黃 琳 滕美君 徐竟男 張純潔 鐘克禎 程名揚(yáng) 陶雅軍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連116622)

HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)三陰性乳腺癌中癌癥干細(xì)胞活化的相關(guān)性研究①

黃 琳 滕美君 徐竟男 張純潔 鐘克禎 程名揚(yáng) 陶雅軍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連116622)

目的：探討HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號(hào)通路在三陰性乳腺癌中癌癥干細(xì)胞活化的相關(guān)性及其臨床意義。方法：采用免疫磁珠法從三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中分選出ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞和ALDH1-乳腺癌細(xì)胞，采用qRT-PCR方法比較HIF-1α和Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路主要分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)差異；采用免疫組化方法了解HIF-1α和ALDH1在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)以及與干細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路Hedgehog的相互關(guān)系。結(jié)果：HIF-1α mRNA、SMO mRNA和GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)均明顯高于ALDH1-乳腺癌細(xì)胞，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為90.0%和70.0%，ALDH1的陽性表達(dá)率分別為93.3%和66.7%，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。在三陰性乳腺癌組織中HIF-1α和ALDH1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.53，P<0.01)。HIF-1α的表達(dá)與三陰性乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P均<0 .05)，ALDH1的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)。HIF-1α與Hedgehog信號(hào)通路分子SHH(r=0.584，P<0.01)、SMO(r=0.467，P<0.01)和GLI1(r=0.439，P<0.05)的表達(dá)呈正相關(guān)，ALDH1與SHH(r=0.426，P<0.05)和GLI1(r=0.394，P<0.05)的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論：HIF-1α和Hedgehog信號(hào)通路在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中活化，HIF-1α、ALDH1與Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路可能相互協(xié)同激活癌癥干細(xì)胞從而促進(jìn)三陰性乳腺癌的惡性進(jìn)展。

三陰性乳腺癌；癌癥干細(xì)胞；HIF-1α；ALDH1；Hedgehog信號(hào)通路

癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSC)具有自我更新、分化與無限增殖能力，與腫瘤的持續(xù)增殖、抗凋亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥等惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切。乳腺癌是一類在分子水平上具有高度異質(zhì)性的疾病。2000年，Perou等[1]最先對(duì)乳腺癌的基因表達(dá)進(jìn)行研究，將乳腺癌分成luminal A型(ER+HER-2-)、luminal B型(ER+HER-2+)、ER-/HER-2+型、basal-like型(ER-HER-2-)及normal breast-like型等。在basal-like型乳腺癌中ER-PR-HER-2-亞型被稱為三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)[2]，約占全部乳腺癌的10%～17%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC更富有侵襲性，轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高、耐藥且患者預(yù)后較差，該類型乳腺癌患者的臨床病理改變符合癌癥干細(xì)胞性腫瘤的特點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)活化的CSC在TNBC組織中的含量明顯高于其他類型乳腺癌[3]，故又被稱為干細(xì)胞性乳腺癌[4,5]，但在TNBC中CSC活化的機(jī)制迄今還不清楚。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是維持細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡的重要調(diào)控因子[6]，有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤中HIF-1α可通過促進(jìn)CSC活化來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[7]。ALDH1(Aldehyde dehydrogenase 1)是細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化脫氫酶，是干細(xì)胞生長、分化的必需物質(zhì)，也是目前CSC標(biāo)記物研究的熱點(diǎn)之一[8]。Hedgehog信號(hào)通路在維持干細(xì)胞的增殖潛能、自我更新方面具有重要作用[9]，該通路紊亂可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[10]。本課題在前期研究中發(fā)現(xiàn)Hedgehog這一干細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路在三陰性乳腺癌中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后關(guān)系密切，抑制Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲[5]。本研究擬通過了解TNBC細(xì)胞或組織中HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號(hào)通路主要分子Sonic hedgehog(SHH)、patched1(PTCH1)、Smoothened(SMO)和Glioma-associated oncogene homoglog1(GLI1)的表達(dá)及其相互關(guān)系進(jìn)一步探討三陰性乳腺癌中癌癥干細(xì)胞活化的機(jī)制及其在三陰性乳腺癌惡性進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與臨床標(biāo)本 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為本室保存。30例TNBC和30 例非三陰性乳腺癌(non-triple-negative breast cancer，non-TNBC)組織石蠟標(biāo)本均采集自2008年5月～2012年11月大連市中心醫(yī)院病理科存檔標(biāo)本，全部乳腺癌患者術(shù)前均未接受放療、化療、激素或免疫治療，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌。

