凌冬云，黃猛珣，王聯(lián)發(fā)

基礎與實驗研究

動脈粥樣硬化小鼠主動脈平滑肌上瞬時受體電位通道-1-大電導鈣離子激活鉀通道信號復合體分子表達量的變化研究

凌冬云，黃猛珣，王聯(lián)發(fā)

目的：觀察動脈粥樣硬化（AS）小鼠主動脈平滑肌上瞬時受體電位通道-1-大電導鈣離子激活鉀通道（TRPC1-BK）信號復合體分子表達量的變化。

方法：AS組采用載脂蛋白E基因缺陷（ApoE-/-）小鼠，對照組采用野生型C57BL/6J小鼠，每組10只，分別采用高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)10周，處死后分離主動脈血管平滑肌組織，提取總核糖核酸（RNA）及總蛋白。使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）及免疫組化染色等方法檢測并比較兩組TRPC1、大電導鈣離子激活鉀通道α亞單位（ BKα）及大電導鈣離子激活鉀通道β1亞單位（ BKβ1）亞基信使核糖核酸（mRNA）和蛋白表達量的差異。

結果：AS組AS模型建立成功。RT-PCR 檢測結果：與對照組比，AS組TRPC1的mRNA表達量增多（P<0.05）, BKα和BKβ1亞基的mRNA表達量減少（P均<0.01）。Western blot法檢測結果：與對照組比，AS組TRPC1蛋白表達量增多（P<0.05）, BKα和BKβ1蛋白表達量減少（P均<0.01）。免疫組化染色檢測結果：TRPC1蛋白表達量增多（P<0.01），BKα蛋白表達量減少（P<0.01），BKβ1蛋白表達量減少（P<0.05）。

結論：AS組小鼠主動脈平滑肌組織中TRPC1-BK信號復合體的mRNA和蛋白表達量均受影響。推測TRPC1-BK信號復合體有可能成為治療AS相關性血管疾病的一個新靶點。

動脈粥樣硬化；肌,平滑,血管；信號復合體

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:497.)

動脈粥樣硬化（AS）是缺血性心腦血管疾病的病理生理基礎，隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，缺血性心腦血管病已成為嚴重威脅人類健康的非傳染性流行病，研究AS及其相關疾病的發(fā)病機制和防治方法成為熱點。

瞬時受體電位通道-1（TRPC1）是一種存在于細胞膜上的Ca2+通道，尤其是在血管平滑肌細胞上，是一種細胞感受器，能夠接收細胞內(nèi)外的信號和刺激[1]。此通道受細胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)控，當細胞的肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+耗竭時，TRPC1通道開放，Ca2+內(nèi)流增加，細胞去極化，從而細胞收縮，進而引起血管收縮。大電導Ca2+激活鉀通道（BK）也是一種大量分布于血管平滑肌細胞膜上的通道，每個BK通道由4個α亞單位組成，此外，BK通道α亞單位的活性及功能主要受一種β1亞單位調(diào)節(jié)。當細胞內(nèi)Ca2+濃度升高時，BK通道激活，K+外流，產(chǎn)生超極化，抑制Ca2+通道開放，使 Ca2+內(nèi)流減少，細胞去極化。BK通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力中具有至關重要的作用，因為在離體的血管上加入BK通道特異性阻滯劑后，血管平滑肌細胞膜去極化并且血管張力增加。Brayden等[2]研究發(fā)現(xiàn)，TRPC1與β-微管蛋白[3]、錨蛋白[4]、窖蛋白[5]、Homer蛋白[6]、抗黏液病毒A（MxA）蛋白[7]、RhoA蛋白[8]、突觸小體相關蛋白-25KDa（SNAP-25）[9]和小泡關聯(lián)膜蛋白（VAMP）[9]等轉(zhuǎn)運或支架蛋白相互作用，對細胞內(nèi)囊泡運輸、膜融合及細胞骨架重排等過程進行調(diào)節(jié)，又與三磷酸肌醇受體（IP3R）[10]、鈣調(diào)素（CaM）[11]、Gq/11蛋白[12]、磷脂酶Cγ（PLCγ）[13]、質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（PMCA）[14]、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA）[15]、基質(zhì)交聯(lián)分子-1（STIM1）[16]等蛋白形成信號通路，共同調(diào)節(jié)細胞的生理功能。近年有研究發(fā)現(xiàn)[17]，在血管平滑肌細胞膜上，TRPC1與BK通道形成一種信號復合體，兩者通過共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度，維持血管平滑肌細胞膜內(nèi)外物理及化學環(huán)境穩(wěn)定，從而達到穩(wěn)定血管張力和調(diào)節(jié)血流量的作用。AS時，血管壁發(fā)生一系列病理生理變化，血管壁上細胞的離子通道也會受到影響。由于血管平滑肌細胞膜上的離子通道功能對于調(diào)節(jié)血管功能具有至關重要的作用，為此，我們從分子生物學層面研究AS對動脈組織上TRPC1-BK信號復合體的表達是否產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TRPC1兔抗鼠一抗、BKα兔抗鼠一抗及BKβ1兔抗鼠一抗均購于美國Novus公司，β-actin兔抗鼠一抗（美國Celling Signal），辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗（北京中杉金橋），電化學（ECL）發(fā)光液（美國Thermo Scientific），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒（北京中杉金橋），Trizol試劑盒（美國Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）二步法試劑盒（北京康維世紀），電泳儀（上海天能）、聚合酶鏈式反應（PCR）基因擴增儀和PCR電泳儀（美國Applied Biosystems），熒光和化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國UVP），顯微鏡（日本Olympus），石蠟組織切片機（北京世紀科信），彩色數(shù)碼電荷耦合元件（CCD）攝像頭（日本Nikon），Metamorph生物圖像軟件（美國Universal Imaging）。

