舒成霖，何燕，曾志羽，劉浩，李金軼，黃偉強(qiáng)，羅程，許鍵，黃艷群

心肌縫隙連接蛋白43、40在擬交感心房顫動(dòng)模型中表達(dá)水平變化的研究

舒成霖，何燕，曾志羽，劉浩，李金軼，黃偉強(qiáng)，羅程，許鍵，黃艷群

目的：通過建立擬交感性心房顫動(dòng)（房顫）模型，探討心肌縫隙連接蛋白（Cx）43和Cx40表達(dá)水平的變化。

方法：選擇雜種犬15只，隨機(jī)分為3組，即：對照組（N組）、快速心房起搏組（RAP組）和快速心房起搏+異丙腎上腺素（ISO）灌流組（RAP+ISO組），每組5只，處死后取出心臟，建立langendorff心臟離體灌流模型。3組分別檢測心房有效不應(yīng)期（AERP）及房顫誘發(fā)率，免疫組化檢測神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分布，蛋白免疫印記法檢測Cx43和Cx40總蛋白水平，透射電鏡檢測線粒體形態(tài)，熒光比色法檢測線粒體內(nèi)活性氧簇（ROS）生成量。

結(jié)果：與N組AERP [（166±5.1）ms]比較，RAP組AERP[（160±3.2）ms]無明顯改變，無法誘發(fā)出房顫，RAP+ISO組AERP [（148±3.7）ms]明顯縮短（P<0.05），并可成功誘發(fā)房顫。與N組比較，RAP組線粒體輕度腫脹，基質(zhì)基本完整，RAP+ISO組線粒體明顯腫脹，部分基質(zhì)透明。RAP組和RAP+ISO組Cx43和Cx40總蛋白含量均低于N組（P<0.05），且RAP+ISO組蛋白含量低于RAP組（P<0.05）。RAP+ISO組神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶分布和含量以及線粒體內(nèi)ROS生成量顯著高于RAP組和N組（P<0.05），而 RAP組則高于N組（P<0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：交感性房顫的發(fā)生與Cx43和Cx40蛋白含量的變化有關(guān)，交感神經(jīng)可能通過氧化應(yīng)激下調(diào)Cx43和Cx40的蛋白含量來介導(dǎo)房顫的發(fā)生。

交感神經(jīng)系統(tǒng)；心房顫動(dòng)；縫隙連接蛋白

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:502.)

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床中最常見的心律失常。它主要通過三種機(jī)制，即電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)和自主神經(jīng)重構(gòu)來誘導(dǎo)和維持。目前普遍認(rèn)為神經(jīng)機(jī)制在房性心動(dòng)過速和房顫的發(fā)生和維持中發(fā)揮著重要作用。大量的研究表明交感神經(jīng)的再生與重構(gòu)和房顫的發(fā)生密切相關(guān)[1]。縫隙連接蛋白（Cx）是相鄰心肌細(xì)胞重要的連接結(jié)構(gòu)，其在細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。在心房肌中，Cx43和Cx40構(gòu)成了維持心房肌細(xì)胞信號傳導(dǎo)的主要成分。已有的研究表明，同正常組相比，在陣發(fā)性房顫和持續(xù)性房顫的患者中，Cx40均出現(xiàn)明顯降低[2]。在利用高頻起搏構(gòu)建的動(dòng)物房顫模型中，Cx43出現(xiàn)明顯下調(diào)[3]。但交感神經(jīng)是否通過影響Cx43、Cx40的變化來介導(dǎo)房顫的發(fā)生和維持，目前尚不清楚。本研究旨在通過構(gòu)建離體心臟的擬交感房顫模型來研究Cx43和Cx40同交感性房顫的關(guān)系，從而更好地了解交感性房顫發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

材料與主要試劑：實(shí)驗(yàn)雜種犬（中華田園犬）15只，雌雄不分，重約2～3 kg。異丙腎上腺素注射液，戊巴比妥鈉粉劑，肝素注射液，改良臺(tái)氏液（北京索來寶），鼠抗-Cx43單克隆抗體（santa cruz），兔抗—神經(jīng)生長因子（北京博奧森），兔抗—酪氨酸羥化酶（北京博奧森），DF-5A電生理刺激儀，凋亡試劑盒（Roche），兔抗-Cx40多克隆抗體（abcam）。

