楊世安, 李戰(zhàn)彪, 秦碧霞, 謝慧婷,崔麗賢, 蘇 琴, 鄧鐵軍, 蔡健和*

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004; 2. 廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室,廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 南寧 530007)

廣西三種甜瓜病毒分離物的分子檢測與鑒定

楊世安1,2#, 李戰(zhàn)彪2#, 秦碧霞2, 謝慧婷2,崔麗賢2, 蘇 琴2, 鄧鐵軍2, 蔡健和2*

(1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004; 2. 廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室,廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 南寧 530007)

瓜類褪綠黃化病毒Cucurbitschloroticyellowsvirus(CCYV)、甜瓜黃化斑點病毒Melonyellowspotvirus(MYSV)及甜瓜壞死斑點病毒Melonnecroticspotvirus(MNSV)是近年來報道侵染瓜類作物的新病毒,在個別種植區(qū)大面積發(fā)生,對生產(chǎn)構(gòu)成嚴重威脅。為了解3種病毒在廣西的發(fā)生情況,先后到各西甜瓜種植區(qū)進行了調(diào)查,并采集疑似CCYV、MYSV及MNSV的甜瓜病葉樣品,提取病葉總RNA,通過特異性引物分別進行一步法RT-PCR擴增,電泳結(jié)果顯示RT-PCR產(chǎn)物與預(yù)期大小一致的序列條帶;將擴增產(chǎn)物分別連接到pMD19-T克隆載體上,挑選陽性克隆子進行序列測定及比對分析。結(jié)果表明:CCYV、MYSV和MNSV廣西分離物的CP基因序列與其他已報道核苷酸序列一致性分別達95.1%～100%、96.5%～99%和83.7%～92.5%。

廣西; 瓜類褪綠黃化病毒; 甜瓜黃化斑點病毒; 甜瓜壞死斑點病毒; 一步法RT-PCR

甜瓜CucumismeloL.是世界上重要的葫蘆科作物,起源于非洲、美洲和東南亞等熱帶地區(qū),在熱帶地區(qū)、溫帶地區(qū)的溫和氣候季節(jié)廣泛種植。在我國,甜瓜的種植幾乎遍布大江南北。廣西依其得天獨厚的氣候條件成為華南重要的甜瓜產(chǎn)區(qū)。甜瓜不僅種植面積廣而且品種繁多,有包括‘廣甜二號’、‘豐蜜三號’、‘金蜜寶’、‘翠蜜寶’、‘好運52’、‘廣蜜1號’、‘好運11’、‘北甜1號’、‘京玉5號’、‘桂蜜12號’等在內(nèi)的數(shù)十個品種[1-4]。近年來,各種病蟲害,如細菌性果斑病、根結(jié)線蟲病、蔓枯病和病毒病等,嚴重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì),其中病毒病的危害尤為嚴重。瓜類褪綠黃化病毒、甜瓜黃斑病毒和甜瓜壞死斑點病毒是甜瓜上新發(fā)生的病毒病害,對甜瓜生產(chǎn)具有潛在的威脅。

瓜類褪綠黃化病毒Cucurbitchloroticyellowsvirus(CCYV)屬于長線病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus。病毒顆粒為長線形,基因組由雙鏈RNA組成,即RNA1(8 607 nt)和RNA2(8 041 nt)。CCYV通過介體煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)進行半持久性傳播,主要危害西瓜、甜瓜、黃瓜等,以大面積侵染甜瓜最為常見。該病最早于2004年在日本觀察到,直至2010年其病原才被鑒定出來[5]。我國古勤生等[6-7]于2011年在寧波、上海等地觀察報道了CCYV。隨后海南、河南、北京和山東等地均報道了該病害[8-10]。

