唐培安, 陶冶心, 薛 昊, 袁明龍

(1. 南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210023; 2. 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 蘭州 730020)

研究報告
ResearchReports

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的印度谷螟微衛(wèi)星位點分析

唐培安1, 陶冶心1, 薛 昊1, 袁明龍2

(1. 南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210023; 2. 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 蘭州 730020)

基于印度谷螟轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選其功能微衛(wèi)星(EST-SSR)分子標(biāo)記,設(shè)計該蟲的微衛(wèi)星(SSR)引物并驗證其適用性。用MicroSAtellite微衛(wèi)星搜索軟件查找印度谷螟轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星的數(shù)量、重復(fù)次數(shù)以及所有微衛(wèi)星的位置信息,采用Primer Premier 5軟件設(shè)計SSR引物,并進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果表明含EST-SSR的序列3 173個,占總搜索序列的8.52%,平均每13 kb中就出現(xiàn)1個EST-SSR。共發(fā)現(xiàn)192種微衛(wèi)星類型,其中重復(fù)單元為單堿基、二堿基和三堿基的比例較高,依次是28.21%、39.84%、25.43%。除單堿基重復(fù)單元外,出現(xiàn)頻率最高的是AT/AT,有593次。在66對印度谷螟EST-SSR引物中,有28對PCR擴(kuò)增成功。這說明基于印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記是可行的,本研究獲得的印度谷螟EST-SSR位點為今后開展該蟲的種群遺傳學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組; 高通量測序; 螟蛾科; 微衛(wèi)星; 分子標(biāo)記

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱SSR(simple sequence repeat, 簡單重復(fù)序列),是指以1～6個核苷酸為重復(fù)單元串聯(lián)組成的重復(fù)序列[1],1981年,微衛(wèi)星首次被發(fā)現(xiàn),它們大都以2～3個堿基重復(fù)類型為主,主要分布于原核生物和真核生物的基因組中[2-3]。微衛(wèi)星具有高多態(tài)性、多等位性、共顯性、高可重復(fù)性、數(shù)量豐富和對基因組有很好覆蓋性等特征[4-5]。因此,該標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳研究中[6]。

印度谷螟Plodiainterpunctella屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae,是世界性分布的重大儲糧害蟲。該蟲在我國南北方廣泛分布[7],依據(jù)2004-2005年第6次全國儲糧昆蟲調(diào)查,印度谷螟被列為危害嚴(yán)重且分布廣泛的主要鱗翅目儲糧害蟲之一[8]。目前,關(guān)于印度谷螟SSR的研究還未見報道,在GenBank中也沒有發(fā)現(xiàn)登錄的印度谷螟SSR序列,不能滿足其種群遺傳結(jié)構(gòu)研究的需要。因此,開發(fā)印度谷螟的微衛(wèi)星位點,是有效開展其種群遺傳結(jié)構(gòu)和基因交流、系統(tǒng)發(fā)育與分子進(jìn)化等方面研究的重要前提和首要工作,同時對于揭示其危害規(guī)律和綜合防治等都具有重要意義。傳統(tǒng)開發(fā)SSR標(biāo)記的方法需要構(gòu)建文庫、篩選SSR克隆、測序等復(fù)雜且工作量大的步驟[9-11]。隨著新一代高通量測序技術(shù)的成長,尤其是轉(zhuǎn)錄組測序的飛速發(fā)展,降低了微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)成本,提高了開發(fā)效率,為非模式物種SSR位點的大批量開發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效的途徑[12-13]。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的與功能基因相關(guān)SSR位點又叫表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(expressed sequence tag SSR,EST-SSR)。目前,從昆蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選功能EST-SSR標(biāo)記已有許多成功的報道[14-17]。本研究基于已測印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),挖掘其EST-SSR位點,分析這些微衛(wèi)星位點的類型和分布特點,探討鑒定到的EST-SSR位點的適用性,以期獲得可供該蟲種群遺傳學(xué)研究所需的核分子標(biāo)記,也為印度谷螟近緣物種微衛(wèi)星位點的發(fā)掘提供可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

