伍

立德1* ，譚學(xué)君1，文溢1，溫曉霞1，代朋1，吳敵1，陳少云1，陳曉平2

(1重慶市萬(wàn)州區(qū)第五人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶404000;2上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海200135)

鼻息肉是臨床上較為常見(jiàn)的良性增生性疾病。相關(guān)研究顯示，老年鼻息肉的發(fā)病率可達(dá)0．007%以上，且近年呈現(xiàn)出明顯上升趨勢(shì)［1］。臨床上鼻息肉的發(fā)生發(fā)展，可以導(dǎo)致鼻黏膜上皮交界性或者惡性病變的發(fā)生，臨床預(yù)后不佳［2］。

糖皮質(zhì)激素是目前臨床上治療鼻息肉的主要藥物，糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)促進(jìn)息肉組織萎縮，減輕鼻息肉導(dǎo)致的相關(guān)臨床癥狀，但迄今為止對(duì)于糖皮質(zhì)激素治療的具體生物學(xué)機(jī)制的研究不足。息肉組織中表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)可促進(jìn)鼻黏膜上皮組織增生，進(jìn)而促進(jìn)老年鼻息肉的病情進(jìn)展［2－4］。本研究納入2014年1月至2016年8月在我院接受糖皮質(zhì)激素治療的60例老年鼻息肉患者，探討了糖皮質(zhì)激素治療后EGF及EGFR的變化，揭示了糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象

納入2014年1月至2016年8月在我院接受糖皮質(zhì)激素治療的60例老年鼻息肉患者(息肉組)及鼻中隔偏曲患者20例(對(duì)照組)。息肉組60例，男性44例、女性16例，年齡60～87(74．4±9．1)歲，病程3～15(7．9±4．1)年。對(duì)照組 20例，男性14例、女性6例，年齡60～83(72．6 ±8．5)歲，病程3～13(7．5±4．0)年。兩組患者的年齡、性別、病程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)鼻息肉診斷參考《中華耳鼻喉頭頸外科雜志》編委會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻喉頭頸外科學(xué)分會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)［5］;(2)患者年齡≥60歲;(3)均在我院接受鼻內(nèi)窺鏡檢查及激素治療，經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診;(4)獲得患者的知情同意及醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并上頜竇后鼻孔息肉、霉菌性鼻竇炎、鼻竇腫瘤、免疫性疾病;(2)既往有鼻竇、鼻腔手術(shù)史;(3)近2個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物。

1．3 治療方法

息肉組治療開(kāi)始后給予鼻腔應(yīng)用布地奈德鼻噴劑治療(128μg/次，2次/d)，對(duì)照組治療開(kāi)始后給予鼻腔生理鹽水噴鼻(128μg/次，2次/d)。療程12周，結(jié)束后行鼻內(nèi)鏡檢查并對(duì)息肉組評(píng)估鼻息肉大小。

1．4 免疫組織化學(xué)染色

切片厚度3 mm，3%H2O2室溫孵育5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3 min，采用濃度為10%的牛奶蛋白(10 g蛋白加入100 ml水)封閉，室溫孵育5 min，加入EGF、EGFR抗體(鼠來(lái)源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(兔來(lái)源，購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司)，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入NBT/BCIP顯色劑顯色5 min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購(gòu)自上海精密儀器有限公司，配套試劑購(gòu)自南京泰康生物科技有限公司。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定。鼻息肉組織中EGF、EGFR蛋白陽(yáng)性著色呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。(1)根據(jù)著色強(qiáng)度:0分為無(wú)色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色;(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例:0% ～5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，75%～100%為4分。兩種評(píng)分方法相乘，≥6分為高表達(dá)，＜6分為低表達(dá)。

1．5 逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

采用組織研磨法采集息肉患者的病灶組織，按照1000轉(zhuǎn)/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0．2 ml的氯仿，劇烈搖動(dòng) 30 s，室溫 3 min，12 000 × g，4℃ 離心15 min得到RNA。加等體積異丙醇，－20℃，30 min，棄上清，加75%乙醇1 ml，振蕩，20μl焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水，室溫放置5 min使其完全溶解。加入逆轉(zhuǎn)錄酶5μl，室溫下放置20 min后置入37℃水浴鍋中孵育30 min，在底物中加入上下游引物各0．5μl，逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)混合液5μl，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)稀釋至20 μl，反應(yīng)條件:95℃ 3 min、95℃ 15 s、90℃ 5 s，共40 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為134 bp。

