張 潔, 張鼎宇, 丁永強(qiáng), 陳德鑫, 王 靜,馮 超, 王鳳龍, 焦芳嬋, 曾慶賓, 王文靜*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266101; 2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 昆明 650021; 3. 四川省煙草公司攀枝花市公司, 攀枝花 617026)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在煙草受CMV侵染和激素處理中的表達(dá)模式初步分析

張 潔1, 張鼎宇1, 丁永強(qiáng)1, 陳德鑫1, 王 靜1,馮 超1, 王鳳龍1, 焦芳嬋2, 曾慶賓3, 王文靜1*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266101; 2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 昆明 650021; 3. 四川省煙草公司攀枝花市公司, 攀枝花 617026)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抵抗病原菌的侵染中發(fā)揮重要作用,但是,目前為止還沒有WRKY轉(zhuǎn)錄因子在煙草抗CMV中調(diào)控機(jī)理的研究。本研究檢測了感病品種‘K326’和抗病品種‘TT8’在接種CMV后其WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,CMV侵染后‘TT8’中4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量均有大幅上升;而‘K326’中WRKY2、WRKY4和WRKY11的表達(dá)量與CMV侵染前無顯著差異,WRKY1表達(dá)量則大幅下降。幼苗經(jīng)外源激素(水楊酸、茉莉素、乙烯)處理后用RT-PCR檢測,結(jié)果表明,‘K326’和‘TT8’中WRKY轉(zhuǎn)錄因子對外源激素的誘導(dǎo)響應(yīng)比較復(fù)雜多樣,但總體表現(xiàn)為在‘TT8’中WRKY1、WRKY2和WRKY4會受到乙烯和茉莉酸的誘導(dǎo),但在‘K326’中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)未受明顯誘導(dǎo)。

煙草; 黃瓜花葉病毒(CMV); WRKY轉(zhuǎn)錄因子; 水楊酸; 茉莉酸; 乙烯

黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)是寄主范圍最多、分布最廣、最具經(jīng)濟(jì)重要性的植物病毒之一[1-2],給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。該病毒引起的病害是煙草生產(chǎn)中危害最大的病毒病之一,不僅使煙草葉片畸形、黃化、花葉,而且使煙草植株矮化,極大地影響了煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,研究煙草抗CMV相關(guān)基因,揭示其抗病毒機(jī)理,對煙草和其他重要作物的CMV防治都有重要意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[3-4],尤其在植物抗病調(diào)控中的作用機(jī)理研究是近幾年植物學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通常含有1～2個 WRKY結(jié)構(gòu)域,包括WRKYGQK序列和一個類鋅指結(jié)構(gòu)域,其調(diào)控通過結(jié)合含有W-box順式作用元件的防御基因來實(shí)現(xiàn)[5-6]。在很多植物中,WRKY基因的表達(dá)可以被生物和非生物脅迫強(qiáng)烈并快速誘導(dǎo)。擬南芥中有74個WRKY成員,其中的49個WRKY轉(zhuǎn)錄因子都可以被病原菌或者激素誘導(dǎo),這些過程與激素信號的傳導(dǎo)有著密不可分的關(guān)系[4]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與的激素信號途徑主要有茉莉酸(jasmonate,JA)、水楊酸(salicylic acid,SA)、乙烯(ethylene,ET)三種通路[7]。雖然WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中的機(jī)理研究有很多報(bào)道,但還沒有關(guān)于WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?zé)煵輰MV抗性機(jī)理的研究報(bào)道。

‘臺煙8號’(‘TT8’)是臺灣煙草育種家使用煙草花葉病(TMV)抗性材料‘Holmes抗性系’做親本育成的CMV抗性品種[8]。‘K326’是一個耐肥性、香氣品質(zhì)和加工品質(zhì)較好的烤煙品種,但抗病性較差,在田間易于感染CMV發(fā)生花葉病,影響品質(zhì)和產(chǎn)量形成[9]。對‘K326’進(jìn)行抗病性改良是提高其產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵手段。

本研究采用CMV接種煙草感病品種‘K326’和抗病品種‘TT8’,并檢測接種后WRKY家族中的轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11在這兩個品種中的表達(dá)情況。另外,利用水楊酸、茉莉酸、乙烯對‘K326’和‘TT8’幼苗進(jìn)行處理,分析上述4個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。這些研究結(jié)果可為解析WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?zé)煵菘笴MV的分子機(jī)制提供參考,同時對揭示煙草不同抗性品種抗性差異的分子基礎(chǔ)有重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草感病品種‘K326’(Nicotianatabacum‘K326’),煙草抗病品種‘臺煙8號’(N.tabacum‘TT8’,Taiwan tobacco No. 8)。