印度谷螟采自江蘇吳江,以大米粉為飼料,在溫度為(30±1)℃、濕度為75%±5%、24 h無光照條件的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10代以上,選取4齡幼蟲作為試驗材料。采用德國Qiagen公司的RNeasy Plus Universal Mini Kit試劑盒提取RNA,由華大科技進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序(轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的NCBI登錄號:SRP060836)。通過Illumina Hiseq2000平臺測序,總計產(chǎn)出5.7 GB數(shù)據(jù),共組裝Unigene 37 246個,總長49 682 542 bp,平均長度1 334 bp,N50達(dá)到2 307 bp,過濾后質(zhì)量不低于20的堿基比例(Q20,測序錯誤率<1%)為98.31%,表明測序結(jié)果良好。

1.2 微衛(wèi)星序列篩選

以組裝出來的Unigene作為參考序列,使用Perl操作平臺下的SSR分析軟件MicroSAtellite (MISA) (http:∥pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)在Unigene中搜索SSR位點。篩選條件為:單堿基重復(fù)次數(shù)≥12,二堿基重復(fù)次數(shù)≥6,三堿基重復(fù)次數(shù)≥5,四、五、六堿基重復(fù)次數(shù)≥4,并且兩個相鄰微衛(wèi)星重復(fù)單元之間的最小長度設(shè)為100 bp。

1.3 印度谷螟SSR引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增

基于SSR重復(fù)單元兩翼序列設(shè)計引物,采用Primer 5.0對印度谷螟EST-SSR設(shè)計了66對引物。引物篩選條件如下:①引物不含有重復(fù)序列;②將獲得的引物比對到Unigene序列,引物5′端允許有3個堿基的錯配,而3′端允許有1個堿基的錯配;③去除比對到非目標(biāo)Unigene的引物,保證引物與Unigene唯一匹配。④使用ssr_finder校驗SSR,使用產(chǎn)物序列來尋找SSR,檢驗結(jié)果是否與MISA結(jié)果相同,并篩選出相同的SSR產(chǎn)物。設(shè)計好的引物由金斯瑞生物技術(shù)公司(江蘇南京)合成。

采用TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根)試劑盒提取單頭印度谷螟4齡幼蟲的基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系:基因組DNA 1 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,滅菌水7.5 μL,ExTaqMix 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min,再進(jìn)行30個循環(huán),每個循環(huán)包括94℃變性30 s,Tm復(fù)性30 s, 72 ℃延伸1 min;最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

從構(gòu)建的印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中,獲得EST-SSR序列3 173個,占總搜索基因的8.52%,平均每13 380 bp中就出現(xiàn)1個SSR位點。

2.1 微衛(wèi)星數(shù)量及分布特征

單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)的EST-SSR數(shù)分別為895、1 264、807、100、28、79,依次占總SSR個數(shù)的28.21%、39.84%、25.43%、3.15%、0.88%、2.49%(表1)?？梢?在印度谷螟基因數(shù)據(jù)庫中二堿基重復(fù)序列占據(jù)優(yōu)勢,其次是單堿基和三堿基重復(fù)序列。此外,復(fù)合型SSR有72個,占SSR總數(shù)的2.27%。在單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基SSR中出現(xiàn)頻率最多的分別是A/T、AT/AT、CCG/CGG、AAAT/ATTT、ACG-CGC/GCGCGT(圖1),在各自重復(fù)單元類型中所占比例依次為98.55%、46.91%、36.31%、33.00%、17.86%、12.66%。在五堿基和六堿基中各類重復(fù)基元分布較為平均,這是由于此類重復(fù)較少的原因。

單堿基重復(fù)次數(shù)集中在12～15次,二堿基重復(fù)次數(shù)集中在6～8次,三堿基重復(fù)次數(shù)集中在5～8次,四堿基重復(fù)次數(shù)集中于5～6次,五堿基和六堿基則以重復(fù)4次為主。且隨著堿基重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)增加,其數(shù)量均呈下降趨勢。

