王高峰 張 強 張利娟

(黃河科技學院醫(yī)學院實驗中心，鄭州450063)

青藤堿抗肝癌作用機制研究

王高峰 張 強 張利娟

(黃河科技學院醫(yī)學院實驗中心，鄭州450063)

目的：探討青藤堿對HepG2人肝癌細胞株的增生和轉移能力的多靶向作用機制。方法：運用噻唑藍還原法(MTT)來檢測青藤堿對HepG2人肝癌細胞株的抗增殖作用，而同時運用Transwell 法來檢測藥物對于細胞轉移能力的作用變化；間接熒光標記法測定經過不同濃度的青藤堿作用后，細胞內活性氧水平的變化；利用酶抑制動力學方法，研究青藤堿對逆轉錄酶的抑制作用；再通過逆轉錄聚合酶鏈式反應和蛋白質印跡的實驗來檢測HepG2細胞中凋亡蛋白水平的變化。結果：青藤堿對HepG2人肝癌細胞株具有抗侵襲及轉移的治療作用。MTT檢測結果顯示青藤堿對于HepG2人肝癌細胞抗增殖作用明顯，半抑制濃度IC50為(15.35±2.43)μmol/L；而Transwell法的結果顯示青藤堿對癌細胞有較好的抗轉移能力；青藤堿是一種有效的逆轉錄酶抑制劑，IC50為(21.32±2.43)μmol/L；熒光標記法檢測細胞內活性氧水平隨青藤堿呈濃度依賴性升高；蛋白水平測定顯示青藤堿上調HepG2人肝癌細胞CASP3、CASP9、CAV1和下調SOX2的表達。 結論：青藤堿可能是通過上調CASP3、CASP9、CAV1和下調SOX2的表達，進而抑制人肝癌細胞的增殖和轉移，調節(jié)相關信號通路，最終在分子水平證明青藤堿對HepG2人肝癌細胞的抑制作用。

青藤堿；HepG2人肝癌細胞；活性氧水平；逆轉錄酶；CASP3；CASP9；CAV1；SOX2

青藤堿(Sinomenine)是從防已科植物青藤的根莖中提取出來的一種生物堿單體，結構類似嗎啡，其藥用形式多為鹽酸鹽。目前已有多篇文獻報道青藤堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制、心腦血管保護等藥理作用，臨床已有相關制劑用于治療風濕性關節(jié)炎、心律失常等[1]。近年來，隨著對青藤堿研究的深入，發(fā)現了一些新的藥理作用及機制，尤其是抗腫瘤方面的作用愈來愈受到國內外學者的重視[2,3]。

傳統意義上的化療對肝癌的治療，雖然取得了一定的療效，但存在較大的毒副作用，特別是其潛在引起了腫瘤細胞的耐藥性以及引發(fā)腫瘤細胞的擴散與轉移[4]。因此尋找一種新型的毒副作用小，且能夠防止肝癌細胞轉移的藥物，是一項重要的研究課題。本研究重點在于探討青藤堿對于人肝癌細胞的增生和轉移能力的抑制作用。選用HepG2人肝癌細胞株，檢測青藤堿對人肝癌細胞株生長的抑制率以及抑制細胞的侵襲和轉移能力的效果。再通過mRNA的分子水平來檢測青藤堿對于凋亡相關基因以及轉移侵襲相關基因的表達影響。本實驗為肝癌的治療提供了一種潛在的新藥物即青藤堿，并且在細胞體外，以及分子水平檢測其治療效果，為后續(xù)的臨床工作提供了可靠的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 青藤堿購買自美國Sigma公司，純度大于98%，該凍干粉末已經通過HPLC與質譜檢測(圖1)。

1.1.2 細胞 HepG2人肝癌細胞株購自ATCC(中國科學院典型培養(yǎng)物種保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)，在本實驗室進行培養(yǎng)。將細胞置于恒溫37℃、5%CO2以及恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長到鋪單層達80%，使用0.25%胰蛋白酶(美國，Gibco)消化傳代至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)以備后續(xù)實驗所需。

1.1.3 試劑 MTT試劑盒(美國Biosharp公司)；Transwell(孔徑為8.0 μm)小室濾膜(美國Corning公司)；細胞外基質膠(美國，BD Bioscience)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉(美國Sigma公司)；過硫酸銨(上海阿拉丁試劑公司)；TritonX-100(上海時代生物科技有限公司)；2-巰基乙醇(上海阿拉丁試劑公司)；Tris base(國藥集團化學試劑有限公司)；RNA Mini試劑盒(美國 PureLink 公司)；一步法RT-qPCR System試劑盒(美國Qiagen公司)；β-actin鼠抗人單克隆抗體、CASP3、CASP9、CAV1；SOX2鼠抗人多克隆抗體；HRP標記羊抗兔的多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(美國Biorad公司)等。

