照株發(fā)病率)×100;病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值);病情指數(shù)防治效果(%)=(1-處理病情指數(shù)/對(duì)照病情指數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察

‘芽黃’紅瑞木潰瘍病在上海始發(fā)于6月初,發(fā)病初期受害枝條表皮上出現(xiàn)長(zhǎng)約3 mm的黑褐色、兩端稍尖的長(zhǎng)橢圓形病斑,隨著病情的發(fā)展,病斑逐步擴(kuò)大,長(zhǎng)達(dá)數(shù)厘米,或擴(kuò)展成片,呈不規(guī)則狀,使枝條表皮環(huán)狀壞死,導(dǎo)致病斑壞死部分上端枝條枯死,葉片枯萎(圖1a)。病原菌既可侵染植株頂部較小的分枝,導(dǎo)致分枝枯死,也可侵染植株主干基部,導(dǎo)致整株植物枯萎死亡。

圖1 紅瑞木枝干潰瘍病癥狀及病原菌形態(tài)Fig.1 Symptoms of infected branch of Cornus alba and morphology of the pathogen Pestalotiopsis sp. causing trunk canker

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌分離、鑒定及致病性測(cè)定

從采集的發(fā)病‘芽黃’紅瑞木中,挑取5個(gè)癥狀典型的病斑,從每個(gè)病斑的病健交界處各切取3塊植物組織進(jìn)行分離,培養(yǎng)后獲得15個(gè)單菌落。其中5個(gè)菌落顏色為白色,從中隨機(jī)挑取2個(gè)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)移培養(yǎng),分別編號(hào)為15SH-W1, 15SH-W2。其余10個(gè)菌落形態(tài)特征一致,顏色均為灰色,從中隨機(jī)挑取4個(gè)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)移培養(yǎng),分別編號(hào)為15SH-G1, 15SH-G2, 15SH-G3, 15SH-G4。將上述6株編號(hào)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定,結(jié)果見表2,15SH-W1和15SH-W2接種后植株均表現(xiàn)發(fā)病,而4株菌落顏色為灰色的菌株和對(duì)照接種后不發(fā)病。對(duì)致病的菌株15SH-W1和15SH-W2接種產(chǎn)生的病斑進(jìn)行了再分離培養(yǎng)和觀察。

在PDA培養(yǎng)基上,菌株15SH-W1和15SH-W2氣生菌絲較濃密,呈絨毛狀,白色,至生長(zhǎng)后期,其上產(chǎn)黑色的分生孢子器(圖1b)。顯微觀察,分生孢子呈紡錘形,分生孢子大小為(29.14±2.25)μm×(7.12±0.39)μm,分生孢子具有4個(gè)分隔,將分生孢子分為5個(gè)細(xì)胞,中間3個(gè)細(xì)胞顏色為深色,且為異色。兩端兩個(gè)細(xì)胞無(wú)色,近三角形。頂部細(xì)胞直接著生3根附屬絲(長(zhǎng)度為30.77±2.81 μm),附屬絲頂端不呈匙狀,基部細(xì)胞著生一根較短的附屬絲(長(zhǎng)度為7.78±1.96 μm)(圖1c)。從接種病斑上重新分離的病原菌與上述形態(tài)描述一致。根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子特征,參照真菌分類相關(guān)文獻(xiàn)[6-8],認(rèn)為上述特征符合擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis分類特征,將此病原菌鑒定為擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.。

為驗(yàn)證菌株致病性,選擇下列菌株再次接種:15SH-W1,菌株15SH-W1的單孢分離菌株,編號(hào)為15SH-W1(SC),菌株15SH-W1的回收分離菌株,編號(hào)為15SH-W1(E),菌株15SH-W2的回收分離菌株,編號(hào)為15SH-W2(E)。從表2結(jié)果可知,上述4株菌株接種的植株均表現(xiàn)為發(fā)病,而對(duì)照不發(fā)病。因此可確定分離獲得的擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.菌株是 ‘芽黃’紅瑞木潰瘍病的致病病原菌。

表2 ‘芽黃’紅瑞木潰瘍病病原菌致病性測(cè)定

2.2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用引物 ITS1-fungl 和ITS4 對(duì)15SH-W2 菌株基因組DNA PCR擴(kuò)增獲得了1條600 bp左右的清晰條帶。將目標(biāo)條帶回收純化,并克隆測(cè)序后得到了長(zhǎng)度為590 bp 的rDNA-ITS 序列。將該序列(已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào):KT953379)在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì),結(jié)果顯示所測(cè)的序列與多株擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)菌株序列(登錄號(hào):KF718252.1,KF718250.1,EF451804.1,KF718249.1,JX436803.1,EF451799.1)相似度均較高,達(dá)到99%。由于以上序列均未能鑒定到種,同時(shí)比對(duì)結(jié)果中相似度達(dá)98%以上的序列很多,且參比序列是擬盤多毛孢屬下不同種,Blast比對(duì)結(jié)果表明15SH-W2屬于擬盤多毛孢屬,但不能鑒定到屬下種級(jí)分類單元。