表1 印度谷螟轉(zhuǎn)錄組中不同微衛(wèi)星類型分布

圖1 印度谷螟轉(zhuǎn)錄組不同堿基類型微衛(wèi)星位點分布Fig.1 Distribution of the microsatellites with different repeat motifs in the Plodia interpunctella transcriptome

2.2 微衛(wèi)星長度分布特征

印度谷螟轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的3 173個EST-SSR長度從12～192個堿基不等,平均長度為16.24個堿基。序列長度12～15個堿基的有2 175個,占總SSR個數(shù)的68.5%,其中單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)單元所占比例分別為35.54%、39.72%、24.74%,分布較為平均。序列長度16～20個堿基有560個,所占比例為17.6%,其中二堿基重復(fù)單元比例最高(48.04%),其次是三堿基重復(fù)單元(27.50%)。序列長度21～25個堿基的有297個,占總EST-SSR的9.3%,其中三堿基重復(fù)單元占29.97%,其次是二堿基重復(fù)單元(27.27%),再次是六堿基重復(fù)單元(24.58%),其他重復(fù)單元數(shù)量較少。序列長度大于25的數(shù)量較少,僅占總EST-SSR的4.4%,且全部是復(fù)合型(圖2)。

圖2 印度谷螟轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR的長度分布Fig.2 Length distribution of EST-SSRs in the Plodia interpunctella transcriptome

2.3 微衛(wèi)星在轉(zhuǎn)錄組編碼區(qū)分布特征

印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,有23 310個Unigene序列功能注釋成功。在23 310個注釋成功的Unigene序列中發(fā)現(xiàn)EST-SSR位點2 226個,總長度13 182 617 bp,其中編碼區(qū)858個EST-SSR位點。編碼區(qū)EST-SSR中二堿基重復(fù)319個,三堿基重復(fù)378個,在非編碼區(qū)二堿基重復(fù)517個,三堿基重復(fù)291個。說明在編碼區(qū)以三堿基重復(fù)為主,非編碼區(qū)以二堿基重復(fù)為主。

2.4 微衛(wèi)星引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

根據(jù)印度谷螟可用于引物設(shè)計的EST-SSR序列共隨機(jī)設(shè)計了66對引物,部分引物信息見表2。以單頭印度谷螟4齡幼蟲DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明66對引物中的31對引物可以擴(kuò)增得到條帶(圖3)。其中兩對引物擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期相差較大,一對引物產(chǎn)生非特異性條帶,其余28對引物與預(yù)期相符。

表2 印度谷螟31對EST-SSR引物信息

圖3 印度谷螟31個EST-SSR位點的擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Agarose gel showing the amplification of 31 EST-SSR loci in the Plodia interpunctella transcriptome

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)方法從印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫37 246條Unigenes中共獲得EST-SSR位點3 173個,其出現(xiàn)頻率(8.52%)高于大多數(shù)的昆蟲,如扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis(6.33%)[18],煙粉虱Bemisiatabaci(5.07%)[19],橘小實蠅Bactroceradorsalis(4.23%)[11],黃粉蟲Tenebriomolitor(1.67%)[20],云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(1.29%)[21]和蔥地種蠅Deliaantiqua(1.12%)[22]等;而目前僅有少數(shù)昆蟲的EST-SSR位點出現(xiàn)頻率高于印度谷螟,如黑翅土白蟻Odontotermesformosanus(9.98%)[23]。導(dǎo)致這種差異的原因,可能與EST-SSR篩選的標(biāo)準(zhǔn)不同以及用于測序的RNA質(zhì)量相關(guān)。當(dāng)然,最本質(zhì)的原因應(yīng)是物種本身的差異所致。