1.1.4 儀器 pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；NUAIR-NU-5510E細胞培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)；酶標儀(美國PE公司)；微量加樣器(法國Gilson公司)；RealPlex2 Thermal Cycler器 (美國Eppendorf公司)； 高壓電泳儀、VⅡ型垂直板電泳槽高壓電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；GWA-UN2超純水儀(北京普析通用儀器有限責任公司)等。

圖1 青藤堿的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of sinomenine

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗測定細胞增殖[5]將細胞增殖處于對數生長期的HepG2人肝癌細胞，使用胰蛋白酶消化后，培養(yǎng)基清洗獲得細胞懸浮液，接種于96孔培養(yǎng)板中。設空白對照組和青藤堿組。每組設4個重復實驗孔。進行4次重復實驗，在合適條件下進行24 h細胞培養(yǎng)，根據MTT試劑盒說明書以及酶標儀檢測獲得每孔OD值數據，計算細胞的生長抑制率，細胞生長抑制率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2 Transwell 實驗測定細胞侵襲與轉移能力 準備Transwell小室的濾膜內表面涂細胞外基質膠(50 μg/室)。小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基水化(在進行細胞轉移能力實驗時無需進行外基質膠的涂層和水化)。在Transwell小室的下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基，而在上室中加入0.1%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 的重懸浮細胞(濃度為4.0 × 105ml-1)，每孔中加入100 μl細胞懸浮液。常規(guī)細胞培養(yǎng)16 h。取出小室后，使用PBS溶液沖洗濾膜，使用PBS棉棒吸除和擦除上室的細胞，再根據Transwell小室使用說明進行染色觀察并計算穿膜的細胞數，從而反映各組細胞的侵襲和轉移能力。實驗進行4次重復實驗。

1.2.3 流式細胞儀檢測HepG2細胞內ROS[6]將對數生長期HepG2細胞以1×105/孔接種于96孔板中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的青藤堿培養(yǎng)基，同時設空白對照，每個藥物4個平行孔。培養(yǎng)48 h后，收集細胞用PBS重新懸浮細胞，首先加入5 μl的FITC-Annexin V避光染色5 min，然后再加入10 μl的PI，在室溫下避光孵育15 min。取樣后，加入到流式細胞儀，進行熒光強度檢測。

1.2.4 HepG2細胞逆轉錄酶活性檢測 參照張晨等[7]方法，對HepG2細胞中的逆轉錄酶進行提取，將青藤堿100 μl加入到96 孔培養(yǎng)板中，并加入20 μl含逆轉錄酶的PBS溶液、70 μl的 RT Buffer，在37℃水浴1 h后，用洗液清洗3次，除去未結合的游離底物，再向每孔中加入100 μl BSA(1%)溶液，在室溫下進行30 min的封閉，之后洗板，并再向每孔中加入50 μl的SA-ALP稀釋液，在37℃水浴 1 h后洗板，最后向每孔中加入底物 PNPP(1 mg/ml)50 μl。在405 nm波長下，利用酶標儀測OD值，計算酶的抑制率，抑制率=(空白對照孔OD值-實驗孔OD值)/空白對照孔OD值×100%。

1.2.5 Westren blot實驗 首先將對數生長期的細胞加入到陽性組、空白對照組和青藤堿組培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2飽和濕度的環(huán)境下孵化24 h后棄培養(yǎng)基，加入1×SDS樣品緩沖液，在冰上刮落細胞，并轉移到Ep管中，煮沸樣品5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液；應用RIPA裂解液裂解細胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15 min，14 000 r/min離心15 min(4℃)，棄沉淀，用Bradford法或其他蛋白質測定方法測定上清中蛋白濃度以調整上樣體積和上樣量，以12%SD-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電泳完畢后將膠浸于轉移緩沖液中平衡10 min，三明治用海綿3層濾紙膠膜裝配，每層放好后，用試管趕去氣泡，將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，加入轉移緩沖液，插上電極，100 V，1 h，轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。之后用25 ml TBS洗膜5 min，置于25 ml封閉緩沖液1 h，加入合適稀釋度的一抗[大鼠抗人GAPDH(1∶1 000)，CASP3(1∶1 000)，CASP9(1∶1 000)，Caveolin-1(1∶1 000)和SOX2(1∶1 000)多克隆抗體]，室溫孵化2 h，緩慢搖動，TBS洗3次，加入堿性磷酸酶，室溫孵育1 h，TBS洗3次，一抗孵育NC膜， 4℃過夜；緩慢搖動，TBS洗3次,加入堿性磷酸酶，室溫孵育1 h，TBS洗3次;一抗結合后洗脫，再進行二抗孵育[HRP標記兔抗大鼠的多克隆抗體(1∶10 000)]，以管家基因Bactin編碼蛋白水平作為內對照；定量測定參照定量ELISA試劑盒說明，酶標儀進行定量檢測。

