金 勤, 周國(guó)英, 劉君昂, 何苑皞

(中南林業(yè)科技大學(xué),森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410004)

細(xì)胞壁降解酶在油茶炭疽病菌致病過程中的作用研究

金 勤, 周國(guó)英*, 劉君昂, 何苑皞

(中南林業(yè)科技大學(xué),森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410004)

為明確細(xì)胞壁降解酶在油茶炭疽病菌致病過程中的作用,本文研究了活體內(nèi)外炭疽病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性及其對(duì)葉片的降解情況。結(jié)果表明,活體外以羧甲基纖維素鈉(CMCNa)為誘導(dǎo)底物,羧甲基纖維素酶(Cx酶)和漆酶活性最高;以柑橘果膠為誘導(dǎo)底物,果膠酶活性最高;以油茶葉為誘導(dǎo)底物,纖維素酶、果膠酶和漆酶可產(chǎn)生較高活力;并且經(jīng)5種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的酶液對(duì)葉片均有降解作用。發(fā)病葉片的各部位,以病健交界處細(xì)胞壁降解酶活性最高。接種4 d后開始發(fā)病,其細(xì)胞壁降解酶活性迅速增強(qiáng); 6 d后濾紙酶(FPA)、β-葡萄糖苷酶和漆酶活性達(dá)最大值,分別為4.53、7.44、1.21 U/mg;而 Cx酶和果膠酶在第8天時(shí)酶活性最高,分別為15.79和25.49 U/mg;接種10～16 d,酶活性比較穩(wěn)定。上述結(jié)果表明,纖維素酶、果膠酶和漆酶在油茶炭疽病菌致病過程中起重要作用。

油茶; 炭疽病菌; 細(xì)胞壁降解酶

油茶炭疽病是油茶Camelliaoleifera生產(chǎn)上的主要病害之一,其中以膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病最為常見。該病原菌具有潛伏侵染的特性,可以感染花、葉、果實(shí),引起嚴(yán)重的落花、落葉、落果。目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于油茶炭疽病病原的生物學(xué)特性、發(fā)生規(guī)律及生物防治菌劑的研究已有一些報(bào)道[1-5],但其致病機(jī)制尚不明確。了解細(xì)胞壁降解酶在炭疽病致病機(jī)理中的作用,對(duì)進(jìn)一步針對(duì)性地控制病害具有重要意義。李寶聚等[6-7]發(fā)現(xiàn)黃瓜黑星病菌Cladosporiumcucumerinum在瓜條感病的病健交界處產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性最高,且纖維素酶、果膠酶對(duì)黃瓜超微結(jié)構(gòu)有影響,可迅速消解葉片組織,引起軟腐。劉志恒等[8]報(bào)道接種黃瓜棒孢葉斑病菌Corynesporacassiicola后果膠酶活性先于纖維素酶達(dá)到高峰值,而且病菌在活體內(nèi)和活體外產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的活性明顯不同。陳曉林等[9]發(fā)現(xiàn)蘋果樹腐爛病菌Valsaceratosperma無論在活體組織內(nèi),還是在活體組織外，均能分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶—多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。楊媚等[10]研究表明內(nèi)切葡聚糖酶β-1,4-葡聚糖酶以羧甲基纖維素鈉為誘導(dǎo)物時(shí)活性最高,多聚半乳糖酵酸酶和果膠甲基半乳糖醛酸酶以果膠酶為誘導(dǎo)物時(shí)活性最高;通過酶處理葉片后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁降解酶確實(shí)對(duì)水稻葉片組織造成損傷,并且隨著酶濃度升高,損傷程度逐漸加重。

植物病原菌與寄主相互識(shí)別的過程中,病原菌分泌細(xì)胞壁降解酶,降解植物組織,更有利于病原菌的侵入、定殖與擴(kuò)展。因此,細(xì)胞壁降解酶是植物病原真菌的重要致病因子[11-12]。本試驗(yàn)通過油茶炭疽菌活體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和接種油茶葉片后,測(cè)定其產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性,分析比較其變化規(guī)律,為深入了解其致病機(jī)制、制定油茶炭疽病的綜合防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和培養(yǎng)基

供試菌株:膠孢炭疽菌,中南林業(yè)科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存;供試油茶:‘湘林210’,兩年生盆栽苗,購(gòu)于湖南省林業(yè)種苗中心。

酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用Czaper液體培養(yǎng)基[13]并稍作改良:KNO32.0 g,KCl 0.5 g,FeSO40.01 g,K2HPO41.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,果膠10 g,水1 000 mL, pH 5.0。分別以相同質(zhì)量的蔗糖、麩皮、羧甲基纖維素鈉(CMCNa)和油茶葉片代替果膠得到不同誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基。