本研究表明,印度谷螟轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星的種類較為豐富,1～6 核苷酸重復(fù)類型都有出現(xiàn),主要重復(fù)類型為1～3核苷酸重復(fù),占SSR總數(shù)的93.48%。在單堿基重復(fù)基元中, A/T是占優(yōu)勢的重復(fù)基元,這與已研究的大多數(shù)昆蟲類似,如褐飛虱Nilaparvatalugens[24]、黏蟲Mythimnaseparata[15]和扶桑綿粉蚧P.solenopsis[18]等。研究發(fā)現(xiàn),基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫發(fā)掘的昆蟲微衛(wèi)星以三堿基重復(fù)SSR出現(xiàn)的頻率最高,如二點委夜蛾Athetislepigone[25]、灰飛虱Laodelphaxstriatellus[26]、橘小實蠅B.dorsalis[11]、黃粉蟲T.molitor[20]和溫帶臭蟲Cimexlectularius[16]等。普遍的觀點認(rèn)為,三堿基重復(fù)序列占據(jù)主導(dǎo)地位,是由于三聯(lián)體密碼子的選擇作用所致[27]。因為密碼子的基本單位就是三堿基,其他類型的重復(fù)單元會引起閱讀框的改變,增加錯配或者移碼突變的機(jī)會。本研究發(fā)現(xiàn),印度谷螟編碼區(qū)中三堿基重復(fù)也為優(yōu)勢重復(fù)單元,支持該論點。然而,在印度谷螟的所有EST-SSR中最優(yōu)勢重復(fù)單元為二堿基重復(fù),這與麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis、N.giraulti和N.longicornis[28]、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[29]和細(xì)梢小卷蛾Rhyacionialeptotubula[17]等類似。以往對昆蟲EST-SSR的研究中,以GC/GC為核心基元的兩堿基重復(fù)SSR的存在非常稀少,幾乎為零。但是在印度谷螟二堿基重復(fù)單元中GC/GC含量占了1/3左右,僅僅低于重復(fù)單元AT/AT,這與同屬于鱗翅目的黏蟲[15]、二點委夜蛾[25]和細(xì)梢小卷蛾[17]相似。因此,我們推斷GC/GC重復(fù)基元可能與鱗翅目的某些特殊功能有關(guān)系。此外,研究表明,SSR的多態(tài)性與其長度以及核心基元的重復(fù)次數(shù)的多少具有相關(guān)性,即長度越長、核心基元的重復(fù)次數(shù)越多,其多態(tài)性越高[30]。印度谷螟的EST-SSR長度集中于12～15個堿基占據(jù)了70%,而且還有12%(多為二、三堿基重復(fù)單元)長度大于20個堿基。因此,印度谷螟可能具有較高的遺傳多態(tài)性,這也是該蟲高度適應(yīng)環(huán)境而成為世界性害蟲的遺傳基礎(chǔ)。

眾所周知,鱗翅目昆蟲SSR開發(fā)難度較大,由于其SSR的多態(tài)性較低、存在微衛(wèi)星家族現(xiàn)象并有大量的無效等位基因[31]。為得到質(zhì)量較高且具有潛在多態(tài)性的引物,在篩選引物時應(yīng)盡量選擇側(cè)翼長度大于30 bp的位點,且相似度低于70%,核心重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)二堿基在10次以上,三堿基應(yīng)在8次以上,可降低家族現(xiàn)象的影響并且避免非特異性擴(kuò)增[11]。本文利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計得到的66對EST-SSR引物,28對擴(kuò)增得到預(yù)期大小的條帶,占合成引物的42.42%。盡管這些位點的多態(tài)性還有待進(jìn)一步檢驗,但其數(shù)量足夠開展印度谷螟種群遺傳學(xué)等相關(guān)研究。導(dǎo)致EST-SSR位點擴(kuò)增失敗有諸多原因:擴(kuò)增得到條帶遠(yuǎn)大于預(yù)期,可能由于基因組DNA中含有內(nèi)含子而在轉(zhuǎn)錄后未出現(xiàn),干擾了擴(kuò)增過程;而其中一對引物產(chǎn)生非特異性條帶可能是由于EST-SSR位點位于同源基因序列上;擴(kuò)增失敗無條帶,可能是因為EST-SSR在基因組中的表達(dá)豐度較低而導(dǎo)致產(chǎn)物濃度很低,未能檢測到。