1.2 實驗動物分組及處理

AS組采用載脂蛋白E基因缺陷（ApoE-/-）小鼠10只（購于北京華阜康生物科技公司），對照組采用野生型C57BL/6J小鼠10只（購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心）。均為6～8周，共同飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學無特定病原體（SPF）級實驗動物中心，因為高脂飲食可促進AS斑塊的形成[18]，所以AS組和對照組分別采用高脂飼料（含粗脂肪17.9%）和普通飼料喂養(yǎng)10周。

1.3 主動脈組織分離

10周后，采用4%戊巴比妥0.5～1.0 ml腹腔注射麻醉小鼠，小鼠解剖臺上固定，將小鼠胸部皮膚沿正中線剪開并向左右兩側鈍性分離，打開胸腔，可見心臟，在升主動脈距離心臟約0.5 cm處剪斷，并逐步分離升主動脈、主動脈弓及胸主動脈。動脈分離出后立即生理鹽水中清洗三次，用紗布吸干殘余水分。

1.4 組織切片

將上述動脈組織浸于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟固定，因AS病變主要從升主動脈至主動脈弓部分最先發(fā)生，故從升主動脈至主動脈弓逐層切片，透明，蘇木素伊紅（HE）染色，封片，拍片，見明顯AS，表明ApoE-/-小鼠AS造模成功。

1.5 血管平滑肌層分離

ApoE-/-小鼠AS造模成功后，同樣方法分離小鼠升主動脈、主動脈弓及胸主動脈，眼科剪將主動脈縱行剪開，眼科鑷剝離血管外膜層，脫脂棉刮除血管內(nèi)膜層，得到中層血管平滑肌層，用于后續(xù)實驗研究。

1.6 RT-PCR方法檢測信使核糖核酸（mRNA）含量

在PubMed Gene Bank中設計甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、TRPC1、BKα和BKβ1上下游引物，由上海生工生物公司合成引物，4種蛋白所對應基因分別為GAPDH、TRPC1、大電導鈣離子激活鉀通道α亞基（KCNMA1）和大電導鈣離子激活鉀通道β1亞基（KCNMB1），引物及產(chǎn)物大小如表1所示。

表1 基因引物及合成產(chǎn)物片段大小

使用Trizol法抽提上述組織中總核糖核酸（RNA），經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄、擴增后，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外光下觀察，凝膠成像系統(tǒng)攝片，使用Image J軟件測量條帶密度，計算目的條帶密度值/相對應內(nèi)參條帶密度值，以比值計算實驗結果。

1.7 蛋白質(zhì)檢測

蛋白免疫印跡（Western blot）：以β-肌動蛋白作為內(nèi)參蛋白，檢測TRPC1、BKα、BKβ1蛋白表達水平，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析，計算目的蛋白灰度值/相對應內(nèi)參蛋白灰度值，以比值計算結果。