2 結果

2.1 青藤堿抑制HepG2細胞體外增殖 青藤堿(0～150 μmol/L)作用HepG2細胞后，隨著青藤堿濃度的增加，青藤堿對肝癌HepG2細胞的生長抑制率在不斷地增強，并且隨著時間的增加，細胞的生長抑制率也在不斷地增強，分別計算24、48和72 h 青藤堿對肝癌HepG2細胞生長的半抑制濃度IC50為(118.76±7.65)、(75.65±5.43)和(52.54±2.76)μmol/L，詳見圖2。

2.2 青藤堿對HepG2細胞內ROS的影響 圖3顯示，利用流式細胞免疫熒光術檢測細胞內活性氧水平，結果如表1所示，經過不同濃度青藤堿作用HepG2細胞48 h后，細胞內活性氧水平隨著青藤堿呈濃度依賴性升高，與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 青藤堿抑制HepG2細胞體外侵襲和轉移 經過Transwell小室法發(fā)現隨著青藤堿濃度的增加，處理后的人肝癌HepG2細胞的侵襲和轉移能力呈現顯著降低的趨勢。不同濃度青藤堿組與空白對照組(生理鹽水空白組)比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 青藤堿對人肝癌HepG2細胞逆轉錄酶活性的抑制作用 圖4顯示了青藤堿對人肝癌HepG2細胞逆轉錄酶的抑制作用，隨著青藤堿濃度的增加，逆轉錄酶的活性呈不斷下降的趨勢，直到青藤堿的濃度達到150 μmol/L后，逆轉錄酶的相對活性趨于平緩；解析IC50為(42.16±4.21)μmol/L，顯示出青藤堿對人肝癌HepG2細胞逆轉錄酶有良好的抑制效果。

圖2 青藤堿對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of sinomenine on growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

圖3 青藤堿誘導HepG2細胞ROS的產生Fig.3 Sinomenine induced HepG2 cells ROS

GroupsDose(μmol/L)Averagefluorescenceintensity(%)Controlgroup-1.12±0.17Sinomeninegroup106.67±0.511)2514.65±1.482)5027.59±2.662)7542.65±4.142)15065.34±5.762)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(μmol/L)Invasionexperiment(Numberoftransme-mbranecells,×103)Transferexperiment(Numberoftransme-mbranecells,×103)Controlgroup-25.17±2.3238.43±3.43Sinomeninegroup1017.54±1.761)29.17±1.891)2510.56±0.871)22.67±1.221)504.23±0.542)15.76±0.982)751.57±0.132)10.98±0.562)1500.73±0.062)7.54±0.482)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(μmol/L)Content(%)CASP3CASP9CAV1SOX2Controlgroup-1.02±0.041.01±0.051.04±0.050.99±0.07Sinomeninegroup101.43±0.171)1.26±0.141)1.22±0.121)0.91±0.041)251.76±0.211)1.45±0.151)1.32±0.191)0.84±0.031)502.02±0.251)1.76±0.211)1.46±0.151)0.75±0.041)752.35±0.271)1.94±0.331)1.61±0.161)0.62±0.071)1502.88±0.312)2.51±0.352)1.77±0.231)0.52±0.032)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

圖4 青藤堿對肝癌HepG2細胞逆轉錄酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of sinomenine on reverse transcriptase of hepatocellular carcinoma cells HepG2

2.5 青藤堿在蛋白水平對CASP3、CASP9、CAV1和SOX2的表達影響 使用Western blot檢測青藤堿組和空白對照組CASP3、CASP9、CAV1和SOX2基因的蛋白表達水平(各組數據與內參GAPDH的比值)。結果顯示青藤堿組中CASP3、CASP9和CAV1的蛋白表達量明顯高于空白對照組的相應蛋白表達量(P<0.05)，而對于SOX2蛋白的表達，青藤堿組的蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

