杜曉丹，方玉，王春 仁，陳鴻波，楊昭鵬

中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所，北京 100050

牛血清白蛋白作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評價陽性對照物的研究

杜曉丹，方玉，王春 仁，陳鴻波，楊昭鵬

中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢定所，北京 100050

目的 本文旨在對生物醫(yī)用材料免疫原性評價方法進(jìn)行初步探索，尋找有效的生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫評價所需陽性對照物，并對其使用劑量，免疫方法和免疫效果進(jìn)行探索，為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品免疫原性評價實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化積累數(shù)據(jù)。方法 選取雌性8周Balb/c小鼠，隨機分組，分別不同劑量免疫3次，每次間隔兩周。分別摘眼球取血，分離血清，并進(jìn)行血清抗體總IgG濃度檢測，實驗結(jié)果利用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行分析。結(jié)果 牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）單獨免疫小鼠均無顯著的體液免疫刺激作用；BSA混合佐劑免疫小鼠中劑量組和高劑量組的淋巴細(xì)胞增值能力明顯強于陰性對照組，高劑量組強于中劑量組；二次免疫后兩周取材與3次免疫后兩周取材BSA混合佐劑組細(xì)胞增殖能力均與陰性對照組有顯著性差異，3次免疫后兩周強于二次免疫后兩周，佐劑對照組與陰性對照組淋巴細(xì)胞增值能力無顯著性差異。結(jié)論 實驗證明，BSA可以作為生物醫(yī)用材料產(chǎn) 品體液免疫檢測的陽性對照物，免疫刺激強度適中。

牛血清白蛋白；體液免疫；陽性對照物；生物醫(yī)用材料；免疫刺激

引言

生物醫(yī)用材料的免疫原性通常比較低，因此對其展開體液免疫評價工作就需要找出一種具有適當(dāng)?shù)拿庖叽碳ぷ饔?，刺激程度不強不弱的物質(zhì)作為檢測所需的陽性對照物。而牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）除具有以上特性外，也是ASTM標(biāo)準(zhǔn)F1905-98《材料致免疫毒性測試方法選擇標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范》中推薦的材料體液免疫檢測陽性對照物[1-2]。因此，本文對BSA用于生物醫(yī)用材料體液免疫陽性對照物的使用劑量，免疫方法和免疫效果進(jìn)行了一系列實驗。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

本試驗在中國食品藥品檢定研究院，生物材料與組織工程實驗室完成，采用隨機分組設(shè)計，對照動物實驗的模式，選取SPF級雌性Balb/c小鼠，飼養(yǎng)許可證SCXK（京2005-0004）為試驗動物。使用的儀器包括：凈化工作臺（HDL BCN-1360B），離心機（sigma 3k15），牛血清白蛋白（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司），酶標(biāo)儀（Therm o MSS），超純水儀（MilliPore），振蕩儀（AKI），-80℃冰柜（Thermo），小鼠血清總IgG定量檢測試劑盒（Cat#：6320 ALPHA DIAGNOSTIC），小鼠血清總IgM定量檢測試劑盒（Cat#：6380 ALPHA DIAGNOSTIC）。

1.2 方法

1.2.1 BSA單獨免疫小鼠實驗

雌性8周Balb/c小鼠28只，隨機分為4組，每組7只。免疫3次，每次間隔兩周，3次免疫兩周后取材。陰性對照組：每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS。BSA高、中、低劑量組：每只小鼠皮下注射0.1 mL BSA的PBS水溶液，每組BSA的PBS水溶液的濃度分別為1000、500、100 μg/mL。取材方法：摘眼球取血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測血清中總IgG濃度[3-9]。

1.2.2 BSA加佐劑免疫小鼠實驗

雌性8周Balb/c小鼠24只，隨機分為4組，每組6只。免疫3次，每次間隔兩周，3次免疫兩周后取材。陰性對照組：每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS。BSA高、中、低劑量組：首次免疫：BSA的PBS水溶液+弗氏完全佐劑（1:1混合，1000、500、100 μg/mL），每只小鼠皮下注射0.1 mL，加強免疫：BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐劑（1:1混合，1000、500、100 μg/mL），每只小鼠皮下注射0.1 mL。實驗操作同上。