1.1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、EGF、bFGF和B27(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Trypsin-EDTA(Gibco公司)；TRIzol、Super-ScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Kit(Invitrogen公司)；免疫磁珠分選系統(tǒng)(Bioworld公司)；HIF-1α(ab51608)、SHH(ab53281) 、GLI1(ab49314)單克隆抗體和SMO(ab72130)、PTCH1(ab53715)兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)；ALDH1(sc-50385) 兔抗人單克隆抗體(Santa cruz公司)；SP廣譜超敏試劑盒、DAB 酶底物顯色劑(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，每3 d換液一次，并傳代培養(yǎng)。

1.2.2 免疫磁珠篩選 0.25%Trypsin-EDTA(Gibco公司)消化處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以1×105ml-1接種于含20 U/L EGF、20 U/L bFGF和2%B27的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。收集懸浮細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞總數(shù)為2×107ml-1。加入10 μg ALDH1一抗(Santa cruz公司)與40 μl IgG免疫磁珠(Bioworld公司)混勻，過磁性分選柱，ALDH1+細(xì)胞被吸附在分選柱中，收集流出的ALDH1-細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將分選柱脫離磁場(chǎng)，用PBE沖洗分選柱，收集ALDH1+細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.3 Real-time RT-PCR 應(yīng)用TRIzol試劑(Invi-trogen)從分選出的ALDH1+的乳腺癌干細(xì)胞和ALDH1-乳腺癌細(xì)胞中分別提取總RNA并按照試劑盒(SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Kit,Invitrogen,USA)說明書操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列如下：HIF-1α F primer：5′-CAGAGCAGGAAAAGGAGTCA-3′，R primer：5′-AGTAGCTGCATGATCG-TCTG-3′；SHH F primer：5′-CAGCGGAAGGTATGAAGGGAA-3′，R primer：5′-GCCAAAGCGTTCAA-CTTGTCCT-3′；PTCH1 F primer：5′-CTGGCAGGAGGAGTTGATTG-3′，R primer：5′-TTGAAGTGCTCGTACATTTGCT-3′；SMO F primer：5′-CTTTGTCATCGTGTACTACGCC-3′，R primer：5′-CGAGAGAGGCT-GGTAGGTG-3′；GLI1 F primer：5′-GAACCCTTGGAAGGTGATATGTC-3′，R primer：5′-GGCA-GTCAG-TTTCATACACAGAT-3′；GAPDH F primer：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，R primer：5′- AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′，引物由上海生工公司合成，GAPDH作為內(nèi)參。qPCR反應(yīng)體系包括：2×Real-time PCR Master Mix 10 μl，上游引物(20 μmol/L)0.1 μl，下游引物(20 μmol/L)0.1 μl，cDNA template 2 μl，rTaq DNA polymerase(5 U/μl)0.4 μl，加ddH2O至20 μl。反應(yīng)條件為95℃ 3 min，95℃ 30 s，62℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)方法 免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照說明書進(jìn)行。免疫組化結(jié)果采用半定量法進(jìn)行判定,根據(jù)染色密度(陰性=0、弱陽性=1、中度陽性=2、強(qiáng)陽性=3)和陽性細(xì)胞百分比(0=陰性、1=<25%、2=25%～50%、3=51%～75%、4=>75%)的乘積計(jì)算5個(gè)高倍視野的免疫反應(yīng)評(píng)分(Immuno-Reactive score,IRS)。最后結(jié)果:陰性(IRS:0)：-，弱陽性(IRS:1～4)：+，中度陽性(IRS:5～8)：++，強(qiáng)陽性(IRS:9～12)：+++。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)HIF-1α mRNA、SHH mRNA、PTCH1 mRNA、SMO mRNA、GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞和ALDH1-乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)量2-ΔΔCt行One-way ANOVA檢驗(yàn)，采用Pearson卡方檢驗(yàn)對(duì)HIF-1α、ALDH1在TNBC或non-TNBC組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析HIF-1α和ALDH1以及Hedgehog信號(hào)分子的相互關(guān)系，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和Hedgehog信號(hào)通路主要分子SHH、PTCH1、SMO、GLI1在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞和ALDH1-乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) HIF-1α mRNA、SMO mRNA和GLI1 mRNA在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)均明顯高于ALDH1-乳腺癌細(xì)胞，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而SHH mRNA和PTCH1 mRNA在兩種細(xì)胞中的表達(dá)未見顯著性差異(P均>0.05)，見圖1。