1.2 離體培養(yǎng)條件下油茶炭疽病菌細(xì)胞壁降解酶的提取及純化

將PDA培養(yǎng)基上活化好的炭疽菌用6 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅,挑取6塊菌塊接種至150 mL誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,置于28℃下連續(xù)振蕩培養(yǎng)7 d,取出培養(yǎng)濾液經(jīng)4層紗布過濾以除去菌絲,然后4℃下10 000 r/min離心15 min,棄去沉淀,上清液備用。

向?yàn)V液中加入飽和度為60%的(NH4)2SO4,在4℃下靜置5 h,然后4℃、10 000 r/min離心20 min得到沉淀,用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解沉淀。在同樣的緩沖液中,于4℃下透析24 h,每12 h換一次透析液,純化的酶在-20℃下保存。

1.3 炭疽病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶對(duì)油茶葉片的降解作用

采用離體葉片浸漬法,將1.2中得到的經(jīng)5種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的酶液各20 mL,分別滴加在培養(yǎng)皿內(nèi)的棉花上,使棉花完全潤(rùn)濕。取油茶嫩葉,平鋪在棉花上(正面向下)。同時(shí),接種炭疽菌菌塊的葉片平放在墊有濕潤(rùn)棉花(無菌水浸濕)的培養(yǎng)皿中,20℃左右光照條件下培養(yǎng),3 d后觀察葉片變化情況,以煮沸滅活的酶液為對(duì)照處理。

1.4 活體內(nèi)油茶葉片不同部位炭疽病菌細(xì)胞壁降解酶的提取

將活化好的炭疽病菌接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基中央,在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d,再用滅菌的牙簽將菌絲涂斷,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d,菌落表面產(chǎn)生橘紅色的分生孢子堆。無菌蒸餾水沖洗平板,制備孢子懸浮液,經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整孢子濃度至1×106個(gè)/mL。

采用噴霧法向油茶苗均勻地噴灑孢子懸浮液,每株接種20 mL,共接種100株,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從發(fā)病的油茶葉片病斑處、病健交界處、健處分別切取0.2 cm2的組織,取樣時(shí)間為接種后 5 d,3次重復(fù)。按1 g鮮重加入5 mL濃度1 mol/L NaCl提取液(20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液,pH 7.4),在4℃研磨、過濾,并8 000 r/min離心,上清液按照1.2的方法經(jīng)提純后備用。

1.5 人工接種發(fā)病葉細(xì)胞壁降解酶活性的動(dòng)態(tài)變化

于接種后4、6、8、10、12、14、16 d取病健交界處組織,3次重復(fù),細(xì)胞壁降解酶的提取方法同1.4,以接種無菌水處理為對(duì)照。

1.6 細(xì)胞壁降解酶活性測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

羧甲基纖維素酶(Cx)、濾紙酶(FPA)、果膠酶(PMG)活力測(cè)定參考李寶聚等[6]的方法;β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定參考Douaiher等[14]的方法;漆酶活性測(cè)定參考詹旭等[15]的方法。

纖維素酶(羧甲基纖維素鈉酶、濾紙酶和β-葡萄糖苷酶)和果膠酶1個(gè)酶活力單位(U)為每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μg還原糖所需的酶量。漆酶1個(gè)酶活力單位為1 min引起0.01個(gè)A值的增加所需的酶量。

蛋白質(zhì)含量按Bradford的方法,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),用考馬斯亮藍(lán)G-250顯色測(cè)定。3,5-二硝基水楊酸法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有的測(cè)定試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體外炭疽病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性

由表1可知,炭疽病菌在添加蔗糖、果膠、麩皮、CMCNa、油茶葉片5種誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生羧甲基纖維素酶、果膠酶和漆酶,但不同誘導(dǎo)物產(chǎn)生的酶活力存在較大差異。在以CMCNa為碳源的培養(yǎng)基中,Cx酶和漆酶活性分別為73.20 U/mg和4.50 U/mg,均顯著高于其他誘導(dǎo)物產(chǎn)生的酶活性(P<0.05);而以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中,Cx酶活性最低。在以果膠為碳源的培養(yǎng)基中,果膠酶活性顯著高于其他誘導(dǎo)物產(chǎn)生的果膠酶活性(P<0.05), CMCNa和蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的果膠酶活性較低。油茶葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均能檢測(cè)出較高活性的Cx酶、果膠酶和漆酶,說明油茶葉片能夠誘導(dǎo)炭疽病菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶。

1) 同列數(shù)據(jù)后具不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 Data followed by different letters in the same column are significantly different at 0.05 level.