模型的建立與分組：15只犬隨機(jī)分成3組，每組5只。對照組（N組）：將實(shí)驗(yàn)犬以3%戊巴比妥鈉腹腔注射后麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，行胸骨正中切開術(shù)，向左心室注射8 000 U肝素，取出心臟，快速連接至心臟離體灌流儀，37.5℃下以改良臺(tái)氏液灌注心臟（250 r/min），灌流過程中使用人工按壓心臟，使心率恢復(fù)至100次/min左右。分別于左右心耳、心尖部放置針狀電極，連接電生理儀、刺激儀，記錄心電圖，持續(xù)灌流約1 h后留取心房組織?？焖傩姆科鸩M（RAP組）：灌注方法同N組，僅在灌流時(shí)用電生理刺激儀以800次/min頻率起搏30 s，共30次?？焖傩姆科鸩?異丙腎上腺素灌流組（RAP+ISO組）：以含0.1μmol/L異丙腎上腺素的改良臺(tái)氏液灌流心臟，余同RAP組。

電生理參數(shù)的檢測：離體心臟搏動(dòng)穩(wěn)定后行電生理參數(shù)檢測，以S1S2心臟程序期前刺激法檢測心房有效不應(yīng)期（AERP），S1S2偶聯(lián)間期從基礎(chǔ)刺激周長300 ms開始，刺激比例為8:1，10 ms步長遞減，脈寬2 ms，刺激強(qiáng)度為2倍的舒張閾值強(qiáng)度。直至不能奪獲心房的最長S1S2間期為AERP，重復(fù)3次，取平均值。記錄除N組外房顫的誘發(fā)次數(shù)，誘發(fā)出的房顫定義為持續(xù)時(shí)間大于2 s的快速不規(guī)則心房電活動(dòng)。

心房肌神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶免疫組化染色和分析：取下部分左心房組織，生理鹽水洗凈迅速于10%福爾馬林中固定。常規(guī)石蠟縱向切片，脫蠟后于檸檬酸鹽緩沖鹽中高溫高壓修復(fù)3 min，3%過氧化氫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min×3次，滴加一抗（神經(jīng)生長因子：1：500、酪氨酸羥化酶：1：300），置于4℃孵育過夜。采用二步法行神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)染色（按試劑盒說明書操作），光鏡下陽性為棕褐色。

蛋白免疫印記法檢測Cx43、Cx40總蛋白含量：將凍存左心房組織用液氮研磨，勻漿，使用放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）裂解液，再加入100 mg/L 苯甲基磺酰氟（PMSF），提取總蛋白，用二辛可寧酸（BCA）法行蛋白濃度測定。按每泳道加總蛋白40 μg，在12%分離膠和5%濃縮膠上電泳后以100 mA×2 h濕轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%脫脂奶粉的緩沖液室溫?fù)u動(dòng)封閉1 h，分別加入小鼠單克隆Cx43抗體（Santa，1:1 000），兔多克隆Cx40抗體（abcom，1:1 000）及小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（1:10 000），4℃孵育過夜，室溫下加相應(yīng)二抗（1:10 000）孵育2 h，室溫下TBST溶液清洗蛋白膜3次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線胸片曝光顯影。凝膠成像系統(tǒng)攝像分析。

透射電鏡下觀察線粒體形態(tài)：將左心房組織切成體積<1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，迅速放入2.5%戊二醛中固定2 h，透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)變化，并照片分析。

