胥 青 陳靈修 周向東

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

蛋白酪氨酸激酶6對TNF-α誘導(dǎo)的人氣道上皮屏障功能減損的影響①

胥 青 陳靈修 周向東

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

目的：探討蛋白酪氨酸激酶6(PTK6)對TNF-α誘導(dǎo)的人氣道上皮屏障功能減損的影響及相關(guān)機制。方法：體外培養(yǎng)人氣道上皮16HBE細胞，予TNF-α刺激，分別轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA和recombined PTK6，以轉(zhuǎn)染Scramble siRNA和Empty vector為對照。四甲基偶氮唑鹽法(MTT) 檢測細胞活性；跨皮細胞組抗儀檢測細胞跨皮細胞阻抗(TER)；辣根過氧化物酶(HRP)流量法反應(yīng)細胞通透性；RT-PCR檢測ZO-1、Occludin mRNA水平；Western blot檢測PTK6、ZO-1、Occludin、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基端激酶1/2(p-JNK1/2)和磷酸化p38(p-p38)蛋白水平。結(jié)果：TNF-α刺激后，細胞ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄及蛋白水平、TER值顯著降低，細胞通透性增高，同時PTK6、p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38蛋白水平顯著增高(P<0.05)；上調(diào)PTK6使ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄及蛋白水平和TER值進一步降低，細胞通透性和p-JNK1/2、p-p38蛋白水平也進一步增高(P<0.05)，但下調(diào)PTK6后上述指標呈相反變化(P<0.05)；上調(diào)或下調(diào)PTK6對p-ERK1/2無明顯影響。結(jié)論：下調(diào)PTK6可以降低JNK1/2、p38MAPK磷酸化水平，進而改善TNF-α誘導(dǎo)的氣道上皮屏障功能減損。

蛋白酪氨酸激酶6；腫瘤壞死因子-α；氣道上皮屏障；c-Jun氨基端激酶1/2；p38MAPK

完整的氣道上皮結(jié)構(gòu)和正常的氣道上皮物理性屏障作用是呼吸器官對抗有害刺激的第一道防線。氣道上皮功能減損是許多慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征之一[1]。因此，保護氣道完整性是控制氣道炎癥進一步發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。緊密連接(Tight junction,TJ)環(huán)繞在上皮和內(nèi)皮細胞頂端的側(cè)膜上，是最主要的細胞頂側(cè)連接[2]。TJ蛋白主要由Occludin、Claudin等膜相關(guān)蛋白和ZO家族閉小環(huán)蛋白組成。Occludin是TJ蛋白中第一個被發(fā)現(xiàn)的膜蛋白，是較為可靠的 TJ 蛋白復(fù)合體的標記。ZO家族主要包括ZO-1、ZO-2和ZO-3亞型。細菌產(chǎn)物、細胞因子、前炎性物質(zhì)等可以通過降低TJ蛋白的轉(zhuǎn)錄水平和(或)蛋白含量引起上皮功能的破壞[3]。

蛋白酪氨酸激酶6(Protein tyrosine kinase,PTK6)，也稱作乳腺腫瘤激酶(Breast tumor kinase,Brk)，是一種胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶，最初是從人表皮黑色素細胞和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中克隆出[4]。它在皮膚、口腔、胃腸道及肺組織等中均有不同程度的表達。目前，關(guān)于PTK6參與腸上皮屏障和血管內(nèi)皮屏障功能調(diào)節(jié)的研究已有報道[5,6]。然而，對于PTK6是否參與呼吸道上皮屏障功能的調(diào)節(jié)尚不清楚。在本研究中，我們以TNF-α為刺激因素，建立了人氣道上皮屏障功能減損模型，探討PTK6在TNF-α誘導(dǎo)的人氣道上皮屏障功能紊亂過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人氣道上皮16HBE細胞株由本實驗室保存；胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)，RIPA裂解液,1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；TNF-α購自Sigma公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；recombined PTK6和PTK6 siRNA購自Clontech公司。所有一抗均購自Abcam公司；二抗均購自中杉金橋公司；RNA抽提試劑盒及RT-PCR試劑盒購自大連寶生公司；所有引物由上海生工公司合成；其余產(chǎn)品均為國產(chǎn)試劑。