2.2 炭疽病菌活體外誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的降解作用

以菌絲塊和蔗糖、果膠、麩皮、CMCNa、油茶葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶(經(jīng)提純的)分別接種油茶葉片,圖1結(jié)果顯示:接種菌絲塊的病葉初期呈黑色斑點(diǎn),然后逐漸變成黑褐色病斑。接種滅活酶液的對(duì)照葉片在3 d內(nèi)沒有出現(xiàn)受害癥狀,仍然保持健康狀態(tài);而5種不同處理的酶液均對(duì)葉片有明顯的降解作用,但有一定差異。蔗糖、果膠、油茶葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶液對(duì)葉片降解程度輕,葉片局部褐變并有水漬化癥狀。麩皮誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶液作用于葉片后,葉片大面積出現(xiàn)黑色,并有輕微的腐爛癥狀。CMCNa誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶液對(duì)葉片降解程度高,整個(gè)葉片呈現(xiàn)黑色。葉片上病斑大小依次為CMCNa>麩皮>油茶葉片>果膠>蔗糖>菌絲塊。(見圖1)

2.3 活體內(nèi)炭疽病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性

人工接種后發(fā)病的油茶葉片病斑處、病健交界處和健處3種酶活力如表2所示。Cx酶、果膠酶、漆酶在病葉不同部位的酶活性差異明顯,以病健交界處酶活性最高,病斑處次之,健處最低,并且在健處檢測(cè)不到果膠酶和漆酶活性。由此可見,在炭疽病菌的致病過程中,纖維素酶、果膠酶、漆酶這3種酶均起到了作用。

2.4 人工接種油茶葉片細(xì)胞壁降解酶活性的動(dòng)態(tài)變化

油茶葉片發(fā)病后,纖維素酶活性變化見圖2。Cx酶活性迅速增高,接種后第8天活性為15.79 U/mg,達(dá)到最高峰;然后酶活性降低,第10～16 天酶活性下降趨勢(shì)平緩。接種后4～6 d,FPA酶和β-葡萄糖苷酶活性上升緩慢,均在第6 天酶活性最高,分別為4.53、7.44 U/mg;6～12 d酶活性比較穩(wěn)定,12 d后開始下降,到16 d時(shí)仍可檢測(cè)到FPA酶和β-葡萄糖苷酶活性。圖3結(jié)果顯示,接種后4～8 d,果膠酶活性呈近直線上升趨勢(shì),之后活性迅速降低,10 d后活性達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),第16 天酶活性為21.95 U/mg。圖4結(jié)果表明,接種4～6 d的時(shí)間里,漆酶活性增幅最大,6 d時(shí)酶活性為最大值1.21 U/mg;之后,隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低;至第16 天時(shí),漆酶活性為0.79 U/mg。從以上試驗(yàn)結(jié)果可知,隨著病斑的逐漸擴(kuò)展,各種酶活性呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的過程,均在10 d后活性穩(wěn)定。同時(shí)也表明,在整個(gè)發(fā)病過程中,細(xì)胞壁降解酶是油茶葉片組織變化的主要因素。

圖1 炭疽病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶對(duì)油茶葉片的降解作用Fig.1 Degradation of Camellia oleifera leaves by cell wall-degrading enzymes produced by Colletotrichum gloeosporioides

葉片部位Partofleaf細(xì)胞壁降解酶活力/U·mg-1 Activityofcellwall-degradingenzymeCx酶Cellulase果膠酶Pectinase漆酶Laccase病斑處Diseasedpart(5.60±0.11)b(7.94±0.18)b(0.52±0.14)b病健交界處Boundarybetweendiseasedandhealthyarea(15.95±0.73)a(21.49±3.64)a(1.18±0.17)a健處Healthypart(4.67±0.09)c00

圖2 病健交界處纖維素酶活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Changes of cellulase activity along the boundary between diseased and healthy area

圖3 病健交界處果膠酶活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Changes of pectinase activities in boundary between diseased and healthy area

圖4 病健交界處漆酶活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Changes of laccase activity along the boundary between diseased and healthy areas