目前,SSR研究主要應(yīng)用于遺傳學(xué)分析。對于非模式昆蟲的研究其難點在于SSR引物的篩選,因為在昆蟲等節(jié)肢動物基因組內(nèi)SSR的含量較少,且存在家族現(xiàn)象,這加大了研究難度。傳統(tǒng)微衛(wèi)星篩選方法費(fèi)時費(fèi)力,且費(fèi)用高昂。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展解決了這一難題,從轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中可以直接篩選出質(zhì)量合格的SSR,經(jīng)過驗證其在相近物種間具有較高的通用性。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,測序通量加大,成本降低,這為昆蟲SSR的大規(guī)模開發(fā)提供了可能,且SSR所在基因的表達(dá)水平也可以監(jiān)測到,為深入研究SSR在基因調(diào)控和修飾中所產(chǎn)生的作用提供了技術(shù)保障[32]。但基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得的EST-SSR位點,其核心重復(fù)次數(shù)相較于基因組的SSR少,這是因為在組裝過程中重復(fù)次數(shù)多的SSR會發(fā)生斷裂或者丟失,這影響了EST-SSR位點的多態(tài)性。另外,cDNA中缺少內(nèi)含子或者內(nèi)含子位于SSR引物之間,這就導(dǎo)致部分EST-SSR位點的擴(kuò)增失敗。另一方面,基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)掘EST-SSR位點具有快速、方便、低廉以及數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點,已成為當(dāng)前發(fā)掘昆蟲微衛(wèi)星位點的重要策略。

綜上所述,本研究基于印度谷螟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得了大量EST-SSR位點,并對其數(shù)量分布、相關(guān)特性及適用性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘印度谷螟微衛(wèi)星位點是高效可行的,也是發(fā)掘非模式生物EST-SSR位點的一種經(jīng)濟(jì)、快速、有效的方法。本研究獲得的印度谷螟EST-SSR位點,為今后開展該蟲的遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究,闡明其種群遺傳分化及抗藥性基因流動規(guī)律,以及制定有效防控策略等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Analysis of microsatellite loci inPlodiainterpunctellabased ontranscriptome dataset

Tang Peian1, Tao Yexin1, Xue Hao1, Yuan Minglong2

(1.College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China; 2.State Key Laboratory of Grassland Agro-Ecosystems/College of Pastoral Agricultural Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

This study is aimed to identify gene microsatellite (EST-SSR) loci from the transcriptome database ofPlodiainterpunctella. Based on these SSR sequences, the selected SSR primer pairs were validated. The number, repetition time and location information of all microsatellites obtained with the microsatellite search tool MicroSAtellite were analyzed.Primer Premier 5 was used to designP.interpunctellaSSR primers, and then these primer pairs were verified by PCR. A total of 3 173 SSRs were identified in 37 246 Unigenes, with one SSR per 13 kb. The majority of microsatellite loci consisted of mono-, di- and tri-nucleotide motifs (28.21%, 39.84% and 25.43%, respectively). However, different types of repeat SSRs had considerably different distribution. Except mono-nucleotide, AT/AT was the most frequent repeat motif (593 repeats) among all SSR motifs. Among the 66 designed primer pairs, 28 pairs were amplified successfully. Our study shows that it is feasible to develop microsatellite markers based onP.interpunctellatranscriptome. The EST-SSRs ofP.interpunctellaobtained in this study are helpful for population genetics studies of this important stored-product pest.

transcriptome; high-throughput sequencing; Pyralidae; microsatellite; molecular marker

2016-06-22

2016-08-02

糧食公益性行業(yè)科研專項(201413007-2,201513002-5-3);國家重點研發(fā)計劃專項(2016YFD0401004-04);江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程

Q 968.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.007

聯(lián)系方式 E-mail:tangpeian@163.com