2.2 HIF-1α和ALDH1在TNBC組織中的表達(dá) HIF-1α抗體陽性著色部位在胞漿和胞核，ALDH1抗體陽性著色部位主要在胞漿(圖2)。在TNBC組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率為90.0%(27/30)，與non-TNBC的陽性表達(dá)率70.0%(21/30)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALDH1在TNBC組織的陽性表達(dá)率為93.3%(28/30)，亦與non-TNBC的陽性表達(dá)率66.7%(20/30)具有顯著性差異(P<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析提示在TNBC中HIF-1α和ALDH1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.53，P<0.01)，結(jié)果見表1。

2.3 HIF-1α和ALDH1的表達(dá)與TNBC臨床病理因素的關(guān)系 結(jié)果見表2，病理分期依據(jù)AJCC 標(biāo)準(zhǔn)[11]。HIF-1α在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC組織中表達(dá)明顯增高(P<0.05)，ALDH1的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，HIF-1α和ALDH1的表達(dá)均與TNM分期有關(guān)(P<0.05)。

2.4 HIF-1α和ALDH1與Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路分子的相互關(guān)系 本課題在前期研究中發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路在TNBC組織中處于活化狀態(tài)，SHH和SMO的表達(dá)與TNBC的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，GLI1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，SMO和GLI1的表達(dá)均與TNM分期相關(guān)[5]。本研究結(jié)果顯示在TNBC中HIF-1α的表達(dá)與SHH、SMO和GLI1均呈正相關(guān)(P均<0.05)，ALDH1的表達(dá)亦與SHH和GLI1正相關(guān)(P均<0.05)，見表3。

圖1 HIF-1α和Hedgehog信號(hào)通路主要分子在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞和ALDH1-乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules in ALDH1+ breast cancer stem cell and ALDH1- breast cancer cell Note: The expression of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules SHH,PTCH1,SMO and GLI1 in ALDH1+ breast cancer stem cell and ALDH1- breast cancer cell were examined by qRT-PCR.*.P<0.05,compared to ALDH1- breast cancer cell.

TypeTNBCnon-TNBCPHIF-1α8.60±2.379.47±3.66<0.05ALDH19.67±3.458.20±2.39<0.05

表2 HIF-1α和ALDH1與TNBC臨床病理因素的關(guān)系(n=30)

Tab.2 Association between HIF-1α and ALDH1 expressions and clinicopathological parameters of TNBC patients(n=30)

ClinicopathologicalparametersNo.ofcasesMedianexpressionofHIF-1αPMedianexpressionofALDH1PHistologicgrade>0.05<0.05Ⅰ82.25±0.712.33±0.50Ⅱ113.73±0.475.18±2.52Ⅲ113.91±1.044.82±1.60Lymphaticinvolvement<0.05>0.05N0123.18±0.873.83±1.40N1-2186.79±1.556.33±2.83pTNM<0.05<0.05Ⅰ73.86±1.953.86±1.95Ⅱa92.78±1.203.00±1.22Ⅱb63.00±1.552.33±0.82Ⅲa42.20±1.092.20±1.09Ⅳ42.20±1.094.00±0.00

表3 HIF-1α和ALDH1與Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路分子在TNBC中表達(dá)的相關(guān)性

Tab.3 Correlation of expressions between HIF-1α and ALDH1 and Hedgehog signaling molecules in TNBC

TypeSHHrPPTCH1rPSMORPGLI1RPHIF-1α0.584<0.01-0.033>0.050.467<0.010.439<0.05ALDH10.426<0.05-0.056>0.050.176>0.050.394<0.05

Note：rrepresents Spearman′s rank correlation coefficient.