1.2 主要方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將16HBE細胞常規(guī)復(fù)蘇后，以RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、25 mmol/L HEPES、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37℃、5% CO2濕度培養(yǎng)箱孵育。待細胞匯合達 80%時傳代培養(yǎng)，并隨時觀察細胞形態(tài)。當細胞匯合率達到約80%時，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染。以倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染后的細胞按照上述條件繼續(xù)孵育然后參與實驗分組。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 于6 孔板內(nèi)培養(yǎng)16HBE細胞，進行常規(guī)培養(yǎng)換液，待細胞匯合至 80% 時傳代，將細胞分為6組，每組5個復(fù)孔，實驗重復(fù)5次：①對照組：單純16HBE細胞，不給予任何刺激；②TNF-α組：予以100 ng/ml的外源性TNF-α；③TNF-α+PTK6 siRNA組：轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA的16HBE細胞，加入同樣濃度的TNF-α共同孵育；④TNF-α+ Scramble siRNA組：轉(zhuǎn)染Scramble siRNA的16HBE細胞，與TNF-α共同孵育；⑤TNF-α+ Recombined PTK6組：轉(zhuǎn)染重組PTK6后加入TNF-α共同孵育；⑥TNF-α+Empty vector組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后加入TNF-α共同孵育。培養(yǎng)24 h 后，分別收集培養(yǎng)細胞及上清液，每組實驗重復(fù)5次。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽法(MTT) 檢測細胞活性 參照文獻[2]。

1.2.4 跨上皮細胞阻抗儀檢測細胞TER 將生長狀態(tài)良好的 16HBE 細胞種植入 Transwell 小室，放于 24 孔板中培養(yǎng)。待 16HBE 細胞長至融合，按分組給予不同處理后進行檢測。TER檢測運用微孔電阻系統(tǒng)在 37℃下檢測，所得的 TER 值與 Transwell 小室表面積相乘，結(jié)果用 Ω·cm2表示。

1.2.5 辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase，HRP)流量法檢測細胞通透性 HRP 流量檢測時，將各組 Transwell 中的 16HBE 細胞轉(zhuǎn)移至一個新的 24 孔板中。將含有 0.5 μmol/L HRP 的無血清 RPMI1640 培養(yǎng)液加入Transwell 小室的上室中。收集下室的培養(yǎng)液，通過比色法測量樣品中的 HRP 含量。HRP 流通量用pmol/cm2表示。

1.2.6 RT-PCR法檢測ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄水平 按照RT-PCR試劑盒說明，兩步法行RT-PCR。ZO-1的PCR引物：上游5′-GCCAGAGAAAAGTTGGCAAG-3′，下游 5′-TTGGATACCACTGCGCATAA-3′。Occlu-din的PCR引物：上游5′-CCTCCAATGGCA-AAGTGAAT-3′，下游5′-CTCCCCACCTGTCGTGTA-GT-3′。GAPDH的PCR引物：上游5′-GATCATCAGCAATGCCTCCT-3′，下游5′-TTCAGCTCAGGGATG-ACCTT-3′。PCR完成后，取產(chǎn)物2 μl經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠顯色。電泳結(jié)果經(jīng)Bandleader軟件行吸光度面積積分分析，以GAPDH mRNA作為內(nèi)參照，兩者的比值作為相對含量。

1.2.7 Western blot法檢測相關(guān)蛋白含量 將培養(yǎng)的細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次后，取下貼壁細胞，離心后棄上清后加入裂解液及PMSF進行處理，4℃ 12 000 r/min離心15 min，提取各組蛋白，測定并調(diào)整蛋白濃度。配制濃縮膠和分離膠，取上樣量經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉液封閉，以TBST漂洗1次。加鼠抗PTK6 4℃ 過夜，洗膜后加入二抗，在室溫下1 h。徹底洗滌條帶后顯色。采用掃描軟件Quantity One 4.0進行分析，以目的條帶與β-actin條帶光密度的比值表示目的蛋白相對表達量。同法檢測ZO-1、Occludin、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2的表達。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖的變化 各處理因素對細胞的增殖活力無明顯影響(表1)。

2.2 各組細胞TER值和通透性的變化 TNF-α刺激可以顯著降低細胞TER值，使細胞通透性明顯增高(P<0.05)；轉(zhuǎn)染重組PTK6后細胞TER值進一步降低，同時細胞通透性也進一步增高(P<0.05)；然而轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA后再予TNF-α刺激，其TER值較單純TNF-α刺激呈明顯升高趨勢，細胞通透性也顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.3 PTK6的表達 通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，PTK6表達在TNF-α刺激后明顯增加(P<0.05)；在轉(zhuǎn)染重組PTK6后細胞PTK6的表達進一步增高(P<0.05)；但細胞于轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA后再予TNF-α孵育，PTK6表達顯著降低(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