甜瓜黃化斑點病毒Melonyellowspotvirus(MYSV),屬于布尼亞病毒科Bunyaviridae番茄斑萎病毒屬Tospovirus。病毒粒體為具有包膜的球體,基因組包括3個單鏈線性RNA片段,即L RNA、M RNA和S RNA。MYSV在植株間主要是通過節(jié)瓜薊馬Thripspalmi(又稱棕櫚薊馬)以持久增殖方式自然傳播,也可通過汁液機械傳播。MYSV主要危害甜瓜、西瓜、黃瓜和苦瓜等葫蘆科作物,該病毒于2000年在日本首次發(fā)現(xiàn)并命名[11]。2008年發(fā)現(xiàn)我國臺灣的西瓜受到該病毒侵染[12],2009年海南省發(fā)現(xiàn)三亞市大棚甜瓜受到該病毒侵染[13-14]。隨后,在廣東的西瓜和山東壽光的黃瓜上也發(fā)現(xiàn)了該病毒[15-16]。

甜瓜壞死斑點病毒Melonnecroticspotvirus(MNSV)屬于番茄叢矮病毒科Tombusviridae香石竹斑駁病毒屬Carmovirus,病毒粒體為球形,基因組為正義單鏈RNA,約4.3 kb。甜瓜壞死斑點病毒主要通過種子、土壤真菌瓜油壺菌Olpidiumradicale和黃瓜黑頭葉甲Diabroticasp.進行自然傳播,另外還可以通過機械摩擦傳播。MNSV的寄主范圍限于葫蘆科植物西瓜、南瓜、葫蘆、黃瓜、甜瓜等,其中甜瓜為系統(tǒng)侵染寄主。甜瓜壞死斑點病毒由日本最先報道,隨后在美國、希臘、瑞典、意大利和突尼斯等國家出現(xiàn)[17]。我國于2007年在江蘇省海門市溫室甜瓜中發(fā)現(xiàn)該病毒[18],2015年山東壽光也報道了該病毒[10]。

CCYV、MYSV和MNSV自發(fā)現(xiàn)報道以來,其危害范圍不斷擴大。CCYV與MYSV在廣西雖有分布[6,14],但未進行分子檢測;MNSV在廣西的研究更是空白。快速有效地檢測、鑒定是病毒病防治的基礎(chǔ),本研究采用一步RT-PCR方法對具有典型CCYV、MYSV和MNSV癥狀的甜瓜病樣進行檢測,并對病毒的部分序列進行了測定與分析。研究結(jié)果對廣西地區(qū)甜瓜上病毒的快速檢測鑒定,綜合防治措施擬定以及基因結(jié)構(gòu)特征與變異、病害流行規(guī)律和抗病育種均具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

疑似CCYV、MYSV及MNSV病葉樣品采集于廣西甜瓜主產(chǎn)區(qū)南寧市和北海市,共采集37份樣品,樣品保存于-80℃待用。

1.1.2 試劑

植物總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pMD19-T連接載體和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞以及質(zhì)粒提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA提取

稱取甜瓜病葉、健葉各100 mg,參照植物RNA提取試劑盒說明書提取葉片組織總RNA。

1.2.2 引物合成

根據(jù)NCBI上已報道的病毒序列,經(jīng)過比對分析,選擇各病毒基因保守區(qū)分別設(shè)計CCYV、MYSV及MNSV特異性引物,引物由立菲生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.3 RT-PCR擴增

RT-PCR反應(yīng)體系:2.5 μL模板,2 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix,25 μL 2×1 step buffer,1 μL正/反向引物,18.5 μL RNase-free water,共50 μL。

RT-PCR一步法反應(yīng)條件:50℃ 30 min;94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,58/58/50℃退火30 s,延伸45 s(30個循環(huán));72℃延伸10 min,4℃保存。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1 用于檢測3種病毒的引物序列

1.2.4 RT-PCR產(chǎn)物回收及克隆測序

根據(jù)PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明,對PCR產(chǎn)物進行相應(yīng)目的片段的快速回收,并將其分別與pMD19-T克隆載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞中,經(jīng)PCR鑒定的陽性菌落進行接種培養(yǎng)和質(zhì)粒提取。測序由上海立菲生物科技有限公司完成。