1.2 CMV的接種

在‘K326’和‘TT8’的6周齡期接種CMV,每個品種接種5株,3次重復(fù):(1)將1 g感染CMV病毒的發(fā)病煙草葉片放在研缽中加入20 mL PBS緩沖液和細(xì)顆粒石英砂研磨至溶液變?yōu)閼覞嵋?(2)用紗布蘸取病毒懸濁液(蘸上少許石英砂)在植株葉片上輕輕摩擦,至劃出輕微傷口;(3)在植株上蓋上保鮮膜,放在光周期為L∥D=14 h∥10 h的試驗(yàn)溫室,于25℃條件下培養(yǎng);(4)待煙草植株發(fā)病后(接種后3周),分別取‘K326’和‘TT8’的病葉以液氮速凍后立即貯存于-80℃超低溫冰箱備用。取接種前‘K326’和‘TT8’的完好葉片(0 d)作為對照。

1.3 抗感材料植株的激素處理

將煙草‘K326’和‘TT8’的種子在培養(yǎng)基中萌發(fā),在長出真葉后分別轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中培養(yǎng),每個品種選取長勢相近的5株煙草作為試驗(yàn)對象。待長出6片葉后,在相同葉位的葉片分別噴施1 mmol/L的水楊酸、50 μmol/L的茉莉酸和50 μmol/L的乙烯。每種處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)設(shè)5個單株。取樣時間為處理后0、6、24 h。所取樣品以液氮速凍后立即貯存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.4 cDNA的合成

采用Invitrogen 公司的Trizol試劑提取所有上述煙草樣品總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量,并使用寶生物工程有限公司的PrimeScript RT Master Mix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。取5 μg 葉片總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物oligo(dT)20于65℃變性退火后,加入反轉(zhuǎn)錄試劑,置于PCR擴(kuò)增儀內(nèi)于42℃反轉(zhuǎn)錄1.5 h,隨后85℃滅活5 min。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋到100 μL,采用Promega生物技術(shù)有限公司的試劑盒,對實(shí)時熒光定量PCR引物與探針的濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,確立最佳反應(yīng)體系。 25 μL反應(yīng)體系包括:Master mix 12.5 μL;cDNA 0.5 μL;H2O 11 μL;上游引物 0.5 μL,下游引物0.5 μL。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性2 min,50個擴(kuò)增循環(huán)(94℃,20 s;58℃,20 s;72℃,30 s),PCR結(jié)束后測定熔解曲線。研究樣品的熒光定量PCR擴(kuò)增在iQ5 型熒光定量PCR儀(BIO-RAD, USA)上完成,以煙草Actin基因作為內(nèi)參。以最小樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)為標(biāo)準(zhǔn)獲得所有擴(kuò)增樣本的Ct值,以各基因在對照處理‘K326’中的相對表達(dá)量為參照,用公式2-ΔΔCt方法計(jì)算出各基因在每種處理?xiàng)l件下的相對表達(dá)量。 最后,利用各基因在每種處理的3個重復(fù)試驗(yàn)樣本中的相對表達(dá)量為基礎(chǔ),通過Excel軟件計(jì)算其相對表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

本研究所用的WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11等4個基因的特異性引物如表1。

表1 試驗(yàn)所用特異性引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11在感染CMV的‘K326’和‘TT8’中的表達(dá)情況

本研究以煙草感病品種‘K326’和抗病品種‘TT8’作為研究對象,在接種CMV后,通過定量PCR分析了WRKY類轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的品種間表達(dá)差異。結(jié)果表明,‘TT8’中4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量在CMV侵染后都有不同程度的上升,其中WRKY2、WRKY4和WRKY11的相對表達(dá)量超過對照的6倍,而WRKY1的相對表達(dá)量約為對照的2.5倍。在‘K326’中情況則相反:WRKY2、WRKY4和WRKY11在CMV侵染前后表達(dá)量無顯著差異,WRKY1在CMV侵染后表達(dá)量大幅下降(圖1)。該結(jié)果說明在‘TT8’中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到CMV的誘導(dǎo),相比之下,‘K326’的抗性與WRKY2、WRKY4和WRKY11的表達(dá)量關(guān)系較弱。