免疫組化染色：血管平滑肌組織4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制成厚3～4 μm的連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟及抗原修復后，采用免疫組化超敏二步法染色。所用抗體及稀釋度如下:一抗為兔抗鼠TRPC1、BKα和BKβ1的抗體，稀釋度均為1:300，37℃孵育40 min 后，4℃過夜；HRP標記二抗37℃孵育30 min。DAB顯色后脫水、透明和封片。在光鏡（10×40倍）下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組免疫組化染色切片中TRPC1、BKα和BKβ1的圖像，每張切片隨機選取5個視野，再用Metamorph生物圖像軟件計算各組TRPC1、BKα和BKβ1免疫陽性細胞的平均光密度（MOD）值。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行。各指標數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，經(jīng)過正態(tài)性檢驗，采用兩組間比較的t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。統(tǒng)計圖均在GraphPad Prism軟件中繪制。

2 結果

2.1 HE染色法檢測兩組小鼠主動脈組織AS形成情況（圖1）

兩組主動脈組織切片并HE染色后顯微鏡觀察，提示ApoE-/-小鼠成功建立AS模型，圖1B箭頭所示，可見明顯AS病變。

2.2 RT-PCR 檢測兩組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白所對應mRNA含量（圖2）

圖1 蘇木素伊紅染色法檢測兩組小鼠主動脈組織AS形成情況(×100, n=10)

圖2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應檢測兩組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白所對應mRNA含量差異（n=10）

與對照組比，AS組小鼠主動脈血管平滑肌組織中TRPC1的mRNA表達量增多且差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）；BKα和BKβ1的mRNA表達量減少（P均 <0.01）。

2.3 Western blot法檢測兩組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白表達水平（圖3）

與對照組比，AS組小鼠主動脈平滑肌組織中TRPC1蛋白表達量增多 （P<0.05），BKα和BKβ1蛋白表達量減少（P均<0.01）。

圖3 免疫蛋白印跡法檢測兩組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白表達水平（n=10）

2.4 免疫組化染色檢測各組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白表達情況（圖4）

圖4A中灰黃色為血管平滑肌組織中各蛋白免疫組化反應顯色部分，藍色為細胞核。與對照組比，AS組小鼠主動脈平滑肌組織中 TRPC1蛋白表達量增多 （P<0.01），BKα蛋白表達量減少（P<0.01），BKβ1蛋白表達量減少（P<0.05）。

圖4 免疫組化染色檢測各組小鼠主動脈平滑肌組織中各蛋白表達情況 （×400，n=10）

3 討論

AS是一種發(fā)生在血管上復雜的炎癥性疾病，其特點是在動脈壁內(nèi)逐漸形成脂質(zhì)斑塊[19]。AS是缺血性事件的根本原因，AS的首發(fā)臨床表現(xiàn)絕大多數(shù)是心肌梗死或中風[20]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，AS發(fā)病率逐年增高，嚴重威脅人類的健康。

載脂蛋白（Apo）E存在于多種脂蛋白顆粒中，是一種主要由肝臟合成的膽固醇轉(zhuǎn)運體糖蛋白，是正常人及動物血漿脂蛋白中重要組成成分。它在參與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運、儲存、利用及排泄中發(fā)揮重要作用，作為乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、高密度脂蛋白的重要組分，可穩(wěn)定這些脂蛋白的結構。ApoE通過與低密度脂蛋白（LDL）受體和肝ApoE受體結合，促進CM、LDL、VLDL的降解，起到轉(zhuǎn)運脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂類代謝的作用，與機體總膽固醇的代謝密切相關。當ApoE缺失時，血液中各種脂蛋白含量發(fā)生明顯變化，在血管壁上聚積，形成氧化產(chǎn)物（如氧化LDL）等促進血管壁內(nèi)的巨噬細胞泡沫化形成泡沫細胞，并在血管局部引發(fā)一系列多種細胞參與的免疫炎癥反應，形成惡性循環(huán)，最終血管AS形成[21]。ApoE-/-小鼠正是利用此原理引起高脂血癥，而高脂血癥是AS最重要的危險因素之一[22，23]，所以ApoE-/-小鼠是建立AS實驗模型的理想動物。