1.2.5 序列分析

測序結(jié)果利用Vector NTI 11.5.1軟件進行序列的拼接和比對分析;利用MEGA 6.0軟件通過鄰近相鄰法(neighbour-joining)和最大似然組成模型法(maximum composite like-lihood method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用到的各病毒分離株信息(基因登錄號、名稱、寄主、其來源地及參考文獻)見表2。

表2 用于CCYV、MYSV和MNSV廣西分離物親緣關(guān)系分析的國內(nèi)外分離物

續(xù)表2 Table 2(Continued)

病毒名稱Virusname基因登錄號GenBankacc.no.分離株名稱Isolate寄主Host來源地Geographicorigin參考文獻ReferenceMNSVEU016217.1MNSV-HM甜瓜中國海門[18]AY122286.1Malfa5無西班牙[29]DQ339157.1MNSV-Al無西班牙[30]D12536.2Dutchisolate無荷蘭[31]KR094068.1ABCA1301黃瓜加拿大[32]AB044292.2NK無日本無AB007001.1NK無日本無D29663.1MNSV-S無日本[33]DQ922807.1MNSV-ISR無以色列無EU848551.1HN-1甜瓜洪都拉斯[34]KP406627.1Xinjiang哈密瓜中國新疆無FJ621530.1IT甜瓜意大利[34]AB189943.1Kouchi無日本[35]EU848553.1SP-11甜瓜西班牙[34]AB106106.1無甜瓜韓國無EF442681.1TN0614甜瓜突尼斯[36]DQ443546.1MNSV-PA1甜瓜巴拿馬[37]KT923150.1Agdiactrl無美國[38]

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測與鑒定

于廣西壯族自治區(qū)南寧市和北海市的甜瓜種植區(qū)采集有褪綠黃化、黃色斑點和褪綠壞死斑癥狀的甜瓜病葉,進行分子檢測。分別提取不同癥狀表現(xiàn)的甜瓜病葉樣品總RNA作為RT-PCR的模板,用3種病毒的特異性引物進行RT-PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,疑似感病樣品擴增產(chǎn)物的電泳條帶如圖1～3,大小與所設(shè)計引物的目標(biāo)片段大小(CCYV 877 bp、MYSV 840 bp和MNSV 651 bp)基本一致。由于缺少陽性對照,為了證實檢測結(jié)果的可靠性,我們將RT-PCR產(chǎn)物純化后進行直接測序,序列經(jīng)NCBI的Blastn比對,結(jié)果顯示,所擴增的產(chǎn)物序列與NCBI上CCYV、MYSV、MNSV的序列相似性分別達95%～100%、96～99%和85%～92%。經(jīng)RT-PCR方法對樣品進行檢測,CCYV、MYSV和MNSV檢出率分別為68.7%、72.7%和70%。

圖1 CCYV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of CCYV

圖2 MYSV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR amplification of MYSV

圖3 MNSV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 RT-PCR amplification of MNSV

2.2 CCYV、MYSV和MNSV廣西分離物序列分析

將3種病毒的RT-PCR純化產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體,挑選陽性克隆進行測序,經(jīng)Vector NTI 11.5.1拼接,CCYV、MYSV和MNSV廣西分離物的CP基因特異性引物的擴增產(chǎn)物序列分別由877、840和651 bp核苷酸組成。分別通過NCBI Blastn和GenBank序列對比,下載我國其他省份以及世界其他國家和地區(qū)已上傳的分離株序列進行分析。