3 討論

油茶炭疽病的致病機(jī)理問題至今少見相關(guān)報(bào)道。我們檢測(cè)了活體內(nèi)外炭疽病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),活體外試驗(yàn)中炭疽病菌在不同誘導(dǎo)物培養(yǎng)基產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性差異明顯,并且以蔗糖為誘導(dǎo)物時(shí),纖維素酶、果膠酶、漆酶的活性均最低。這可能因?yàn)樵谝哉崽菫樘荚吹呐囵B(yǎng)體系中,蔗糖對(duì)細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生起阻遏作用[6]。接種5種不同碳源誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶液后,新鮮健康的葉片都產(chǎn)生了病斑,接種滅活酶液的葉片無明顯變化。由此推測(cè),細(xì)胞壁降解酶是該病原菌致病的因子之一。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng),5種酶活性均呈現(xiàn)“先增后降最后穩(wěn)定”的趨勢(shì);發(fā)病初期酶活性升高,接種10 d后,酶活性穩(wěn)定,說明細(xì)胞壁降解酶參與了病斑的擴(kuò)展過程。本研究還發(fā)現(xiàn),炭疽病菌在活體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性明顯低于活體外?；铙w內(nèi)和活體外的環(huán)境因素不同,導(dǎo)致酶活性差異較大。活體外酶活性分析時(shí),應(yīng)多考慮溫度、pH值、底物濃度等對(duì)酶活性的影響,但活體內(nèi)產(chǎn)生的酶接近自然發(fā)病情況,具有實(shí)際研究意義[16-17]。

植物病原菌在對(duì)寄主植物侵染致病過程中可產(chǎn)生一系列的細(xì)胞壁降解酶,通過酶解植物多糖來破壞和分解細(xì)胞壁,以提供自身營(yíng)養(yǎng)并促進(jìn)其對(duì)寄主組織的侵入和擴(kuò)展[18-19]。諸多研究表明,纖維素酶和果膠酶在病原菌致病過程中起重要作用[20-23]。本試驗(yàn)分析了主要的細(xì)胞壁降解酶活性的動(dòng)態(tài)變化,包括Cx酶、FPA酶、β-葡萄糖苷酶、PMG酶、漆酶,這也是首次分析油茶葉片中漆酶的活性變化。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶類,能夠降解木質(zhì)素纖維。最初發(fā)現(xiàn)于漆樹漆液中,隨后發(fā)現(xiàn)某些高等真菌也能分泌該酶[24]。這說明油茶葉片內(nèi)可能含有能夠誘導(dǎo)炭疽病菌產(chǎn)生漆酶的多酚類化合物,漆酶對(duì)這些物質(zhì)的氧化加速了葉片組織的降解。

本試驗(yàn)僅考察了油茶炭疽病菌在活體內(nèi)外產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的活性,從一個(gè)方面說明了這些酶在病原菌致病過程中的作用。但植物病原菌侵入寄主是一個(gè)復(fù)雜的過程,除了能向外分泌細(xì)胞壁降解酶外,往往還可以產(chǎn)生毒素、激素及胞外多糖等致病物質(zhì)[25-26]。因此,究竟是哪一種致病因子起主導(dǎo)作用以及它們之間如何協(xié)調(diào)作用,有待進(jìn)一步研究。另外,我們也可以嘗試去探究病原菌纖維素酶、果膠酶、漆酶產(chǎn)生的分子基礎(chǔ),進(jìn)而揭示炭疽病菌的致病機(jī)理。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

The role of cell wall-degrading enzymes in the pathogenic process ofCamelliaoleiferadisease caused byColletotrichumgloeosporioides

Jin Qin, Zhou Guoying, Liu Jun’ang, He Yuanhao

(Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests;Key Laboratory ofCultivation and Protection for Non-wood Forest Trees of Ministry of Education, CentralSouth University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

The research aims to estimate the role of cell wall-degrading enzymes(CWDEs) in the pathogenic process ofCamelliaoleiferaanthracnose caused byColletotrichumgloeosporioides. CWDEs produced byC.gloeosporioidesbothinvitroandinvivowere studied. The results showed that, with carboxymethyl cellulose sodium(CMCNa)as the inducer substrate, the activities of carboxymethyl cellulase and laccase were the highest, whereas citrus pectin was the best for pectinase.C.gloeosporioidescould produce highly active cellulase, pectinase and laccase induced byC.oleiferaleaves, and all enzyme liquids produced by the 5 inducers had degradation activity against leaves. Among each part of the diseased leaves, the activity of the CWDEs along the boundary between diseased and healthy areas was the highest. The activities of the CWDEs rapidly increased 4 days after inoculation when the leave symptoms emerged. The activities of filter paper enzyme (FPA),β-glucosidase and laccase with a maximum value in the 6th day after inoculation, were 4.53 U/mg, 7.44 U/mg, and 1.21 U/mg, respectively. But carboxymethyl cellulase(Cx)and pectinase reached at the peak in the 8th day after inoculation. The activities of the CWDEs were very stable from the 10th to 16th days after inoculation. These results demonstrated that cellulase, pectinase and laccase played an important role in the pathogenic processes ofC.oleiferaanthracnose caused byC.gloeosporioides.

Camelliaoleifera;Colletotrichumgloeosporioides; cell wall-degrading enzyme

2016-06-26

2016-08-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B0803)

Q 939.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.016

* 通信作者 E-mail:zgyingqq@163.com