1．6 療效評(píng)價(jià)

鼻息肉病變程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):參考?xì)W洲耳鼻喉頭頸外科協(xié)會(huì)制定的慢性鼻－鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)及鼻息肉臨床治療指南中的標(biāo)準(zhǔn):(1)無(wú)息肉:0分;(2)鼻息肉僅局限于中鼻道:1分;(3)鼻息肉超出中鼻道，但未完全堵塞鼻腔:2分;(4)息肉完全堵塞患者鼻腔:3分。按雙側(cè)分別計(jì)分求和。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16．0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析法，同一時(shí)間點(diǎn)兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);組內(nèi)治療前后不同時(shí)間點(diǎn)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 息肉組患者的治療效果

治療前，息肉組患者的鼻息肉病變?cè)u(píng)分為(2.48±0.77)分，治療 2周后為(2．11 ±0．68)分，治療6周后為(1.57±0.49)分，治療12周后為(1.29±0.64)分，鼻息肉病變?cè)u(píng)分呈逐漸降低的趨勢(shì)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

2．2 兩組患者EGF和EGFR蛋白表達(dá)水平

息肉組在治療前后鼻息肉組織中的EGF和EGFR蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0．05);治療12周后，鼻息肉組織中EGF和EGFR蛋白表達(dá)水平較治療前均顯著降低(P ＜0．05;圖 1，2，表 1)。

圖1 鼻息肉組織治療前后的EGF蛋白表達(dá)情況Figure 1 Expression of EGF protein in nasal polyps before and after treatment(SP×400)A:before treatment;B:12 weeks after treatment

圖2 鼻息肉組織治療前后的EGFR蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expression of EGFR protein in nasal polyps before and after treatment(SP×400)A:before treatment;B:12 weeks after treatment

表1 兩組患者EGF和EGFR蛋白的表達(dá)水平Table 1 Expression levels of EGF and EGFR proteins in two groups(score±s)

表1 兩組患者EGF和EGFR蛋白的表達(dá)水平Table 1 Expression levels of EGF and EGFR proteins in two groups(score±s)

EGF:epidermal growth factor;EGFR:epidermal growth factor receptor．Compared with before treatment，*P ＜ 0．05;compared with control group，#P ＜0．05，###P ＜0．001

EGF protein EGFR protein Group nBefore treatment 12 weeks after treatment Polyp 60 7．97 ±0．98### 4．60 ±0．72*# 8．71 ±1．33### 5．82 ±0．81*#Before treatment 12 weeks after treatment 1 ±0．68 Control 20 3．98 ±0．60 3．98 ±0．60 4．01 ±0．68 4．0

2．3 兩組患者EGF mRNA和EGFR mRNA表達(dá)水平

息肉組在治療前、治療2周、治療6周、治療12周，EGF mRNA和EGFR mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0．05);息肉組在治療12周后，鼻息肉組織中EGF和EGFR蛋白表達(dá)水平均顯著低于治療前(P ＜0．05;圖 3，圖 4，表2)。

圖3 EGF mRNA在對(duì)照組和息肉組中的表達(dá)Figure 3 Expression of EGF mRNA in control group and polyp group

圖4 EGFR mRNA在對(duì)照組和息肉組中的表達(dá)Figure 4 Expression of EGFR mRNA in control group and polyp group

3 討論

病毒感染、鼻黏膜的長(zhǎng)期損傷及自身易感因素等均可以促進(jìn)鼻息肉的發(fā)生發(fā)展，特別是在老年人群中，鼻息肉的發(fā)病率更高，較普通對(duì)照人群高2～3倍［6］。鼻黏膜息肉的長(zhǎng)期存在，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而糖皮質(zhì)激素可通過(guò)抑制局部炎癥反應(yīng)、改善自身免疫功能、抑制巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)鼻黏膜的刺激等途徑治療鼻息肉。

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)中束狀帶分泌的一類甾體激素，主要為皮質(zhì)醇，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，還具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎和抗病毒作用。糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)抑制炎癥蛋白質(zhì)的合成，基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子－1(endothelial-leukocyte adhesion molecule 1，ELAM-1)和細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而抑制鼻黏膜上皮間質(zhì)細(xì)胞增生導(dǎo)致的息肉形成［7，8］。一項(xiàng)匯集了225例樣本量的臨床回顧性分析研究顯示，糖皮質(zhì)激素治療鼻息肉的臨床總體有效率可達(dá)45%以上［9，10］，但對(duì)于糖皮質(zhì)激素治療相關(guān)機(jī)制的研究仍處于空白狀態(tài)。