2.4 轉(zhuǎn)染Recombined PTK6和PTK6 siRNA對ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的影響 實驗表明，在予以TNF-α 刺激后ZO-1和Occludin mRNA水

圖1 TNF-α及轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA和recombined PTK6對細胞TER值和細胞通透性的影響Fig.1 Effects of TNF-α,PTK6 siRNA and recombined PTK6 on TER and permeabilityNote: A.TER values;B.HRP flow values.a.Control;b.TNF-α;c.TNF-α+PTK6 siRNA;d.TNF-α+Scramble siRNA;e.TNF-α+ Recombined PTK6;f.TNF-α+Empty vetor.*.P<0.05,compared with control group;#.P<0.05,compared with TNF-α group.

平均明顯降低(P<0.05)；上調(diào)PTK6表達后，二者下降的更為明顯(P<0.05)；然而下調(diào)PTK6后，ZO-1和Occludin mRNA水平卻較單純TNF-α刺激時均有顯著提高(P<0.05)。ZO-1、Occludin蛋白水平在各組的表達均呈同樣的趨勢(P<0.05，圖2、3)。

圖2 Western blot 檢測各項蛋白的表達Fig.2 Expression of each protein detected by Western blotNote: a.Control;b.TNF-α;c.TNF-α+PTK6 siRNA;d.TNF-α+Scramble siRNA;e.TNF-α+ Recombined PTK6 ;f.TNF-α+Empty vetor.

圖3 各組細胞ZO-1和Occludin mRNA的表達Fig.3 Expression of ZO-1 and Occludin mRNA in each groupNote: a.Control;b.TNF-α;c.TNF-α+PTK6 siRNA;d.TNF-α+Scramble siRNA;e.TNF-α+ Recombined PTK6 ;f.TNF-α+Empty vetor.*.P<0.05,compared with control group;#.P<0.05,compared with TNF-α group.

Groups6h12h18h24hControl0.189±0.0040.301±0.0090.523±0.0060.754±0.007TNF-α0.187±0.0030.308±0.1000.521±0.0030.755±0.004TNF-α+PTK6siRNA0.184±0.0010.300±0.0080.523±0.0040.752±0.004TNF-α+ScramblesiRNA0.185±0.0050.299±0.0010.524±0.0020.751±0.001TNF-α+RecombinedPTK60.182±0.0020.305±0.0050.521±0.0050.753±0.003TNF-α+Emptyvector0.186±0.0030.307±0.0020.523±0.0060.754±0.002

2.5 轉(zhuǎn)染Recombined PTK6和PTK6 siRNA對p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白水平的影響 實驗表明，p-p38、p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白水平在TNF-α作用后均明顯增高(P<0.05)；上調(diào)PTK6表達可以使p-p38和p-JNK1/2蛋白水平進一步增高(P<0.05)；下調(diào)PTK6可以使p-p38和p-JNK1/2蛋白水平較單純TNF-α作用時顯著降低(P<0.05)；但上調(diào)或下調(diào)PTK6對p-ERK1/2蛋白水平無顯著影響(圖3)。

3 討論

氣道上皮屏障功能減損是許多慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征之一。緊密連接又稱封閉小帶，是維系上皮物理屏障功能以及上皮細胞極性的分子基礎(chǔ)[7]。許多研究證實，病原微生物及其代謝產(chǎn)物、理化因素、細胞因子等作用于上皮細胞或內(nèi)皮細胞，可以引起TJ蛋白量的改變，進而引起氣道上皮屏障的破壞。PTK6在結(jié)構(gòu)上與Src酪氨酸激酶家族高度類似，包括SH2域、SH3域和酪氨酸激酶域，PTK6僅缺乏Src蛋白錨定于細胞膜所必需的N端豆蔻?；蛄衃8,9]。研究表明，TNF-α在引起腸上皮屏障和血管內(nèi)皮屏障功能破壞的同時，還可以使PTK6的表達增加[5,6]。