1.2.3 BSA免疫次數(shù)及時間點的選擇

雌性8周Balb/c小鼠36只，隨機分為6組，每組6只。分為3個取材時間點，兩個實驗組：二次免疫后兩周（BSA+佐劑組、陰性對照組），3次免疫后兩周（BSA+佐劑組、陰性對照組）和3次免疫后4周（BSA+佐劑組、陰性對照組）免疫3次，每次間隔兩周。BSA+佐劑組：首次免疫：BSA的PBS水溶液+弗 氏完全佐劑（1∶1混合，1000 μg/mL），每只小鼠皮下注射0.1 mL，加強免疫：BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐劑（1∶1混合，1000 μg/mL），每只小鼠皮下注射0.1 mL。陰性對照組：每只小鼠皮下注射0.1 mL PBS[10-13]。實驗操作同上。

主要觀察指標(biāo)：① 觀察BSA單獨免疫小鼠的免疫效果；② 觀察BSA混合佐劑免疫小鼠的免疫效果；③ BSA作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫陽性對照物的使用劑量；④ BSA作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫陽性對照物適宜的免疫、取材時間。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BSA單獨免疫小鼠實驗

試驗發(fā)現(xiàn)，BSA高中低3個劑量組中：中劑量，高劑量組雖比陰性對照組絕對值高，但與陰性對照組IgG水平幾乎相當(dāng)，并沒有產(chǎn)生較強的體液免疫刺激作用。BSA高中低3個劑量組與陰性對照組比較，血清總IgG濃度均無統(tǒng) 計學(xué)差異（P＞0.05）。因此，在此劑量下，以BSA單獨免疫小鼠作為生物醫(yī)用材料體液免疫檢測陽性對照物是不可行的。BSA單獨免疫小鼠的各實驗組血清總IgG濃度均值，見表1。

表1 BSA單獨免疫小鼠血清總IgG水平（μg/mL）

2.2 BSA加佐劑免疫小鼠實驗

本次試驗采用與前次試驗相同批號試劑盒進(jìn)行，且本次試驗意在高中低3個劑量組之間進(jìn)行比較，不需得到IgG的絕對濃度，因此以各組吸光度數(shù)值直接進(jìn)行比較。從BSA加佐劑免疫小鼠血清總IgG檢測的各組吸光度數(shù)值可見，高中低3個劑量組IgG水平與陰性對照組比較均有升高，其中高劑量組最為顯著，因此可以判斷，BSA加佐劑免疫方式可以作為生物醫(yī)用材料體液免疫檢測陽性對照物，并應(yīng)選擇高劑量作為生物醫(yī)用材料體液免疫檢測陽性對照劑量。BSA加佐劑免疫小鼠血清總IgG水平，見表2。

表2 BSA加佐劑免疫小鼠血清總IgG水平（吸光度值）

2.3 BSA免疫次數(shù)及時間點的選擇及對佐劑作用的觀察

本次試驗選用前期試驗總結(jié)出的高劑量混合佐劑免疫小鼠，選擇了3個取材時間點，并添加佐劑對照組，集中對免疫次數(shù)，取材時間點以及佐劑的作用進(jìn)行評測。不同取材時間點各實驗組的小鼠血清總IgG濃度均數(shù)，見表3。陽性組與陰性對照組進(jìn)行獨立樣本t檢驗，佐劑組與陰性對照組進(jìn)行獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計各組間有無統(tǒng)計學(xué)差異。

二次免疫后兩周，BSA+佐劑組小鼠血清總IgG水平明顯高于陰性對照組，P＜0.05,差異據(jù)統(tǒng)計學(xué)意義。3次免疫后兩周，BSA+佐劑組的小鼠血清總IgG水平明顯高于陰性對照組，P＜0.01，差異具統(tǒng)計學(xué)意義。3次免疫后4周，BSA+佐劑組小鼠血清總IgG水平與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。佐劑對照組與陰性對照組比較：二次免疫后兩周P＞0.05沒有顯著性差異，說明BSA在佐劑的輔助下起到了較好的免疫刺激作用；3次免疫后兩周P值進(jìn)一步減小，依然與陰性對照組無顯著性差異，說明佐劑的免疫作用得到進(jìn)一步放大，在陽性對照物免疫刺激過程中起到了良好的免疫輔助作用，并沒有掩蓋陽性對照物的免疫刺激作用，輔助陽性對照物體液免疫檢測產(chǎn)生較明顯的陽性結(jié)果。因此BSA可以作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫檢測陽性對照物使用，而3次免疫后4周取材的小鼠BSA組與陰性對照組小鼠血清總IgG水平t檢驗結(jié)果P值為0.433＞0.05沒有顯著性差異，說明在免疫后4周時免疫水平已有所下降，因此較好的取材時間點應(yīng)為3次免疫后兩周。各時間點和實驗組小鼠血清總IgG水平，見表3。

