李定紅， 張艷梅， 周廣燦， 雷 照， 孫小芹， 杭悅宇

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

采用花器噴霧法并基于Cre/lox系統(tǒng)定點(diǎn)整合擬南芥Rps2基因的技術(shù)體系研究

李定紅， 張艷梅， 周廣燦， 雷 照， 孫小芹①， 杭悅宇①

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

定點(diǎn)整合是一種指導(dǎo)目的基因以精確單拷貝進(jìn)入基因組預(yù)定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用于解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來(lái)的系列問(wèn)題[1-2]。在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中，已通過(guò)根外植體法轉(zhuǎn)化實(shí)施了基因的定點(diǎn)整合[3]，但這一過(guò)程存在雜菌污染、分化困難和生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，且定點(diǎn)整合效率極低[3]，無(wú)法進(jìn)行推廣應(yīng)用?；ㄆ鲊婌F法是一種不依賴于組織或細(xì)胞培養(yǎng)而直接在活體植株中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法，在擬南芥中通過(guò)該法獲得的隨機(jī)整合效率達(dá)1.33%～2.41%[4]，是擬南芥最高效的轉(zhuǎn)基因方法。

Rps2基因是擬南芥的單拷貝抗病基因[5]，介導(dǎo)對(duì)攜有avrRpt2基因的細(xì)菌病原物的抗病性；擬南芥rps2-101C生態(tài)型是Col-0生態(tài)型經(jīng)EMS輻射篩選的突變體植株[5]，對(duì)avrRpt2基因無(wú)抗性。作者以rps2-101C生態(tài)型為轉(zhuǎn)基因背景材料，通過(guò)花器噴霧法實(shí)施Cre/lox系統(tǒng)介導(dǎo)的Rps2基因的定點(diǎn)整合，以期對(duì)擬南芥的定點(diǎn)整合技術(shù)體系進(jìn)行改進(jìn)，并為加快植物基因功能和定向育種的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

質(zhì)粒pSDM3110[3]由荷蘭萊頓大學(xué)的Hooykaas博士提供，該質(zhì)粒包含1個(gè)lox位點(diǎn)和由35SCaMV啟動(dòng)子調(diào)控的Cre編碼區(qū)形成的嵌合結(jié)構(gòu)。農(nóng)桿菌株系GV3101、擬南芥rps2-101C生態(tài)型以及3種交換載體p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2[6]由美國(guó)芝加哥大學(xué)Bergelson博士提供；p1301-lox-nptⅡ載體含有在2個(gè)lox位點(diǎn)間插入無(wú)啟動(dòng)子的nptⅡ基因編碼區(qū)和終止子的結(jié)構(gòu)，p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2載體則是在p1301-lox-nptⅡ載體的nptⅡ基因終止子后分別插入Rps2抗病基因和rps2感病基因的全長(zhǎng)序列。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化和篩選 采用電穿孔法[7]將質(zhì)粒pSDM3110轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中；將擬南芥rps2-101C生態(tài)型在溫室中栽培至開(kāi)花，采用花器噴霧法[4]進(jìn)行轉(zhuǎn)化；T0代種子萌發(fā)后經(jīng)Basta(德國(guó)AgroEvo公司)噴灑進(jìn)行篩選；保留T1代抗性植株并培養(yǎng)至開(kāi)花，自交后子代幼苗用Basta篩選，存活率約為75%的T1代植株即為單拷貝轉(zhuǎn)化植株。pSDM3110的T-DNA區(qū)域在基因組中的轉(zhuǎn)入位置用Vectorette Ⅱ試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)通過(guò)錨定PCR確定，基于T-DNA基因組定位信息通過(guò)3-引物PCR[8]鑒定轉(zhuǎn)基因植株的雜合狀態(tài)。