圖2 HIF-1α和ALDH1在乳腺癌組織中的表達(dá)(SP,×200)Fig.2 Expression of HIF-1α and ALDH1 in breast cancer(SP,×200)Note: A.HIF-1α located in the cytoplasm and nucleus of breast cancer；B.ALDH1 located in the cytoplasm of breast cancer；C.Normal breast tissue.

3 討論

TNBC的高復(fù)發(fā)率、耐藥以及易發(fā)生遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移的特性與組織內(nèi)富含較多的CSC關(guān)系密切。當(dāng)前臨床放化療主要對(duì)快速增殖的腫瘤細(xì)胞有效，而處于慢周期的CSC往往逃避放化療的殺滅作用[12,13]，故目前臨床上對(duì)于TNBC尚無有效治療措施。TNBC組織中CSC的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，如何靶向抑制CSC的活化或消滅CSC成為目前TNBC治療的難題和關(guān)鍵。因此，了解TNBC的分子調(diào)控機(jī)制、找到靶向調(diào)控CSC的因子并應(yīng)用于臨床，將會(huì)有助于改善TNBC患者的預(yù)后。

HIF-1對(duì)環(huán)境中氧的含量變化非常敏感，是維持細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡的重要調(diào)控因子。HIF-1α是HIF-1活性亞單位，在正常氧壓情況下，HIF-1α可因前羥基化酶的羥基化而快速降解，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α的羥基化進(jìn)程停止，穩(wěn)定狀態(tài)的HIF-1α轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與結(jié)構(gòu)表達(dá)亞單位HIF-1β結(jié)合[14,15]，形成異質(zhì)二聚體再與靶基因啟動(dòng)子的缺氧應(yīng)答元件相結(jié)合，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。HIF-1α在缺氧的腫瘤組織里往往高表達(dá)，其介導(dǎo)多種基因的轉(zhuǎn)錄幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)不利的腫瘤微環(huán)境[17,18]。Lacerda等[19]發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤中HIF-1α沉默可減少腫瘤起始細(xì)胞的數(shù)量和活性、Conley等[20]報(bào)道經(jīng)過抗腫瘤治療后在乳腺腫瘤的缺氧區(qū)域可重新出現(xiàn)并富含CSC，Keith等[21]報(bào)道HIF-1α過表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后差有關(guān)。與這些報(bào)道類似，本研究發(fā)現(xiàn)在分選出的ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)明顯高于ALDH1-乳腺癌細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HIF-1α在TNBC組織中的表達(dá)亦明顯高于其在non-TNBC中的表達(dá)，HIF-1α的表達(dá)與TNBC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，這些結(jié)果提示HIF-1α在乳腺癌干細(xì)胞的活化以及TNBC的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

ALDH1在多發(fā)性骨髓瘤、急性髓性白血病、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等的干細(xì)胞中均有高表達(dá)，目前已成為CSC標(biāo)記物之一[22-24]。Ginestier等[25]發(fā)現(xiàn)ALDH1活性增加的乳腺癌患者的乳腺上皮細(xì)胞具有干/祖細(xì)胞特性，他們將ALDH1+乳腺癌細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠去除乳腺的脂肪墊內(nèi)，發(fā)現(xiàn)500個(gè)ALDH1+乳腺癌細(xì)胞就能形成腫瘤，而即使接種50 000個(gè)ALDH1-細(xì)胞也不會(huì)形成腫瘤，說明ALDH1+細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤能力。此外富含ALDH1的乳腺癌細(xì)胞擁有自我更新潛能、分化潛能以及無限增殖能力，可以重現(xiàn)親代腫瘤的雜合性，并與患者預(yù)后差密切相關(guān)[26,27]，提示ALDH1對(duì)于維持CSC的干性具有重要作用。Hedgehog信號(hào)通路由分泌型配體SHH、受體PTCH1以及下游信號(hào)分子SMO和GLI1等組成，原癌基因SMO和GLI1的高表達(dá)是目前公認(rèn)的Hedgehog信號(hào)通路激活的標(biāo)志之一。激活的Hedgehog信號(hào)通路可通過調(diào)控干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)及與其他相關(guān)信號(hào)通路和致癌因子相互作用從而維持CSC的增殖、自我更新并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示ALDH1在TNBC組織中的表達(dá)明顯高于其在non-TNBC中的表達(dá)，其表達(dá)與TNBC的組織學(xué)分級(jí)和TNM分期均相關(guān)，提示ALDH1的表達(dá)增強(qiáng)與TNBC的惡性進(jìn)展關(guān)系密切。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在分選出的ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路主要分子SMO和GLI1的表達(dá)明顯高于ALDH1-乳腺癌細(xì)胞，提示在ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路活化。在TNBC組織中ALDH1的表達(dá)與SHH和GLI1的表達(dá)相關(guān)、亦與HIF-1α的表達(dá)關(guān)系密切，而HIF-1α的表達(dá)與SHH、SMO和GLI1均呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果提示在TNBC組織中HIF-1α、ALDH1可能與Hedgehog信號(hào)通路相互作用協(xié)同促進(jìn)乳腺癌CSC的活化并參與TNBC的惡性進(jìn)展，但具體機(jī)制不清。因此，進(jìn)一步了解在TNBC組織中CSC活化的機(jī)理、阻斷HIF-1α、ALDH1和Hedgehog信號(hào)通路的相互作用對(duì)于抑制TNBC的惡性進(jìn)展、改善患者的預(yù)后可能具有重要的臨床病理意義。