圖1 CMV侵染后‘K326’和‘TT8’中WRKY基因的表達(dá)變化Fig.1 Expression levels of WRKY genes in ‘K326’ and ‘TT8’ infected by CMV

2.2 經(jīng)SA、JA和ET處理后‘K326’和‘TT8’中轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的表達(dá)情況

植物激素SA、JA和ET在調(diào)控植物抗病過程中發(fā)揮著重要作用,本研究分析了經(jīng)這3種激素處理后‘K326’和‘TT8’中WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)差異。

SA處理感病品種‘K326’后,對4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)有強(qiáng)烈的抑制作用。而在抗病品種‘TT8’中,情況則比較多變:WYKY1和WYKY11表達(dá)量受到強(qiáng)烈抑制,WYKY2的表達(dá)量變化不大,但是WRKY4受到SA的強(qiáng)烈誘導(dǎo),表達(dá)量在接種24 h后大幅升高,超過對照的3倍(圖2)。

在JA處理后,WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量在兩個品種中表現(xiàn)較一致,均有不同程度的增加。其中,WRKY2和WRKY11在處理后6 h時最高;WRKY4表達(dá)量在‘TT8’中達(dá)到峰值時間點(diǎn)為處理后6 h,‘K326’中為24 h;4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子在‘TT8’中的表達(dá)量均高于‘K326’。這些結(jié)果表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)JA途徑,受JA正調(diào)控,且在抗病品種‘TT8’中響應(yīng)更加強(qiáng)烈(圖3)。

圖2 SA處理后 ‘K326’和‘TT8’ 中WRKY基因的表達(dá)變化Fig.2 Expression levels of WRKY genes in ‘K326’ and ‘TT8’ treated by SA

圖3 JA處理后 ‘K326’和‘TT8’中WRKY基因的表達(dá)變化Fig.3 Expression levels of WRKY genes in ‘K326’ and ‘TT8’ treated by JA

在ET處理后,‘TT8’中的WRKY1、WRKY2、WRKY4表達(dá)量均有所增加,并在處理后6 h時到達(dá)峰值?！甂326’中WRKY1表達(dá)量無明顯差異,WRKY2有輕微增加,WRKY4在處理后6 h時顯著下降,24 h時回升,并且這些轉(zhuǎn)錄因子在‘K326’中表達(dá)量整體低于‘TT8’中。此外,WRKY11的表達(dá)水平在ET處理后的兩種材料中都明顯下降,在‘TT8’中下降幅度更大,僅為對照的10%左右(圖4)。

圖4 ET處理后 ‘K326’和‘TT8’ 中WRKY基因的表達(dá)變化Fig.4 Expression levels of WRKY genes in ‘K326’ and ‘TT8’ treated by ET

3 討論

植物對病害的抗性很大程度依賴于抗病基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄家族之一,在植物抵御病原體的侵染中發(fā)揮重要作用[10]。本研究對CMV侵染煙草感病品種‘K326’和抗病品種‘TT8’后WRKY家族4個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況進(jìn)行了初步分析,以期為揭示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?zé)煵軨MV抗性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。分析結(jié)果顯示,CMV侵染后‘TT8’中4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量均有大幅上升;而在‘K326’中情況則完全不同,CMV侵染‘K326’后,WRKY2、WRKY4和WRKY11的表達(dá)量與侵染前無明顯差異,而WRKY1在CMV侵染后表達(dá)量大幅下降。該研究結(jié)果與煙草品種的感病性和抗病性一致,即受CMV侵染后,抗性品種‘TT8’中WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增加,使煙草表現(xiàn)抗病性;而感病品種‘K326’中WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量下降,使煙草表現(xiàn)感病性。該研究結(jié)果表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在煙草中可能參與抵抗CMV侵染,推測該轉(zhuǎn)錄因子是導(dǎo)致煙草感病品種‘K326’和抗病品種‘TT8’抗性差異的原因之一。