熒光比色法測活性氧簇（ROS）：3組左心房肌組織在取下后，1 h內(nèi)于冰上快速剪碎，采用碧云天公司線粒體提取試劑盒分離線粒體。隨后參照Korde等[4]的方法測定線粒體ROS。取線粒體量約為75 μg，加入呼吸緩沖液（5 mmol/L丙酮酸，2.5 mmol/L蘋果酸，10 μmol/L 二氯熒光素（H2DCF/DA）及5 μmol/L辣根過氧化物酶），室溫避光孵育30 min，用熒光分光光度計(jì)檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長532 nm。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組AERP的比較：與N組AERP [（166±5.1）ms]比較，RAP組[（160±3.2）ms]縮短，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），RAP+ISO組AERP [（148±3.7）ms]明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 3組房顫誘發(fā)率的比較（圖1）：N組與RAP組均無法誘發(fā)出房顫（0%、0%），RAP組僅出現(xiàn)短暫心房電紊亂現(xiàn)象。與N組和RAP組比較，RAP+ISO組則可誘發(fā)出房顫[（8.6±0.8）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 3組神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶免疫組化檢測結(jié)果（圖2）：神經(jīng)生長因子陽性呈棕黃色；與N組比較，可見RAP組和RAP+ISO組胞漿染色程度逐漸加深，且RAP+ISO組染色深于RAP組。酪氨酸羥化酶陽性為細(xì)胞核特異性著色，呈棕褐色；與N組相比，RAP組和RAP+ISO組酪氨酸羥化酶陽性逐漸增多，且RAP+ISO組明顯多于RAP組。

圖1 快速起搏心房心電圖

圖2 3組神經(jīng)生長因子、酪氨酸羥化酶免疫組化檢測結(jié)果

2.4 蛋白免疫印記法檢測Cx43、Cx40總蛋白含量的表達(dá)水平（圖3）： 與N組相比，RAP組和RAP+ISO組 Cx43、Cx40總蛋白含量均降低，且呈逐漸下降趨勢，相鄰各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 3組縫隙連接蛋白43、40總蛋白含量的表達(dá)水平的比較（n=5）

2.5 3組透射電鏡線粒體形態(tài)的比較（圖4）： N組線粒體無腫脹，嵴突規(guī)則致密。RAP組線粒體輕度腫脹，基質(zhì)基本完整，嵴排列欠整體，少部分?jǐn)嗔?。RAP+ISO組部分線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，部分基質(zhì)透明，嵴突紊亂、斷裂或溶解消失。

圖4 3組透射電鏡線粒體形態(tài)的比較（20 000×）

2.6 3組 ROS生成量比較：與N組ROS生成量（108.2±2.4）比較，RAP組（288.1±2.4）和RAP+ISO組（337.4±2.6）均明顯增加（P<0.05），且RAP+ISO組ROS生成量高于RAP組（P<0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

已有的研究表明，交感神經(jīng)的重構(gòu)和再生與房顫的維持和發(fā)生密切相關(guān)，但其具體的內(nèi)在機(jī)制目前研究較少。在本研究中，我們利用構(gòu)建心臟離體灌流模型，使心臟脫離了機(jī)體神經(jīng)體液系統(tǒng)的影響，并利用異丙腎上腺素灌流來模擬交感神經(jīng)興奮的效應(yīng)，以期能夠探索交感神經(jīng)與房顫發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制。研究表明，短時(shí)的高頻刺激并不會(huì)對AERP產(chǎn)生顯著影響[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，N組、RAP組AERP未出現(xiàn)明顯改變，而RAP+ISO組AERP則顯著縮短，同時(shí)RAP+ISO組可以成功誘發(fā)出房顫。TH是兒茶酚胺合成過程中第一個(gè)限速酶，同時(shí)也起到催化作用，其檢測為陽性的部位可代表交感神經(jīng)的分布。這表明高頻起搏和異丙腎上腺素灌流均可促進(jìn)交感神經(jīng)增生，且RAP+ISO組的增生效應(yīng)更強(qiáng)。這證實(shí)了交感神經(jīng)與房顫的密切關(guān)系，同時(shí)也提示其可對心房電重構(gòu)產(chǎn)生影響，從而增加了房顫的易感性。交感神經(jīng)是體內(nèi)重要的生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其張力會(huì)隨晝夜交替發(fā)生周期變化，因此單純的張力增高不會(huì)導(dǎo)致房顫，因此由交感神經(jīng)興奮介導(dǎo)的房顫中應(yīng)該存在結(jié)構(gòu)病變的基礎(chǔ)。