肝癌具有高復發(fā)率、高轉移率且極容易產生對藥物的耐藥性，其常規(guī)治療方法包括化學藥物治療與放射治療結合，而化療藥物副作用極大，對于患者的免疫系統造成很大的損傷，特別是對脊髓的造血功能抑制，且易使癌細胞形成耐藥性。所以迫切需要尋找一種更為長期有效以及副作用較小的藥物，作為新藥開發(fā)的方向。最近幾年在中外各國對于腫瘤學的基礎研究中，證實了青藤堿對多種腫瘤癌細胞具有顯著的體外與體內治療作用，其中不僅包括了對腫瘤的細胞增長抑制，誘導凋亡以及對腫瘤的血管生長抑制和腫瘤的轉移，多方面的功效研究證明了青藤堿的廣譜抗腫瘤效果[2,3,8-10]。

本實驗在機理研究的過程中，體現了青藤堿的多靶點作用優(yōu)勢，本實驗運用MTT法檢測了青藤堿對人肝癌HepG2細胞的生長抑制作用，且存在濃度和時間依賴性；為其藥效的持續(xù)作用提供了基礎。ROS是由細胞內氧代謝過程中產生的具有很高生物活性的氧分子[11]。這些氧分子主要由超羥自由基(·OH)、氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(O2)等氧自由基組成[12]。在機體內，這些氧分子能夠與自身的消化達到一種動態(tài)平衡，這種動態(tài)平衡一旦被打破，ROS則促進細胞的快速凋亡[13,14]；多項研究表明CASP3與CASP9在腫瘤的凋亡通路中起到開關作用[15-17]，而CAV1及SOX2則在人肝癌細胞的轉移過程中占重要地位[18]。細胞凋亡相關蛋白CASP3、CASP9的上調，表明了青藤堿體外抑制人肝癌HepG2細胞的增殖是通過引發(fā)細胞凋亡而引起。蛋白CAV1的上調和SOX2的下調則表明了青藤堿能夠在體外抑制人肝癌HepG2細胞的侵襲與轉移的過程[19]。通過以上分子學水平的檢測，青藤堿可能是通過上調CASP3、CASP9、CAV1和下調SOX2的表達，進而抑制人卵巢癌細胞的增殖和轉移。從而調節(jié)相關信號通路，最終在分子水平證明青藤堿對HepG2人肝癌細胞的抑制作用。

眾所周知，逆轉錄酶催化的反應也叫反轉錄(Reverse transcription)。在這個過程中，肝癌HepG2細胞的逆轉錄酶可以催化逆轉錄過程的發(fā)生，即催化脫氧核糖核苷酸以RNA為模板合成DNA，之后形成一代又一代的DNA，之后人肝癌HepG2細胞雙鏈DNA進行環(huán)化，最終完成人肝癌HepG2細胞中DNA的復制[7]，所以基于逆轉錄酶的作用機制，我們以逆轉錄酶為作用靶點，進行抗肝癌藥物研發(fā)具有重要意義。本文研究發(fā)現，青藤堿對人肝癌HepG2細胞的逆轉錄酶活性有一定的抑制作用，這意味著青藤堿可能通過阻斷肝癌HepG2細胞中DNA的復制，達到抑制HepG2細胞生長的目的，為青藤堿的多靶點性抗肝癌活性提供了理論基礎，也為青藤堿應用于臨床肝癌治療提供了基礎的實驗數據，其將作為一種新型抗肝癌的化療藥物被進一步論證和研究。

[1] 路占忠, 李振彬, 馬 旭, 等. 采用正交t值法優(yōu)選治療急性痛風性關節(jié)炎的中藥有效成分復方配伍[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2016,28(11):33-36.

[2] Lv Y，Li C，Li S，etal.Sinomenine inhibits proliferation of SGC-7901 gastric adenocarcinoma cells via suppression of cyclooxygen-ase-2 expression[J].Oncol Lett,2011,2(4):741-745.

[3] Liao F,Yang Z,Lu X,etal.Sinomenine sensitizes gastric cancer cells to 5-fluorouracil in vitro and in vivo[J].Oncol Lett,2013,6(6):1604-1610.

[4] 劉永存,伍麗萍.STK Ⅱ在肝癌組織中的表達水平分析及臨床意義[J].空軍醫(yī)學雜志,2016,32(5):319-322.

[5] Fabrizio A,Alice F.Liposomes and MTT cell viability assay:An incompatible affair[J].Toxicol Vitro,2015,29(2):314-319.

[6] 劉 欣,索智敏.苦參抗乙肝病毒的作用機制研究[J].中國生化藥物雜志,2015,35(4):67-69.

[7] 張 晨.大黃酸聯合賀普丁對乙肝病毒逆轉錄酶影響[J] 中國公共衛(wèi)生,2015,31(6):781-783.