EGF和EGFR是重要的生長(zhǎng)因子，其受體或者配體的激活，可通過(guò)激活下游信號(hào)通路，加劇間質(zhì)細(xì)胞成分的增生，促進(jìn)息肉的形成，并可促進(jìn)息肉周邊新生血管的形成，從而為鼻黏膜息肉的增殖等病理性改變提供血流供應(yīng)。相關(guān)研究也證實(shí)，EGF和EGFR的激活是促進(jìn)老年患者鼻息肉發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［5，11，12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療后的鼻息肉病變?cè)u(píng)分呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，且隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，鼻息肉病變?cè)u(píng)分的下降區(qū)勢(shì)越為明顯，提示了糖皮質(zhì)激素對(duì)于治療老年患者鼻息肉的重要臨床價(jià)值。糖皮質(zhì)激素治療老年患者鼻息肉的臨床效果主要可能與以下機(jī)制有關(guān):(1)糖皮質(zhì)激素抑制成纖維細(xì)胞活性;(2)糖皮質(zhì)激素抑制炎性因子刺激息肉增生，或者改善巨噬細(xì)胞分泌成纖維等間質(zhì)成分。董玉科等［13，14］前瞻性分析了82例樣本量的臨床資料后發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素治療鼻息肉后，患者的癥狀評(píng)分及息肉的體積等均明顯出現(xiàn)下降趨勢(shì);且治療時(shí)間越長(zhǎng)、治療越規(guī)范，其臨床效果越明顯，這與本研究的結(jié)論較為一致。息肉組患者息肉組織中的EGF和EGFR蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，提示EGF和EGFR蛋白可能參與息肉的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。EGF和EGFR蛋白可通過(guò)激活下游信號(hào)通路PI3K/Akt，促進(jìn)息肉上皮細(xì)胞成分的增殖或者息肉體積的增加;而縱向比較可發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素治療后的EGF和EGFR蛋白表達(dá)較治療前明顯下降，提示其可能與抑制EGF和EGFR蛋白表達(dá)有關(guān)。糖皮質(zhì)激素對(duì)息肉組織中未分化成熟的上皮細(xì)胞的促凋亡作用，可降低EGF和EGFR蛋白的合成或分泌，在基因轉(zhuǎn)錄水平，同樣可以發(fā)現(xiàn)EGF mRNA和EGFR mRNA的表達(dá)下降。糖皮質(zhì)激素對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的抑制，可降低纖毛上皮細(xì)胞分泌的EGF與基底層細(xì)胞的EGFR結(jié)合，抑制基底層細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，從而達(dá)到治療的臨床目的。

表2 兩組患者EGF mRNA和EGFR mRNA表達(dá)水平Table 2 Expression levels of EGF mRNA and EGFR mRNA in two groups(±s，A254 nm)

表2 兩組患者EGF mRNA和EGFR mRNA表達(dá)水平Table 2 Expression levels of EGF mRNA and EGFR mRNA in two groups(±s，A254 nm)

EGF:epidermal growth factor;EGFR:epidermal growth factor receptor．Compared with before treatment，*P ＜ 0．05;compared with control group，#P ＜0．05

treatment Polyp EGF mRNA 0．216 ±0．073# 0．185 ±0．082*# 0．154 ±0．070*# 0．132 ±0．069*#Group Index Before treatment 2 weeks after treatment 6 weeks after treatment 12 weeks after Control 0．114 ±0．027 0．114 ±0．027 0．114 ±0．027 0．114 ±0．027 Polyp EGFR mRNA 0．199 ±0．089# 0．173 ±0．066*# 0．149 ±0．071*# 0．121 ±0．059*#0．110 ±0．033 Control 0．110 ±0．033 0．110 ±0．033 0．110 ±0．033

綜上所述，糖皮質(zhì)激素治療老年鼻息肉患者的效果肯定，其作用機(jī)制與抑制鼻息肉組織中EGF及EGFR表達(dá)有關(guān)。但本研究對(duì)于糖皮質(zhì)激素臨床安全性的分析不足，糖皮質(zhì)激素治療后是否會(huì)增加老年患者息肉的遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率仍需進(jìn)一步探討。

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