細(xì)胞縫隙連接（GJ）結(jié)構(gòu)是相鄰心肌細(xì)胞重要的連接結(jié)構(gòu)。GJ由Cx環(huán)繞排列而成，構(gòu)成了心肌細(xì)胞間代謝偶聯(lián)和電偶聯(lián)的重要組成部分[6]?？p隙連接通道的重新分布和功能改變會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)傳導(dǎo)速度和各向異性傳導(dǎo)發(fā)生改變，從而引起心律失常環(huán)路[7]。Cx43和Cx40是構(gòu)成心房肌細(xì)胞信號傳導(dǎo)的主要成分，且均為pH敏感性Cx，當(dāng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷及隨后內(nèi)環(huán)境pH發(fā)生變化，Cx43及Cx40含量即會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而增加心律失常的易感性[8]。ISO是人工合成非選擇性β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，可引起氧化應(yīng)激損傷，使ROS生成量增加及內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[9]。實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)RAP+ISO組的ROS生成量明顯增高，ROS的生成場所主要在線粒體，在電鏡下觀察各組線粒體超微結(jié)構(gòu)，與N組比較，RAP組線粒體僅出現(xiàn)形態(tài)上的變化，而RAP+ISO組線粒體則出現(xiàn)了明顯的腫脹，嵴突的斷裂和溶解。Lenaerts等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，房顫和氧化應(yīng)激的水平呈正相關(guān)。但氧化應(yīng)激是否通過影響Cx的變化誘導(dǎo)和維持房顫的發(fā)生，目前尚不十分明確。在我們此次離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)中，借助ISO模擬交感神經(jīng)的激活，通過高頻起搏成功構(gòu)建了擬交感房顫模型，并發(fā)現(xiàn)了RAP組Cx43和Cx40蛋白含量較N組降低，RAP+ISO組Cx43、Cx40蛋白含量與N組及RAP組比較均顯著降低。這也驗(yàn)證了Cx43及Cx40在心電傳導(dǎo)中的作用，當(dāng)二者含量下降時(shí)，會(huì)出現(xiàn)電傳導(dǎo)的紊亂，當(dāng)伴隨氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步加重，Cx43、Cx40出現(xiàn)明顯降低時(shí)，則會(huì)誘發(fā)出房顫。

綜上所述，我們認(rèn)為交感神經(jīng)可能通過影響氧化應(yīng)激下Cx43和Cx40的變化來介導(dǎo)房顫的發(fā)生。但本研究過程中，我們主要探討了心房組織Cx43及Cx40總蛋白含量，但眾所周知，Cx43總蛋白含量并不能完全代表Cx43的功能狀態(tài)，磷酸化的Cx43在其中也發(fā)揮著極其重要的作用[11]，而這也是未來我們將繼續(xù)深入研究的方向。

[1] 黃欣淼, 曲秀芬. 心房顫動(dòng)與自主神經(jīng)的相關(guān)性研究進(jìn)展. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 1027-1029.

[2] Gemel J, Levy AE, Simon AR, et al. Connexin40 abnormalities and atrial fibrillation in the human heart. J Mol Cell Cardiol, 2014, 76: 159-168.

[3] Yan J, Kong W, Zhang Q, et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res, 2013, 97: 589-597.

[4] Korde AS, Yadav VR, Zheng YM, et al. Primary role of mitochondrial Rieske iron-sulfur protein in hypoxic ROS production in pulmonary artery myocytes. Free Radic Biol Med, 2011, 50: 945-952.

[5] Zhang L, Po SS, Wang H, et al. Autonomic Remodeling: How Atrial Fibrillation Begets Atrial Fibrillation in the First 24 Hours. JCardiovasc Pharmacol, 2015, 66: 307-315.

[6] Palatinus JA, Rhett JM. Gourdie RG The connexin43 carboxyl terminus and cardiac gap junction organization. Biochim Biophys Acta, 2012, 1818: 1831-1843.

[7] 王糧山, 顧承雄. 心肌梗死后縫隙連接蛋白43重構(gòu)與室性心律失常. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 1120-1122.