基于表1菌株序列,參照J(rèn)eewon等[5]運(yùn)用MEGA 5.0軟件采用Maximum Likelihood分析方法,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap值為1 000。聚類分析結(jié)果顯示,所選序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支自展值較高,在屬內(nèi)主要分為X、Y、Z三大分支。所測(cè)菌株15SH-W2與Blast同源性比對(duì)中同源性最高的菌株序列(KF718252,JX436803,EF451799)均在X分支下(圖2),表明它們之間遺傳距離較近。擬盤多毛孢屬下分為三大類群的結(jié)果與Jeewon等[5]利用ITS和5.8S序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹所得到的結(jié)果一致。同時(shí),Jeewon等[5]的研究結(jié)果表明,這3個(gè)基于分子系統(tǒng)發(fā)育信息分類的類群,與以下基于形態(tài)特征區(qū)分的類群完全吻合:X類群形態(tài)特征為中間細(xì)胞異色且頂端細(xì)胞附屬絲頂部不存在匙狀凸起,Y類群特征為中間細(xì)胞同色且頂端細(xì)胞附屬絲頂部存在匙狀凸起,Z類群特征為中間細(xì)胞同色且頂端細(xì)胞附屬絲頂部不存在匙狀凸起。本研究中引起“芽黃”紅瑞木潰瘍病的病菌在形態(tài)學(xué)特征上符合X類群特征:中間細(xì)胞異色,頂端附屬絲頂部不存在匙狀凸起。

圖2 基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS sequences of the 15SH-W2 and other isolates from GenBank

2.3 藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果

表3結(jié)果表明,5種殺菌劑EC50值較接近,80%代森錳鋅可濕性粉劑的EC50值最低,為0.639 mg/L,25%嘧菌酯懸浮劑EC50值最高,為1.787 mg/L。

2.3.2 室外藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果

從表4室外防治試驗(yàn)結(jié)果可知,第1次和第2次藥后調(diào)查,對(duì)照的病情指數(shù)分別為4.20和6.00,病害發(fā)生程度較輕。此時(shí),25%丙環(huán)唑乳油和25%嘧菌酯懸浮劑均有較好的防治效果,第1次藥后防治效果分別達(dá)到95.24%和85.71%,第2次藥后分別達(dá)到90.00%和80.00%。但隨著病害的發(fā)展,第3次藥后調(diào)查,對(duì)照的病情指數(shù)達(dá)到17.40時(shí),4種殺菌劑對(duì)病害的防治效果均小于50%。

表3 5種殺菌劑對(duì)‘芽黃’紅瑞木潰瘍病菌Pestalotiopsis sp.的室內(nèi)毒力測(cè)定

表4 4種殺菌劑對(duì)‘芽黃’紅瑞木潰瘍病的田間防治效果

3 討論

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis由Steyaert[9]1949年建立,但多年以來(lái)Guba[10]、Sutton[7]、Nag Raj[11]等分類系統(tǒng)對(duì)基于形態(tài)特征進(jìn)行的該屬及近似屬的分類一直存在爭(zhēng)議。近年來(lái),根據(jù)Jeewon等[6]、韋繼光等[12]基于分子系統(tǒng)發(fā)育對(duì)該屬及近似屬的研究,表明Sutton[7]的分類方法比較接近基于分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)所得到的分類結(jié)果。目前認(rèn)為穩(wěn)定的擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis具有以下形態(tài)特征[8]:分生孢子具有多根頂端附屬絲,分生孢子 5個(gè)細(xì)胞, 頂端附屬絲不分支或非二叉分支。本研究中“芽黃”紅瑞木潰瘍病菌符合上述形態(tài)特征,因此將其鑒定為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsissp.。