在AS病變過程中，血管壁細胞上的各種離子通道的蛋白表達量會受影響，而血管平滑肌細胞上的離子蛋白受影響時不僅會改變細胞內(nèi)外生理生化過程，最重要的是會影響平滑肌細胞的舒縮功能，進而影響血管的舒縮功能。TRPC1通道已在多種細胞膜上檢測到，尤其是在血管平滑肌細胞膜上；BK通道也是一種存在于細胞膜上并對細胞內(nèi)Ca2+濃度高度依賴而介導細胞內(nèi)K+運輸?shù)碾x子通道。Kwan等[17]通過免疫熒光、免疫共沉淀、膜片鉗實驗及血管張力測定等研究技術，發(fā)現(xiàn)在C57BL/6J小鼠胸主動脈平滑肌細胞膜上的TRPC1通道與BK通道形成一種離子信號復合體，共同調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度，從而影響細胞表面的膜電位，進而調(diào)控血管張力。我們的實驗也表明AS小鼠與正常小鼠主動脈平滑肌組織中TRPC1、BK通道的蛋白表達量存在明顯差異，與既往研究報道相一致。此實驗研究發(fā)現(xiàn)在AS小鼠和正常小鼠主動脈平滑肌組織中，TRPC1、BKα及BKβ1所對應蛋白和mRNA的表達量均存在差異，可推論AS病變影響了主動脈平滑肌組織中的TRPC1-BK信號符合體蛋白的表達。AS時細胞膜上TRPC1表達增加，介導Ca2+內(nèi)流增加，血管平滑肌細胞收縮，且Ca2+促進細胞內(nèi)外基質(zhì)增生，加重AS血管狹窄；同時AS時細胞膜上BK通道蛋白表達減少，K+外流減少，平滑肌細胞難以得到超極化而保持收縮狀態(tài)，進一步加重血管狹窄。此外，這兩種通道形成的TRPC1-BK信號復合體功能紊亂，此種相互作用也可進一步加重動脈組織AS病變及血管狹窄。所以推測TRPC1-BK信號復合體有可能作為治療AS相關疾病的一個新靶點。

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Expression of TRPC1-BK Signal Complex in Aortic Smooth Muscle Tissue in Experimental Mice of Atherosclerosis

LING Dong-yun, HUANG Meng-xun, WANG Lian-fa.

Department of Cardiology, PLA 105 Hospital, Anhui Medical University, Hefei (230031), Anhui, China

WANG Lian-fa, Email: wanglf105@163.com

Objective: To observe the expression of transient receptor potential channel-1—large conductance Ca2+-activated K+channel (TRPC1-BK) signal complex in aortic smooth muscle tissue in experimental mice of atherosclerosis (AS).

Methods: Our research included in 2 groups: Control group, wild C57BL/6J mice were fed by normal diet and AS group, ApoE-/-mice were fed by high fat diet to establish AS model. All animals were treated for 10 weeks, n=10 in each group. The total RNA and protein were extracted from aortic smooth muscle tissue in sacrif i ced mice. The mRNA and protein expressions of TRPC1, BKα and BKβ1 subunit were measured by RT-PCR, Western blot analysis and immunohistochemistry staining.

Results: By RT-PCR examination, compared with Control group, AS group showed increased mRNA expression of TRPC1, P<0.05 and decreased mRNA expressions of BKα and BKβ1 subunit, both P<0.01. By Western blot analysis, compared with Control group, AS group had elevated protein expression of TRPC1, P<0.05 and reduced protein expressions of BKα and BKβ1 subunit, both P<0.01; by immunohistochemistry staining, AS group had the higher protein expression of TRPC1, P<0.01 and the lower protein expressions of BKα and BKβ1 subunit, both P<0.05.

Conclusion: The mRNA and protein expressions of TRPC1-BK signal complex were affected in aortic smooth muscle tissue in AS mice, which speculated that TRPC1-BK signal complex might be become a new target for treating the relevantvascular disease.

Atherosclerosis; Muscle, smooth vascular; Signal complex

2016-06-27）

（編輯：王寶茹）

230031 安徽省合肥市，安徽醫(yī)科大學 中國人民解放軍第一零五醫(yī)院 心內(nèi)二科

凌冬云 碩士研究生 主要從事動脈粥樣硬化相關疾病研究 Email:lingdy0620@sina.com 通訊作者：王聯(lián)發(fā) Email:wanglf105@163.com

R54

A

1000-3614（2017）05-0497-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.05.018