通過Vector NTI 11.5.1的AlignX將所得的CCYV廣西分離物(CCYV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)分離物的核苷酸序列進行兩兩比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn):CCYV廣西分離物(CCYV-GX)與中國大陸分離物(JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、KP896506.1和KU507602.1)、中國臺灣分離物(JN126046.1、JF502222.1)等地區(qū)分離物的核苷酸相似性達99.6%～100%;與沙特阿拉伯分離物(KT946811.1)核苷酸相似性為98.0%;與伊朗分離物(KC577202.1)核苷酸相似性僅95.1%。利用MEGA 6.06軟件對CCYV廣西分離物(CCYV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)相應(yīng)分離物的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),結(jié)果表明:CCYV廣西分離物(CCYV-GX)與沙特阿拉伯分離物(KT946811.1)和伊朗分離物(KC577202.1)在不同分支上,親緣關(guān)系較遠;與其他13個分離物,其中包括6個中國大陸分離物(JQ904629.1、HM581658.1、KJ735450.1、KJ149806.1、K和KP896506.1)和2個中國臺灣分離物(JN126046.1、JF502222.1)在同一支上,親緣關(guān)系最近。

圖4 CCYV廣西分離物的核苷酸序列親緣關(guān)系分析Fig.4 Phylogenetic relationship analysis between nucleotide sequences of Guangxi isolate and other 15 CCYV isolates reported previously

通過Vector NTI 11.5.1的AlignX將所得的MYSV廣西分離物(MYSV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)分離物核苷酸序列進行兩兩比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):中國廣西分離物(MYSV-GX)與中國三亞分離物(GQ397254.2)、中國上海分離物(KP247476.1)、中國廣州分離物(HQ711861.1)核苷酸相似性達99.6%以上;與日本分離物(AB038343.1、AB024332.1)、泰國分離物(AF067151.1)、厄瓜多爾分離物(KJ196383.1)、中國臺灣分離物(FJ386391.1)、印度分離物(HM590470.1)等14個分離物核苷酸相似性達96.5%～98.6%。利用MEGA 6.06軟件對MYSV廣西分離物(MYSV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)相應(yīng)分離物的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),結(jié)果表明:MYSV廣西分離物(MYSV-GX)與中國三亞、上海、廣州(GQ397254.2、KP247476.1、HQ711861.1)以及泰國分離物(AF067151.1)和厄瓜多爾分離物(KJ196383.1)在一個分支上,親緣關(guān)系最近;與泰國分離物(AY673636.1、AY673635.1、FR714507.1、AM087021.1)、日本分離物(AB038343.1、AB024332.1)和中國臺灣分離物(FJ386391.1)親緣關(guān)系較近;與日本分離物(AB076250.1、AB453910.1和AB453911.1)、印度分離物(HM590470.1)、泰國分離物(AM087020.1)處于不同分支,親緣關(guān)系較遠。

圖5 MYSV廣西分離物的核苷酸序列親緣關(guān)系分析Fig.5 Phylogenetic relationship analysis between nucleotide sequences of Guangxi isolate and other 17 MYSV isolates reported previously

通過Vector NTI 11.5.1的AlignX將所得的MNSV廣西分離物(MNSV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)分離物核苷酸序列進行兩兩比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):中國廣西分離物(MNSV-GX)與中國海門分離物(GU480022.1)、中國新疆分離物(KP406627.1)等分離物的核苷酸序列相似性達91.4%～92.5%;與洪都拉斯分離物(EU848551.1)、美國分離物(KT923150.1)等分離物的核苷酸序列相似性達89.1%～90.8%;與日本分離物(D29663.1)和西班牙分離物(AY122286.1)核苷酸序列相似性僅為84.6%和83.7%。利用MEGA 6.06軟件對MNSV廣西分離物(MNSV-GX)與我國及其他國家或地區(qū)相應(yīng)分離物的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6),結(jié)果表明:MNSV廣西分離物(MNSV-GX)處于一個小支上,但與中國新疆分離物(KP406627.1)、中國海門分離物(EU016217.1)、洪都拉斯分離物(EU848551.1)、巴拿馬分離物(DQ443546.1)等處于一個大分支上,親緣關(guān)系最近;其次是日本分離物(AB007001.1、AB044292.2、AB189943.1)及韓國分離物(AB106106.1);與日本分離物(D29663.1)和西班牙分離物(AY122286.1)親緣關(guān)系相對較遠。