同時(shí)本研究采用rDNA-ITS序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法對(duì)菌株15SH-W2進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。對(duì)rDNA-ITS片段在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast同源比對(duì)結(jié)果表明菌株15SH-W2屬于擬盤多毛孢屬的一種,與形態(tài)學(xué)方法鑒定結(jié)果一致。但由于該屬內(nèi)rDNA-ITS片段種間相似度較高,僅憑rDNA-ITS難以將此菌株鑒定到種一級(jí)分類單元。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與菌株15SH-W2處于同一分支上有多個(gè)不同種類的擬盤多孢屬菌株,表明這些菌株間遺傳距離較近,同源性較高,相互之間難以區(qū)分。過(guò)去擬盤多毛孢屬種內(nèi)鑒定多以分生孢子大小和寄主為依據(jù),致使全世界已報(bào)道擬盤多毛孢屬內(nèi)種多達(dá)241個(gè),然而Jeewon等[6]、韋繼光等[12]結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果,認(rèn)為寄主完全不能作為擬盤多毛孢種內(nèi)分類的依據(jù),分生孢子大小也只能作為種內(nèi)分類的次要依據(jù)。因此,當(dāng)前擬盤多毛孢內(nèi)的分類未能建立一個(gè)比較完善的分類檢索體系, 仍然處于比較混亂的狀態(tài)[8],將擬盤多毛孢鑒定到具體的種較為困難。

擬盤多毛孢屬包含很多種植物病原真菌,同時(shí),該屬也是木本植物上一類重要的內(nèi)生真菌。本研究Blast比對(duì)結(jié)果表明,具有與15SH-W2序列相似性最高的菌株,如KF718252.1、KF718250.1、EF451804.1、KF718249.1、JX436803.1、EF451799.1等均被報(bào)道為內(nèi)生真菌。韋繼光等[15]根據(jù)rDNA-ITS 序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明, 同一種擬盤多毛孢不論其為內(nèi)生性或是病原性的,均可聚在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一個(gè)分支下。本研究中,Blast比對(duì)結(jié)果顯示引起‘芽黃’紅瑞木潰瘍病的Pestalotiopsissp.與部分內(nèi)生性菌株相似性較高。韋繼光等[15]認(rèn)為某些擬盤多毛孢在不同(或相同)的植物中可以表現(xiàn)為內(nèi)生狀態(tài)或病原狀態(tài), 內(nèi)生擬盤多毛孢在一定條件下可以轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡瓟M盤多毛孢,如茶擬盤多毛孢Pestalotiopsistheae是茶的病原真菌, 在金花茶枝葉和羅漢松枝上是內(nèi)生真菌。因此,引起‘芽黃’紅瑞木潰瘍病的Pestalotiopsissp.是否在某些環(huán)境條件下,也可作為內(nèi)生真菌存在于健康植株或其他植物中,也值得進(jìn)一步研究。

紅瑞木潰瘍病在上海地區(qū)發(fā)生均較為普遍,造成植株部分枝條枯萎,甚至植株整株枯死。羅卿權(quán)等[16]對(duì)辰山植物園從國(guó)外引進(jìn)的一種紅瑞木品種Cornusalba‘Sphaethii’上潰瘍病進(jìn)行的病原菌鑒定結(jié)果表明,其由葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea引起。研究顯示,在美國(guó),山茱萸屬植物Cornusspp.廣泛受到山茱萸炭疽病(dogwood anthracnose)的危害,其病原菌被鑒定為Disculadestractiva[17],除危害葉片外,其也會(huì)引起莖稈上的黑色壞死斑。本研究中,上海迪士尼樂(lè)園中的‘芽黃’紅瑞木由華北地區(qū)大量引種,引起其潰瘍病的病原菌被鑒定為Pestalotiopsissp.。因此,在上海已鑒定的引起紅瑞木潰瘍病的病原菌至少存在2種,但這2種病原菌均分離自較小的種植區(qū)域,且2個(gè)種植區(qū)域所種植的紅瑞木品種不同,引種來(lái)源地不同。因此在上海地區(qū)種植的紅瑞木上引起潰瘍病的主要病原菌是何種仍需進(jìn)行大量的取樣和分離才能確定。

盡管室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)中的幾種藥劑均對(duì)病原菌有不同程度的抑制作用,然而室外藥效試驗(yàn)對(duì)該病害的防控不盡如人意。在發(fā)病初期,25%丙環(huán)唑乳油和25%嘧菌酯懸浮劑防治效果可達(dá)80%以上,但當(dāng)病害發(fā)展后,供試4種殺菌劑對(duì)病害的防治效果均小于50%。本研究未能找到一種能夠有效控制該病害的殺菌劑。防治此病害應(yīng)全面開展綜合治理措施,如修剪發(fā)病枝條,尤其是結(jié)合冬季修剪降低病原基數(shù),合理配置,增加通風(fēng)透光條件,結(jié)合在發(fā)病之前或發(fā)病初期進(jìn)行藥劑預(yù)防或早期控制。

[1] 丘榮, 郭翎. 北京地區(qū)彩色植物的應(yīng)用[J]. 北京園林,2014, 30(2): 34-39.