以往研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物對病害的抗性中既可作為正調(diào)控因子,又可作為負(fù)調(diào)控因子[11-13]。另外,在擬南芥WRKY70的誘導(dǎo)表達(dá)特性研究中發(fā)現(xiàn),AtWRKY70可以被SA誘導(dǎo)表達(dá),但同時又受到JA的抑制[14]。在煙草中,WRKY4也被SA明顯誘導(dǎo),并且在受TMV侵染后,WRKY4的RI(轉(zhuǎn)基因沉默)植株相對于空載體對照植株葉片表現(xiàn)出更明顯的發(fā)病癥狀[15]。但是,有研究表明WRKY4在擬南芥中對丁香假單胞菌Pseudomonassyringae的抗性卻呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)[16-17]。有研究結(jié)果表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物的抗病過程中,它們的誘導(dǎo)表達(dá)非常復(fù)雜,參與多種信號途徑的傳導(dǎo),受到不同激素的誘導(dǎo)表達(dá)[18]。本研究檢測了WRKY家族的4個轉(zhuǎn)錄因子在經(jīng)JA、ET和SA處理后的‘K326’和‘TT8’中表達(dá)水平的變化。在CMV敏感品種‘K326’中,除WRKY11受JA誘導(dǎo)外,這4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)對激素處理并不敏感。而在CMV抗性品種‘TT8’中,這4個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因均被JA誘導(dǎo),同時,ET可誘導(dǎo)WRKY1、WRKY2和WRKY4表達(dá),但抑制WRKY11表達(dá);SA處理誘導(dǎo)WRKY4表達(dá)量急劇上升,但引起WRKY1和WRKY11表達(dá)量的下降。

植物的病毒抗性應(yīng)答與JA、ET和SA等多種激素調(diào)控相關(guān),其中,SA和ET是病毒抗性應(yīng)答最重要的調(diào)控激素[19-20]。在‘TT8’煙草中,受ET和SA誘導(dǎo)表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因可能是其CMV抗性形成的重要調(diào)控因子,特別是被兩者共同誘導(dǎo)表達(dá)的WRKY4基因。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),‘TT8’煙草的WRKY11基因受到ET和SA的共同抑制,可能是CMV抗性形成的一個重要負(fù)調(diào)控因子。這些研究結(jié)果揭示了煙草WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因應(yīng)答激素處理時在不同CMV抗性品種間的變化復(fù)雜性,同時,為解析WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物激素信號途徑調(diào)控病害抗性的分子機(jī)理提供了重要線索,對揭示煙草的CMV抗性形成機(jī)理有重要意義。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Expression patterns of WRKY transcription factor genes in tobacco plantsupon CMV infection and phytohormone treatment

Zhang Jie1, Zhang Dingyu1, Ding Yongqiang1, Chen Dexin1, Wang Jing1, Feng Chao1,Wang Fenglong1, Jiao Fangchan2, Zeng Qingbin3, Wang Wenjing1

(1. Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring, Controlling & Integrated Management, TobaccoResearch Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, China; 3. PanzhihuaBranch, Sichuan Tobacco Company, Panzhihua 617026, China)

WRKY transcription factors play an important role in the regulation of plant resistance to pathogens. However, there is no report on the mechanism of WRKY transcription factors regulating the resistance of tobacco CMV (Cucumbermosaicvirus). In the present study, the expression patterns of WRKY transcription factor genesWRKY11,WRKY2,WRKY4 andWRKY1 were analyzed between tobacco varieties ‘K326’ (a CMV susceptible variety) and TT8 (a CMV resistant variety). The results showed that the expression levels of WRKY genes were significantly increased in ‘TT8’ after CMV infection, while their expression in ‘K326’ was tremendously different. The expression ofWRKY2,WRKY4 andWRKY11 were not induced and that ofWRKY1 was strikingly decreased in ‘K326’. The transcription patterns of these WRKY transcription factor genes were consistent with the CVM resistance of ‘TT8’ and ‘K326’, as ‘TT8’ and ‘K326’ are resistant and susceptible to CMV, respectively. Exogenous application of phytohormone salicylic acid, jasmonate and ethylene resulted in a complicated transcription pattern of WRKY transcription factor genes in tobacco varieties ‘K326’ and ‘TT8’. Meanwhile, the observations suggested that the overall expression levels ofWRKY1,WRKY2 andWRKY4 in ‘TT8’ were induced by phytohormone salicylic acid, jasmonate and ethylene in ‘TT8’, but no obvious induction was observed in ‘K326’. The results of this study are valuable for revealing the roles of WRKY transcription factors in regulating tobacco resistance to CMV, and are helpful for investigating the molecular basis of CVM resistance between the tobacco varieties ‘K326’ and ‘TT8’.

tobacco; CMV; WRKY transcription factor; salicylic acid; jasmonate; ethylene

2016-06-30

2016-09-07

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-TRIC04);云南省煙草公司科技項(xiàng)目(2015YN01);中國煙草總公司四川省公司項(xiàng)目(SCYC201604)

S 435.72

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.009

* 通信作者 E-mail:wangwenjing@caas.cn