3 討論

目前，對各類藥品、生物制品開展的免疫原性研究很多，但對醫(yī)療器械，特別是生物醫(yī)用材料的免疫原性研究還不夠深入。這主要是由于生物醫(yī)用材料與藥品在用途及物化特性上的不同，使得一些應(yīng)用于藥品的成熟試驗方法在應(yīng)用于生物醫(yī)用材料時不適用造成的。而目前無論是國際還是國內(nèi)，對生物醫(yī)用材料產(chǎn)品開展免疫原性評價均無標(biāo)準(zhǔn)方法，現(xiàn)存的均為一些方向建議和指導(dǎo)原則[14-20]。

本文即是通過可行性分析后，通過小鼠體內(nèi)實驗，初步探討了BSA作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫檢測陽性對照物的可行性，劑量，實驗方法，免疫時間等。希望能夠起到拋磚引玉的作用，為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品免疫原性檢測方法的建立貢獻(xiàn)力量。

4 結(jié)論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)用材料也在臨床中得到越來越廣泛的應(yīng)用，國家針對這一趨勢，做出了對各種生物醫(yī)用材料進(jìn)行免疫原性檢測的要求，由于生物醫(yī)用材料產(chǎn)品與疫苗等生物制品有所不同，往往存在各種物理化學(xué)特性，而且免疫原性較低，因此需要根據(jù)材料的特性對其進(jìn)行免疫原性檢測方法的建立。本文即是探索具體檢驗方法建立至關(guān)重要的一環(huán)-陽性對照物的選取和具體應(yīng)用方法。

實驗證明，BSA可以作為生物醫(yī)用材料產(chǎn)品體液免疫檢測的陽性對照物，免疫刺激強度適中。具體應(yīng)用方法為：雌性8周balb/c小鼠免疫3次，間隔兩周。首次：BSA的PBS水溶液+弗氏完全佐劑（1∶1混合，1000 μg/mL），皮下注射0.1 mL/只；加強免疫：BSA的PBS水溶液+弗氏不完全佐劑（1∶1混合，1000 μg/mL），皮下注射0.1 mL/只；最佳取材時間點為3次免疫后兩周。

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表3 各時間點和實驗組小鼠血清總IgG水平（μg/mL）

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本文編輯 袁雋玲

Study on BSA as a Positive Control for Humoral Immunity Evaluation of Medical Biomaterial

DU Xiao-dan, FANG Yu, WANG Chun-ren, CHEN Hong-bo, YANG Zhao-peng

Institute for Medical Devices Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

Objective This text was aimed to search a valid humoral immunity positive control based on the tentative exploration analysis of the immunogenic evaluative method of medical biomaterial. Meanwhile, the recommended dosage, immune method and immune effect was aimed to explore. Methods A group of 8 weeks’ female Balb/c mice were randomized assigned into groups. Different doses of bovine serum albumin (BSA) were use d to immune the mouses 3 times, each time spaced for 2 weeks. The eyeball blood were separately gained and the serum were segregate to detect the serum total IgG antibody concentration. The experimental results were analyzed by statistical methods. Results The Mouse immuned by BSA alone did not show signif i cant humoral immunity stimulative effect in all the dosages. The mouse that BSA mixed adjuvant, serum IgG of the middle dose and the high dose were much higher than the negative control, and the ability of high dose was higher than the middle dose. It was signif i cant different between the serum IgG of the group executed 2 weeks after immuned for 2 times and the negative control group, as well as the group executed 2 weeks after immuned for 3 times and the negative control group. Serum IgG of the group executed 2 weeks after immuned for 3 times was higher than the group executed 2 weeks after immuned for 2 times. The adjuvant control group di d not show signif i cant difference with the negative control group. Conclusion The experiment indicated that BSA could be used as a humoral immunity positive control of the immunogenic evaluation of the medical biomaterial.

bovine serum albumin; humoral immunity; positive control; medical biomaterial; immunostimulation

R331

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.05.008

1674-1633(2017)05-0032-03

2016-12-30

2017-02-13

楊昭鵬，主任藥師，主要從事醫(yī)療器械安全有效性評價方向的研究。

通訊作者 郵箱：kilei007@163.com