[2] 張?zhí)祺? 園林樹木1600種[M]. 北京:中國(guó)建筑工業(yè)出版社, 2010:338.

[3] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 第3版. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998:122-145.

[4] Nicholson P, Parry D W. Development and use of a PCR assay to detectRhizoctoniacerealis, the cause of sharp eyespot in wheat [J]. Plant Pathology, 1996,45(5): 872-883.

[5] Jeewon R, Liew E C Y, Simpson J A, et al. Phylogenetic significance of morphological characters in the taxonomy ofPestalotiopsisspecies[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003, 27(3): 372-383.

[6] Jeewon R, Liew E C Y, Hyde K D. Phylogenetic relationships ofPestalotiopsisand allied genera inferred from ribosomal DNA sequences and morphological characters[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2002, 25 (3): 378-392.

[7] Sutton B C.The Coelomycetes, fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and stromata[M]. Kew UK: Common Wealth Mycological Institute, 1980.

[8] 韋繼光, 徐同, 潘秀湖, 等. 擬盤多毛孢屬的分類學(xué)研究進(jìn)展[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2006,25(1):78-85.

[9] Steyaert R L. Contribution à l′étude monographique dePestalotiade Not. etMonochaetiaSacc.(Truncatellagen. nov. etPestalotiopsisgen. nov.)[J]. Bulletin du Jardin Botanique de l’Etat, Bruxelles/Bulletin van den Rijksplantentuin, Brussel, 1949: 285-354.

[10]Guba E F. Monograph ofMonochaetiaandPestalotia[M]. Massachusetts, U. S. A.: Harvard University Press, 1961: 54-262.

[11]Nag Raj T R. Coelomycetous anamorphs with appendage-bearing conidia [M]. Waterloo, Ont ario, Canada: Mycologue Publications, 1993: 565-945.

[12]韋繼光,徐同,郭良棟,等.從分子系統(tǒng)學(xué)的角度分析擬盤多毛孢屬及其近緣屬的界限[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2005,24(3):200-204.

[13]劉愛(ài)榮. 海南植物內(nèi)生擬盤多毛孢的多樣性及擬盤多毛孢屬分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]. 杭州:浙江大學(xué), 2006.

[14]Jeewon R, Liew E C Y, Hyde K D. Phylogenetic evaluation of species nomenclature ofPestalotiopsisin relation to host association [J]. Fungal Diversity, 2004, 17(3):39-55.

[15]韋繼光,徐同,黃偉華,等. 從分子系統(tǒng)發(fā)育探討內(nèi)生擬盤多毛孢與病原擬盤多毛孢的關(guān)系[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2008, 34(4):367-373.

[16]羅卿權(quán), 徐穎, 劉美. 紅瑞木潰瘍病病原菌的鑒定[J]. 植物保護(hù),2012, 38(4): 115-117.

[17]Daughtrey M L, Hibben C R. Dogwood anthracnose: a new disease threatens two nativeCornusspecies [J]. Annual Review of Phytopathology, 1994, 32(1):61-73.

(責(zé)任編輯：田 喆)

Pathogen identification and fungicide control of trunk canker ofCornusalba‘Bud’s Yellow’

Luo Qingquan1, Lu Guangliang1, Wang Feng1, Zhou Kun2, Liu Yajie2, Wu Shiying3, Ji Guohui3, Xu Ying1

(1. Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning, Shanghai 200232, China;2. Shanghai Shendi Garden Investment and Construction Co., Ltd., Shanghai 201205, China;3. Shanghai Pudong District Forest Station, Shanghai 201210, China)

Trunk canker is a severe disease ofCornusalba‘Bud’s Yellow’ in Shanghai. The causal pathogen was identified asPestalotiopsissp. through isolation, pathogenicity determination and morphological identification. Phylogenetic analysis based on the comparison of rDNA-ITS sequences showed that this pathogen belonged to the clade possessing versicolorous median cells, which was consistent with the morphological result. The half maximal effective concentrations (EC50) of five fungicides were 0.639-1.787 μg/mL. Field trials showed that the control efficacy of 25% propiconazole emulsifiable concentrate and 25% azoxystrobin suspension were above 80% in early stage of the disease, while the control efficacies of all the four fungicides were less than 50% in the following stage of disease development.

Cornusalba‘Bud’s Yellow’; trunk canker;Pestalotiopsissp.; sensitivity determination; field trial

2016-05-24

2016-07-28

上海市浦東新區(qū)環(huán)保市容局科研項(xiàng)目

S 763.7

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.021

* 通信作者 E-mail: xuying20002@163.com