圖6 MNSV廣西分離物的核苷酸序列親緣關(guān)系分析Fig.6 Phylogenetic relationship analysis between nucleotide sequences of Guangxi isolate and other 18 MNSV isolates reported previously

3 討論與結(jié)論

瓜類褪綠黃化病毒、甜瓜黃斑病毒以及甜瓜壞死斑點病毒是近年來新發(fā)現(xiàn)的病毒,盡管沒有在各省區(qū)大范圍發(fā)生,但局部發(fā)生情況比較嚴重。據(jù)報道,2009年海南三亞保護地甜瓜上甜瓜黃斑病毒的發(fā)病率為30%～100%,給甜瓜生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[14]。據(jù)本課題組2014—2015年調(diào)查發(fā)現(xiàn),這3種病毒在廣西南寧市和北海市的甜瓜種植區(qū)有不同程度的發(fā)生,其中CCYV在北海、南寧的發(fā)病率在20%～70%。隨著甜瓜栽培規(guī)模和范圍的不斷擴大,煙粉虱和薊馬等傳播媒介種群暴發(fā),這3種病毒病的發(fā)生范圍將越來越廣泛,危害程度日趨嚴重,及時有效的診斷方法對病害防治尤其重要。

本研究從疑似病毒病的樣品中挑選不同癥狀的樣本分別進行3種病毒檢測,把檢測結(jié)果對應(yīng)其癥狀,瓜類褪綠黃化病毒(CCYV)引起的是褪綠黃化癥狀,但類似癥狀存在未檢出現(xiàn)象,可能是缺素引起抑或是其他病毒比如瓜類黃矮失調(diào)病毒(CYSDV)[39]引起,有待于進一步研究;甜瓜黃斑病毒(MYSV)引起黃色不規(guī)則斑點癥狀,后期黃斑中間會形成枯死斑,與古勤生[13]等報道的癥狀表現(xiàn)基本一致;甜瓜壞死斑點病毒(MNSV)引起不規(guī)則白色壞死斑沿葉脈分布,葉片還有褪綠癥狀,與喬寧等[10]描述癥狀“葉片上產(chǎn)生許多‘米黃點’”相異,可能由于寄主和發(fā)病時期不同或其他因素所致。病毒在不同寄主以及寄主不同生長期所表現(xiàn)的癥狀有差別,同時,各個地域的氣候條件和病原群落的構(gòu)成差異也會影響病毒在寄主上的表征,所以在把握癥狀的同時需建立快速有效的檢測技術(shù),為有效的甜瓜病毒病防治打下基礎(chǔ)。CCYV和MYSV分別通過煙粉虱和棕櫚薊馬傳播,加強栽培管理,治蟲防病是防治病毒病的關(guān)鍵;MNSV不僅能通過土壤真菌瓜油壺菌Olpidiumradicale和黃瓜葉甲Diabroticasp.進行自然傳播,而且能經(jīng)種子及水體傳播,防治更加困難。了解病害癥狀和明確病原、傳播方式及寄主范圍(特別是中間寄主)是防治甜瓜病毒病的關(guān)鍵,快速有效的檢測鑒定方法是病毒病防治的基礎(chǔ)。劉珊珊等[9]采用兩步法RT-PCR對海南省和河南省瓜類褪綠黃化病病原進行分子鑒定,喬寧等[10,16]也運用兩步法RT-PCR對山東壽光CCYV、MYSV和MNSV病毒分離物進行分子鑒定,劉勇等[15]運用一步法RT-PCR在廣東西瓜上檢測到MYSV。此外施艷等[40-41]還針對CCYV外殼蛋白基因和P22基因制備檢測病毒的抗血清,曾蓉等[42]也針對CCYV上海分離物外殼蛋白制備檢測病毒的抗血清。梁相志等[43]利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測介體煙粉虱體內(nèi)的瓜類褪綠黃化病毒。本研究采用一步RT-PCR方法對為害甜瓜的3種病毒進行檢測鑒定,進一步提高了病毒病的檢測效率。