在本研究中，我們證實了TNF-α刺激人正常氣道上皮可以降低ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，使得細胞TER值降低、細胞通透性增高。同時，我們也發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后，人氣道上皮PTK6表達顯著增加。為了進一步研究PTK6在調(diào)節(jié)氣道上皮屏障功能中的作用，我們分別轉(zhuǎn)染了PTK6 siRNA和Recombined PTK6再予以TNF-α刺激，同時轉(zhuǎn)染了Scramble siRNA和Empty vetor作為對照。實驗表明，過表達PTK6會使氣道上皮屏障功能進一步被破壞，細胞ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄和蛋白水平以及TER值均較單純TNF-α刺激時顯著降低，同時細胞通透性也進一步增高。然而，當我們轉(zhuǎn)染PTK6 siRNA下調(diào)PTK6的表達后，ZO-1、Occludin轉(zhuǎn)錄和蛋白水平以及TER值較單純TNF-α刺激時有明顯增高，同時細胞通透性顯著降低。上述實驗結(jié)果表明，上調(diào)PTK6可以改善TNF-α誘導(dǎo)的人氣道上皮屏障功能的破壞。我們對其機制進行了探討。

Haines等[6]的研究表明，在腸上皮下調(diào)PTK6的表達可以抑制JNK的激活。我們猜測PTK6在氣道上皮可以影響MAPK的激活。我們通過Western blot檢測了細胞內(nèi)ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平。實驗發(fā)現(xiàn)，它們在TNF-α刺激后顯著增高；當PTK6表達上調(diào)時，p-JNK1/2和p-p38 MAPK表達進一步增高；但下調(diào)PTK6后二者的表達卻顯著降低。值得注意的是，無論是上調(diào)抑或是下調(diào)PTK6對p-ERK1/2表達均無顯著影響。上述實驗表明，PTK6可以通過影響p-JNK1/2和p-p38 MAPK的磷酸化進一步影響氣道上皮屏障功能。

綜上所述，本研究揭示了PTK6在TNF-α誘導(dǎo)的人氣道上皮屏障功能減損中具有重要的調(diào)節(jié)作用。PTK6表達下調(diào)后可以通過抑制JNK1/2和p38 MAPK的激活以明顯改善TNF-α誘導(dǎo)的氣道上皮屏障功能減損。這對于慢性氣道炎癥性疾病的防治具有重要意義。在后續(xù)的實驗中，我們將探討PTK6是否可以通過改善氣道上皮功能減損以緩解氣道炎癥狀況及其相關(guān)機制。

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[收稿2016-10-12 修回2016-12-25]

(編輯 許四平)

Effect of protein tyrosine kinase 6 on human airway epithelial barrier dsyfunction induced by TNF-α

XUQing,CHENLing-Xiu,ZHOUXiang-Dong.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010，China

Objective:To investigate the effect of protein tyrosine kinase 6(PTK6) on TNF-α induced human airway epithelial barrier dysfunction and mechamism.Methods: After cultivating 16HBE cells in vitro,the recombined PTK6 and PTK6 siRNA was respectively transfected into the cells,with empty vector and scramble siRNA as control.The cells were incubated with exogenous TNF-α.Cell viability was detected by MTT assay.Cells TER and permeability were detected.ZO-1 and Occludin mRNA were analyzed by RT-PCR.PTK6,ZO-1,Occludin,p-ERK1/2,p-JNK1/2 and p-p38MAPK protein were assayed by Western blot.Results: TNF-α remarkably decreased ZO-1 and Occludin mRNA and protein and TER;increased cells permeability,as well as p-ERK1/2,p-JNK1/2 and p-p38 protein(P<0.05).Upregulation of PTK6 further decreased ZO-1 and Occludin mRNA and protein and TER,enhanced cells permeability and p-JNK1/2 and p-p38 protein(P<0.05)，and downregulated PTK6 ,the changes of these indices were opposite(P<0.05).Whereas upregulation or downregulation of PTK6 had no effect on p-ERK1/2.Conclusion: Downregulation of PTK6 inhibits the phosphorylation of JNK1/2 and p38MAPK,thus improving TNF-α-induced human airway epithelial barrier dysfunction.

Protein tyrosine kinase 6;Tumor necrosis factor-α;Airway epithelial barrier;c-Jun N-terminal kinase;p38 mitogen-activated protein kinase

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.003

①本文受國家自然科學(xué)基金項目(81370111) 資助。

胥 青(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事氣道黏液高分泌的發(fā)生機制及防治方面的研究，E-mail:xq770816@163.com。

及指導(dǎo)教師：周向東(1963年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事氣道黏液高分泌的發(fā)生機制及防治的研究，同時供職于海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，E-mail:zxd999@263.net。

R363

A

1000-484X(2017)05-0652-04