將篩選的轉(zhuǎn)基因雜合體植株用花器噴霧法[4]分別進(jìn)行交換載體轉(zhuǎn)化，以p1301-lox-nptⅡ載體轉(zhuǎn)化rps2-101C生態(tài)型為空白對(duì)照。獲得的種子經(jīng)卡那霉素篩選，自交2代后其子代表現(xiàn)100%卡那霉素抗性的植株即為轉(zhuǎn)基因純合體植株。

1.2.2 等位基因系的表型與遺傳驗(yàn)證 針對(duì)交換載體和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。由于定點(diǎn)整合后Bar和Cre間的nptⅡ表達(dá)框被活化，因此，針對(duì)2個(gè)發(fā)生精確整合的lox位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物A和B，分別擴(kuò)增出1.0和1.1 kb的片段；若存在隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因拷貝，引物C將擴(kuò)增出0.6 kb的片段。

根據(jù)Jefferson等[9]的方法，通過(guò)組織化學(xué)染色法測(cè)定GUS(β-葡糖醛酸酶)在植株中的活性，從而檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否存在隨機(jī)T-DNA整合。采用EXPRESS Two-Step SYBR?GreenERTM試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)；Rps2引物結(jié)合于基因末端(位于2 730個(gè)堿基中的第2119位至第2314位)，以EF1a為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參[10]。采用丁香假單胞菌DC3000：avrRpt2接種擬南芥植株進(jìn)行過(guò)敏反應(yīng)測(cè)試；并根據(jù)植株感病癥狀參照文獻(xiàn)[11]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過(guò)敏反應(yīng)分級(jí)，抗病記為“2”、中度抗病記為“1”、感病記為“0”。

2 結(jié)果和分析

2.1 定點(diǎn)整合體系的構(gòu)建

基于Cre/lox系統(tǒng)的擬南芥Rps2基因的定點(diǎn)整合基本流程見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：攜帶lox靶序列的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株被分別轉(zhuǎn)入交換載體(p1301-lox-nptⅡ、p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2)中，在交換載體上位于2個(gè)lox位點(diǎn)間的序列在Cre重組酶作用下被環(huán)化，隨之被定點(diǎn)整合到基因組中預(yù)先轉(zhuǎn)入的lox表達(dá)框。定點(diǎn)整合阻斷了Cre編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄使之終止表達(dá)，而交換載體中nptⅡ基因受35S啟動(dòng)子調(diào)控恢復(fù)正常表達(dá)，用于定點(diǎn)整合植株的篩選。

： 分別表示引物A、B和C的結(jié)合位點(diǎn) Representing binding sites of primer A， B and C， respectively； ： 表示lox位點(diǎn)，箭頭方向指示lox位點(diǎn)的方向 Representing lox site， the arrow’s direction indicating the direction of lox site； ： 分別表示T-DNA的左、右邊界Representing left and right borders of T-DNA， respectively； ： 分別表示基因編碼區(qū)及其啟動(dòng)子和終止子 Representing gene coding region and its promoter and terminator， respectively.圖1 由Cre/lox介導(dǎo)的擬南芥Rps2基因的定點(diǎn)整合基本流程圖Fig. 1 Basic flow chart of site-specific integration of Rps2 gene mediated by Cre/lox in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.2 轉(zhuǎn)基因雜合體植株的篩選

經(jīng)Basta篩選，共獲得3個(gè)轉(zhuǎn)lox靶序列的單拷貝植株系；T-DNA基因組定位顯示這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的基因組轉(zhuǎn)入位點(diǎn)不同，分別為第Ⅲ號(hào)染色體的4 289 059位點(diǎn)、第Ⅱ號(hào)染色體的13 898 787位點(diǎn)和第Ⅴ號(hào)染色體的18 136 204位點(diǎn)，分別被命名為P、Y和G株系。