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[收稿2016-04-18 修回2016-12-05]

(編輯 倪 鵬)

Research of HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling pathway cooperation involved in activation of cancer stem cell in triple negative breast cancer

HUANGLin,TENGMei-Jun,XUJing-Nan,ZHANGChun-Jie,ZHONGKe-Zhen,CHENGMing-Yang,TAOYa-Jun.

MedicalCollegeofDalianUniversity,Dalian116622,China

Objective:To explore the cooperation and clinical significance of HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling pathway in the activation of cancer stem cell(CSC) in triple negative breast cancer(TNBC).Methods: ALDH1+(Aldehyde dehydrogenase1)breast cancer stem cells and ALDH1-breast cancer cells were selected from MDA-MB-231 cells by magnetic activated cell sorting system(MACS),qRT-PCR method was employed to analyze the expression differences of HIF-1α and Hedgehog signaling molecules Sonic hedgehog(SHH),patched1(PTCH1),Smoothened(SMO) and Glioma-associated oncogene homoglog1(GLI1) in ALDH1+breast cancer stem cells and ALDH1-breast cancer cells.Immunohistochemical method was applied to study the expressions of HIF-1α and ALDH1 and the relationships among HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog signaling molecules in TNBC.Results: The expressions of HIF-1α mRNA,SMO mRNA and GLI1 mRNA in ALDH1+breast cancer stem cell were higher than those in ALDH1-breast cancer cell(Pall<0.05).The positive expression rates of HIF-1α were 90.0% and 70.0%,and the positive rates of ALDH1 were 93.3 % and 66.7 % in TNBC and non-TNBC,respectively(Pall<0.05).Spearman rank correlation analysis showed that the expression of HIF-1α was positively related with that of ALDH1 in TNBC(r=0.53,P<0.01).HIF-1α expression was correlated with lymph node metastasis and TNM stage(Pall<0.05),ALDH1 expression was correlated with histological grade and TNM stage(Pall<0.05).In addition,the expression of HIF-1α was positively related with that of Hedgehog signaling molecules SHH(r=0.584,P<0.01),SMO(r=0.467,P<0.01) and GLI1(r=0.439,P<0.05),the expression of ALDH1 was positively related with that of SHH(r=0.426,P<0.05) and GLI1(r=0.394,P<0.05).Conclusion: HIF-1α and Hedgehog signaling pathway were activated in ALDH1+breast cancer stem cell.HIF-1α,ALDH1 and Hedgehog molecules may cooperate with each other to activate breast CSC to promote the malignant progression of TNBC.

Triple negative breast cancer；Cancer stem cell；HIF-1α；ALDH1；Hedgehog signaling

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.013

黃 琳(1995年-)，女，主要從事乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的研究，E-mail:247403619@qq.com。

及指導(dǎo)教師：陶雅軍(1969年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤干細(xì)胞多向分化機(jī)制方面的研究，E-mail:sabrinatao@sina.com。

R737.9

A

1000-484X(2017)05-0697-06

①本文為遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No.201511258052)。