通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,CCYV、MYSV和MNSV廣西分離物核酸序列與已報道序列相似性達90%以上,屬于同種病毒。CCYV廣西分離物與伊朗分離物核苷酸相似性只有95.1%,與其他分離物序列相似性均達99%以上,系統(tǒng)發(fā)育樹分析與喬寧等[10]的報道基本一致,說明CCYV來源基本相同,變異發(fā)生率較低。MYSV廣西分離物與中國其他分離物核苷酸一致性高達99.5%以上,廣西分離物與中國三亞、廣州、上海分離物處于同一分支、與喬寧等[16]構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹各分離物分布基本一致，說明中國分離物來源基本相同。MNSV廣西分離物與其他分離物核苷酸序列一致性僅為83.7%～92.5%,差異稍大,系統(tǒng)發(fā)育樹分析MNSV廣西分離物單獨處于一個分支上,與中國海門分離物、中國新疆分離物等處于一個大分支,親緣關(guān)系最近;其次與日本分離物及韓國分離物親緣關(guān)系較近,親緣關(guān)系較遠的是日本分離物(D29663.1)和西班牙分離物(AY122286.1),推測MNSV廣西分離物可能與日本韓國分離物來源相同。溫少華[44]對MNSV中國海門分離物(GU480022.1)的全基因組進行克隆測序與結(jié)構(gòu)分析,MNSV在廣西為首次報道,與其他分離物存在一定差異,有必要對MNSV廣西分離物的全基因組進行序列結(jié)構(gòu)分析,以便了解各個分離物分子結(jié)構(gòu)特征及基因變異情況。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Molecular detection and identification of three viruses isolatedfrom melons in Guangxi

Yang Shi’an1,2, Li Zhanbiao2, Qin Bixia2, Xie Huiting2,Cui Lixian2, Su Qin2, Deng Tiejun2, Cai Jianhe2

(1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Guangxi KeyLaboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests, Plant Protection ResearchInstitute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)

Cucurbitchloroticyellowsvirus(CCYV),Melonyellowspotvirus(MYSV) andMelonnecroticspotvirus(MNSV), which were emerging threat to melon plantation, have recently been found infecting melons in some large melon-growing areas. In order to understand the incidences of these three viruses, a survey was conducted on these viruses on melons, and leaves infected by CCYV, MYSV and MNSV were collected from Nanning and Beihai, Guangxi. Total RNAs were extracted from these diseased samples and RT-PCR was performed by using specific primers. The PCR products were purified and inserted into pMD19-T cloning vector, and the expected DNA fragment were sequenced and analyzed by BLASTn in GenBank. The results showed that nucleocapsid protein gene sequences of CCYV, MYSV and MNSV isolates from Guangxi had 95.1%-100%, 96.5%-99% and 83.7%-92.5% identities with those of the isolates from other parts of China or some countries reported previously.

Guangxi;Cucurbitchloroticyellowsvirus(CCYV);Melonyellowspotvirus(MYSV);Melonnecroticspotvirus(MNSV); one-step RT-PCR

2016-07-07

2016-11-08

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西特色水果創(chuàng)新團隊項目(nycytxgxcxtd-04-19-2);廣西自然科學(xué)基金(2015GXNSFBA139075);廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金(2015JZ48);河南鄭州果樹瓜類重點實驗室開放基金(HNS-201508-10)

S 436.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.014

* 通信作者 E-mail:caijianhe@gxaas.net

#共同第一作者