2.3 定點(diǎn)整合植株的篩選及驗(yàn)證

經(jīng)卡那霉素篩選，共獲得1 495株定點(diǎn)整合候選植株，定點(diǎn)整合率約0.076%。在空白對(duì)照中，載體p1301-lox-nptⅡ轉(zhuǎn)化rps2-101C生態(tài)型未獲得卡那霉素抗性苗，說(shuō)明確實(shí)是由交換載體中的lox結(jié)構(gòu)與預(yù)先轉(zhuǎn)入基因組中的lox發(fā)生整合而產(chǎn)生了卡那霉素抗性苗。

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在1 495株定點(diǎn)整合候選植株中，86.04%的植株采用引物A和B分別擴(kuò)增出1.0 和1.1 kb的片段，但用引物C無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明這些植株是經(jīng)精確的定點(diǎn)整合產(chǎn)生的。同時(shí)，經(jīng)組織化學(xué)染色，約63.34%的候選植株未呈現(xiàn)藍(lán)色，表明沒(méi)有發(fā)生額外的隨機(jī)整合。

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明：與轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ載體的株系相比，轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ-Rps2和p1301-lox-nptⅡ-rps2載體的株系轉(zhuǎn)錄水平更高(P<0.05)。此外，過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(表1)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化p1301-lox-nptⅡ-Rps2載體的株系過(guò)敏反應(yīng)比其他2個(gè)株系更明顯(P<0.01)，從而證實(shí)定點(diǎn)轉(zhuǎn)入的Rps2基因可正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

載體Vector各株系的HR分級(jí) HRgradeofdifferentlinesP株系PlineY株系YlineG株系Glinep1301-lox-nptⅡ0.67±0.070.37±0.050.25±0.02p1301-lox-nptⅡ-Rps21.91±0.091.87±0.052.01±0.05p1301-lox-nptⅡ-rps20.14±0.010.56±0.060.78±0.07

3 討論和結(jié)論

雖然植物定點(diǎn)整合技術(shù)可解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中轉(zhuǎn)入基因表達(dá)易變的問(wèn)題，但基于細(xì)胞或組織培養(yǎng)體系的植物定點(diǎn)整合技術(shù)體系的轉(zhuǎn)化效率通常很低，如擬南芥根外植體法的定點(diǎn)整合率僅0.000 1%～0.001%[3]，水稻(OryzasativaLinn.)基因槍法僅獲得1株定點(diǎn)整合植株[12]，煙草(NicotianatabacumLinn.)PEG法的定點(diǎn)整合率僅0.000 12%[2]等。作者通過(guò)花器噴霧法并基于Cre/lox系統(tǒng)對(duì)擬南芥定點(diǎn)整合技術(shù)體系進(jìn)行了改進(jìn)，其定點(diǎn)整合率達(dá)0.076%，較Vergunst等[3]報(bào)道的定點(diǎn)整合率高2至3個(gè)數(shù)量級(jí)，極大地提高了定點(diǎn)整合的效率，且操作流程簡(jiǎn)單易行，可改善定點(diǎn)整合技術(shù)效率低的現(xiàn)狀。

Vergunst等[3]在利用根外植體法進(jìn)行擬南芥定點(diǎn)整合的過(guò)程中觀察到少量幼苗葉片發(fā)生脫綠現(xiàn)象，表現(xiàn)出卡那霉素敏感癥狀。本研究也觀察到極少量幼苗具有葉片脫綠現(xiàn)象，推測(cè)可能是在幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中，一些以雜合狀態(tài)存在的Cre基因編碼的重組酶又將nptⅡ基因切除下來(lái)，從而使部分細(xì)胞喪失卡那霉素抗性，因此，作者僅保留了子代具有完全卡那霉素抗性的候選植株用于進(jìn)一步分析。

利用改進(jìn)的Cre/lox定點(diǎn)整合體系，成功介導(dǎo)Rps2基因準(zhǔn)確插入擬南芥基因組的預(yù)定位點(diǎn)，定點(diǎn)整合效率大幅提高，定點(diǎn)整合的Rps2基因正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，因此，應(yīng)用本體系可極大提高植物定點(diǎn)整合遺傳轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率。

[1] FUKUSHIGE S， SAUER B. Genomic targeting with a positive-selectionloxintegration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89： 7905-7909.