[8] Tribulova N, Egan Benova T, Szeiffova Bacova B, et al. New aspects of pathogenesis of atrial fibrillation: remodelling of intercalated discs. J Physiol Pharmacol, 2015, 66: 625-634.

[9] Davel AP, Brum PC, Rossoni LV. Isoproterenol induces vascular oxidative stress and endothelial dysfunction via a Gialpha-coupled beta2-adrenoceptor signaling pathway. PLoS One, 2014, 9: e91877.

[10] Lenaerts I, Driesen RB, Hermida N, et al. Role of nitric oxide and oxidative stress in a sheep model of persistent atrial fibrillation. Europace, 2013, 15: 754-760.

[11] Adam O, Lavall D, Theobald K, et al. Rac1-induced connective tissue growth factor regulates connexin 43 and N-cadherin expression in atrial fibrillation. J Am Coll Cardiol, 2010, 55: 469-480.

Expression of Myocardial Levels of Connexin 43, 40 in Experimental Dog Model of Sympathomimetic Atrial Fibrillation

SHU Cheng-lin, HE Yan, ZENG Zhi-yu, LIU Hao, LI Jin-yi, HUANG Wei-qiang, LUO Cheng, XU Jian, HUANG Yan-qun.

Department of Geriatrics Cardiology, First Aff i liated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning (530021), Guangxi, China

HE Yan, Email: hyxjwxy@126.com

Objective: To explore the expression of myocardial levels of connexin 43(Cx43), Cx40 in experimental dog model of sympathomimetic atrial fi brillation (AF).

Methods: 15 mongrels dogs were randomly divided into 3 groups: Control group, Rapid atrium pacing (RAP) group and RAP+isoprenaline (ISO) perfusion group. n=5 in each group. The hearts were taken to establish in vitro langendorff cardiac perfusion model. Atrial effective refractory period (AERP) and AF inducing rate were tested; intracellular expression and distribution of nerve growth factor (NGF) and tyrosine hydroxylase (TH) were examined by immunohistochemistry, total protein contents of Cx43 and Cx40 were measured by Western blot analysis, mitochondria morphology was observed by transmission electron microscope and mitochondria reactive oxygen species (ROS) generation was detected by f l uorescent colorimetric method.

Results: AERP was similar between Control group and RAP group (166±5.1) ms vs (160±3.2) ms which cannot induce AF; while it was shortened in RAP+ISO group (148±3.7) ms, P<0.05 which may successfully induce AF.Compared with Control group, mitochondria was slightly swollen in RAP group and the matrix was intact, while mitochondria was obviously swollen in RAP+ISO group and part of matrix was transparent; total protein contents of Cx43 and Cx40 were lower in both RAP group and RAP+ISO group, P<0.05; in addition, they were even lower in RAP+ISO group than RAP group, P<0.05. Compared with Control group and RAP group, RAP+ISO group had increased expression and distribution of NGF, TH and mitochondria ROS generation, P<0.05; NGF, TH and ROS in RAP group were higher than Control group, P<0.05.

Conclusion: Sympathetic AF has been related to the contents and changes of myocardial levels of CX43 and Cx40; sympathetic nerve might trigger AF by oxidative stress induced down-regulation of myocardial CX43 and Cx40 in experimental dog model.

Sympathetic system; Atrial fi brillation; Connexin; Qxidative stress

2016-06-28）

（編輯：漆利萍）

國家自然科學(xué)基金（81260039）；廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFAA278005）；第一批廣西醫(yī)學(xué)高層次骨干人才培養(yǎng)“139”計(jì)劃經(jīng)費(fèi)

530021 廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年心內(nèi)科（舒成霖、何燕、曾志羽、許鍵、黃艷群）；心血管病研究所（李金軼、劉浩、黃偉強(qiáng)）；心胸外科（羅程）

舒成霖 碩士研究生 主要從事心律失常研究 Email：360045198@qq.com 通訊作者：何燕 Email：hyxjwxy@126.com

R54

A

1000-3614（2017）05-0502-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.05.019