[8] Lu XL,Zeng J,Chen YL,etal.Sinomenine hydrochloride inhibits human hepatocellular carcinoma cell growth in vitro and in vivo:involvement of cell cycle arrest and apoptosis induction[J].Int J Oncol,2013,42(1):229-238.

[9] Jiang T,Zhou L,Zhang W,etal.Effects of sinomenine on proliferation and apoptosis in human lung cancer cell line NCI-H460 in vitro[J].Mol Med Rep,2010,3(1):51-56.

[10] Hong Y,Yang J,Shen X,etal.Sinomenine hydrochloride enhancement of the inhibitory effects of anti-transferrin receptor antibody-dependent on the COX-2 pathway in human hepatoma cells[J].Cancer Immunol Immunother,2013,62(3):447-454.

[11] 劉 儀,王 凱,王介非.氧化應激誘導細胞凋亡的機制[J].中華臨床感染病雜志,2008,1(3):123-126.

[12] Shoeb M,Khan JA,Khan W,etal.ROS-dependent anticandidal activity of zinc oxide nanoparticles synthesized by using egg albumen as a biotemplate[J].ANSN,2013,4(3):35015-35026.

[13] Sepúlveda M,Gonano LA,Back TG,etal.Role of CaMKII and ROS in rapid pacing-induced apoptosis[J].J Mol Cell Card,2013,63(1):135-145.

[14] Pan X,Zhang X,Sun H,etal.Autophagy inhibition promotes 5-fluorouraci-induced apoptosis by stimulating ROS formation in human non-small cell lung cancer A549 cells[J].PLoS One,2013,8(2):55674-56679.

[15] Kuo CT，Hsu MJ，Chen BC，etal.Denbinobin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells via Akt inactivation,Bad activation,and mitochondrial dysfunction[J].Toxicol Lett,2008,177(1):48-58

[16] Yang KC，Uen YH，Suk FM，etal.Molecular mechanisms of denbinobin-induced anti-tumorigenesis effect in colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2005,11(20):3040-3045.

[17] Song JI，Kang YJ，Yong HY，etal.Denbinobin，a phenanthrene from dendrobium nobile,inhibits invasion and induces apoptosis in SNU-484 human gastric cancer cells[J].Oncol Rep,2012,27(3):813-818.

[18] 胡 軍,邵淑娟,董 巖,等.Caveolin-1與人卵巢癌轉移的相關性及其機制的研究[J].解剖科學進展，2010,16(4):311-316.

[19] Belotte J,Fletcher NM,Alexis M,etal.Sox2 gene amplification significantly impacts overall survival in serous epithelial ovarian cancer[J].Reprod Sci,2015,22(1):38-46.

[收稿2016-09-28 修回2016-12-13]

(編輯 倪 鵬)

Study on anti-tumor mechanism of sinomenine

WANGGao-Feng,ZHANGQiang,ZHANGLi-Juan.

ExperimentalCenterofMedicalCollege,HuangheUniversityofScienceandTechnology,Zhengzhou450063,China

Objective:To investigate the anti-proliferation and anti-metastasis effects and study the molecular mechanism of sinomenine in cell line(HepG2).Methods: HepG2 cells were cultured together with different treatment concentrations of sinomen-ine.The effect of sinomenine on inhibition of growth of HepG2 cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay.The effect of sinomenine on inhibiting metastasis of HepG2 cells were determined by Transwell assay.The inhibitory effect of sinomenine on reverse transcriptase(RT) was studied using inhibitory kinetic method,on the basis,the reactive oxygen species(ROS) of HepG2 cells was monitored by indirect fluorescent labeling.The protein expressions of CASP3,CASP9,CAV1 and SOX2 were analyzed by Western blot experiment.Results: Sinomenine inhibited the proliferation and metastasis of HepG2 cells significantly.Sinomenine had a good inhibitory effect on the growth of HepG2 cells,half inhibitory concentration(IC50) was (15.35±2.43)μmol/L.Sinomenine was RT inhibitor，IC50 was (21.32±2.43)μmol/L.The Western blot showed that CASP3,CASP9 and CAV1 were up-regulated and SOX2 was down-regulated by the sinomenine treatment in HepG2 cells.Conclusion: The potential molecular mechanism of sinomenine suppresses proliferation and metastasis of HepG2 cells by up-regulation of CASP3,CASP9,CAV1 and down-regulation of SOX2.

Sinomenine;HepG2 cells;Reactive oxygen species;Reverse transcriptase；CASP3;CASP9;CAV1;SOX2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.011

王高峰(1975年-)，女，碩士，實驗師，主要從事藥學藥劑學方面研究。

R453.9

A

1000-484X(2017)05-0688-05