[2] DAY C D， LEE E， KOBAYASHI J， et al. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level， or alleles that are differentially silenced[J]. Genes and Development， 2000， 14： 2869-2880.

[3] VERGUNST A C， JANSEN L E T， HOOYKAAS P J J. Site-specific integration ofAgrobacteriumT-DNA inArabidopsisthalianamediated by Cre recombinase[J]. Nucleic Acids Research， 1998， 26： 2729-2734.

[4] CHUNG M H， CHEN M K， PAN S M. Floral spray transformation can efficiently generateArabidopsistransgenic plants[J]. Transgenic Research， 2000， 9： 471-476.

[5] MINDRINOS M， KATAGIRI F， YU G L， et al. TheA.thalianadisease resistance geneRps2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rish repeats[J]. Cell， 1994， 78： 1089-1099.

[6] MACQUEEN A， SUN X Q， BERGELSON J. Genetic architecture and pleiotropy shape costs ofRps2-mediated resistance inArabidopsisthaliana[J]. Nature Plants， 2016， 2： 1-8.

[7] MATTANOVICH D， HIMMLER G， REGNER F， et al. Stopping the DNA polymerase activity at a specific site with a dideoxyoligo-nucleotide： selective labelling of single stranded circular DNA[J]. Nucleic Acids Research， 1989， 17： 8384.

[8] GHERBI H， GALLEGO M E， JALUT N， et al. Homologous recombinationinplantais stimulated in the absence of Rad50[J]. EMBO Reports， 2001， 2： 287-291.

[9] JEFFERSON R A， KAVANAGH T A， BEVAN M W. GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The EMBO Journal， 1987， 6： 3901-3907.

[10] HEID C A， STEVENS J， LIVAK K J， et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research， 1996， 6： 986-994.

[11] GAO L P， ROUX F， BERGELSON J. Quantitative fitness effects of infection in a gene-for-gene system[J]. New Phytologist， 2009， 184： 485-494.

[12] SRIVASTAVA V， OW D W. Biolistic mediated site-specific integration in rice[J]. Molecular Breeding， 2001， 8： 345-350.

(責(zé)任編輯： 郭嚴(yán)冬)

Technology system research on site-specific integration ofRps2 gene inArabidopsisthalianabased on Cre/loxsystem by floral spraying method

LI Dinghong， ZHANG Yanmei， ZHOU Guangcan， LEI Zhao， SUN Xiaoqin①， HANG Yueyu①

(Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China)，

J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(1)： 104-106

To improve site-specific integration technology system， site-specific integration ofRps2 target gene inArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh. was carried out based on Cre/loxsystem by floral spraying method. The results show that 1 495 site-specific integration candidate plants are obtained by this method with a site-specific integration efficiency of about 0.076%. After PCR and histochemical staining experiment verification， the positive plants of precise integration account for 86.04%， in which， 63.34% positive plants are single copy transformed plants. The results of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and hypersensitive reaction (HR) show that the site-specific integratedRps2 gene can be transcribed and expressed normally. It is suggested that this system can greatly improve the stability and efficiency of site-specific integration genetic transformation system in plants.

Cre/lox系統(tǒng)；Rps2基因； 定點(diǎn)整合； 擬南芥； 花器噴霧法

Cre/loxsystem；Rps2 gene； site-specific integration；Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.； floral spraying method

2016-09-08

江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(省屬公益類科研院所能力提升)(BM2015019)； 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2010476)； 江蘇省植物遷地保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(遷201202)； 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所青年基金項(xiàng)目(SQ201404)

李定紅(1991—)，女，安徽滁州人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳與進(jìn)化方面的研究。

①通信作者E-mail： xiaoqinsun@cnbg.net； hangyueyu@cnbg.net

Q785； Q949.748.3

A

1674-7895(2017)01-0104-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.01.14