郭 蓉，郭孟璧，陳 璇，陳秋羽，許艷萍，郭鴻彥，楊 明，張慶瀅*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201)

大麻種子萌發(fā)時(shí)總糖和還原糖含量的動(dòng)態(tài)變化及其檢測(cè)方法優(yōu)化

郭 蓉1，郭孟璧1，陳 璇1，陳秋羽2，許艷萍1，郭鴻彥1，楊 明1，張慶瀅1*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201)

以工業(yè)大麻品種云麻1號(hào)和M641萌發(fā)過(guò)程中的種子為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)DNS法(3，5-二硝基水楊酸法)測(cè)定還原糖的條件進(jìn)行了研究，并采用蒽酮法測(cè)定總糖含量，分析了大麻種子在萌發(fā)過(guò)程中總糖和還原糖的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，DNS法測(cè)定還原糖的最佳檢測(cè)條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm，DNS用量2 mL，顯色時(shí)間7 min。在種子萌發(fā)過(guò)程中還原糖和總糖的含量表現(xiàn)出先下降后上升，但整體呈上升趨勢(shì)，其中，云麻1號(hào)和M641的總糖含量總體升幅分別為158%和78%，還原糖含量總體升幅分別為671%和703%。本研究探明了大麻種子萌發(fā)過(guò)程中總糖和還原糖含量的變化，可為大麻種子萌發(fā)機(jī)理研究提供參考，同時(shí)也可為今后大麻植物及種子中的還原糖和總糖的測(cè)定提供借鑒。

大麻種子；總糖；還原糖；DNS法；蒽酮法

大麻(Cannabissativa. L)為大麻科大麻屬一年生草本植物，是一種具有悠久種植歷史的傳統(tǒng)作物，集藥用、紡織、造紙和食用、飼用等多種用途于一身[1]。目前，隨著對(duì)其藥用價(jià)值的深入研究和市場(chǎng)認(rèn)知度的不斷提高，大麻產(chǎn)業(yè)已成為中國(guó)乃至全世界應(yīng)用廣泛、頗具競(jìng)爭(zhēng)力的新興產(chǎn)業(yè)。大麻種子作為大麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，其品質(zhì)優(yōu)劣和萌發(fā)機(jī)制決定著播種后能否正常萌發(fā)和生長(zhǎng)。因此，只有嚴(yán)格把好種子這一關(guān)，才能保障大麻產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。

目前，在大麻種子方面的研究?jī)H見(jiàn)大麻種子發(fā)芽條件、種子生活力及抗炎活性成分或大麻籽仁組分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面的零星報(bào)道[2-5]，而對(duì)其萌發(fā)期間總糖和還原糖含量的變化尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)。雖然目前有不少采用DNS法測(cè)定還原糖或多糖的研究，但是不同測(cè)量對(duì)象其測(cè)定條件也存在一定差異[6，7]。因此，本研究對(duì)影響其測(cè)定結(jié)果最關(guān)鍵的因素如檢測(cè)波長(zhǎng)、DNS用量和顯色時(shí)間等進(jìn)行探討，并進(jìn)行方法學(xué)考察。同時(shí)，采用DNS法和蒽酮法建立大麻種子中還原糖和總糖的測(cè)定方法，并對(duì)其萌發(fā)過(guò)程中還原糖和總糖的含量進(jìn)行測(cè)定，探究其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為研究大麻種子萌發(fā)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

本地主栽工業(yè)大麻品種云麻1號(hào)和云南地方品種M641的種子。2015年12月于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所工業(yè)大麻良種繁育基地收獲，選取成熟良好、外觀均勻一致的種子常溫保存2個(gè)月)。

BIOMATE 3S紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNS試劑和標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(1 mg/mL)的配制參照舒馨等研究方法配制[7]。

蒽酮試劑和標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(100 μg/mL)的配制參照劉海英和李文硯等方法配制[8-9]。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 樣品制備 稱取大麻種子2.0 g，用濾紙床播種，于28℃暗培養(yǎng)[10]。從大麻種子吸脹開(kāi)始，分別于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、42 h、54 h、66 h、78 h、102 h取樣，將樣品烘干后研磨備用。

1.3.2 供試品樣液的制備 精密稱取經(jīng)研磨的大麻種子樣品1.0 g置入50 mL錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水混勻，于50℃水浴保持60 min，過(guò)濾收集濾液至100 mL容量瓶中冷卻定容[11]。

1.3.3 DNS比色法測(cè)定還原糖實(shí)驗(yàn)方法的確立

1.3.3.1 DNS法測(cè)定波長(zhǎng)的確定

取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及1 mL蒸餾水分別置于10 mL試管中，再各加入2 mL DNS試劑，沸水浴加熱7 min，流水冷卻，蒸餾水定容。將葡萄糖顯色液-水(空白)、DNS試劑-水、葡萄糖顯色液-DNS 試劑分別在波長(zhǎng)480～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.3.2 DNS試劑用量的確定

在精確加入1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的系列10 mL試管中，分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mL DNS 試劑，沸水浴加熱7 min，流水冷卻，蒸餾水定容。以相同條件下不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液作空白溶液，波長(zhǎng)530 nm下測(cè)定添加不同用量DNS 試劑溶液的吸光度值。

1.3.3.3 DNS試劑顯色時(shí)間的確定

取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及1 mL蒸餾水于系列10 mL試管中，分別加入2 mL DNS 試劑，置沸水浴中加熱反應(yīng)2、3、5、7、10、15、20 min，流水冷卻，蒸餾水定容。以相同條件下不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液作空白溶液，波長(zhǎng)530 nm下測(cè)定不同加熱時(shí)間溶液的吸光度值。

1.3. 4 DNS法測(cè)定還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.2 mL，再分別加入2 mL DNS顯色劑，沸水浴7 min后取出流水冷卻定容至25 mL的容量瓶中。以試劑空白為參比液，在波長(zhǎng)為530 nm下用分光光度計(jì)測(cè)定，每組測(cè)定三次，取平均值。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一還原糖供試品樣液，以1.3.3研究得到的檢測(cè)方法重復(fù)測(cè)定6次，記錄吸光度值，并計(jì)算其RSD值。

1.3.5.2 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知還原糖含量的同一批萌發(fā)大麻種子樣品1 g，共9份，按還原糖含量的80%、100%、120%分別加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品。其余按供試品樣液制備方法進(jìn)行制備并對(duì)還原糖含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.6 蒽酮法測(cè)定總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，再分別加入5 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min后取出流水冷卻，以試劑空白為參比液，在620 nm波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)定，每組測(cè)定三次，取平均值。

1.3.7 還原糖和總糖的測(cè)定 還原糖以1.3.3研究得到的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，總糖參照文獻(xiàn)采用蒽酮法進(jìn)行測(cè)定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNS法測(cè)定還原糖體系的優(yōu)化

2.1.1 DNS法測(cè)定波長(zhǎng)的確定 吸收光譜圖(圖1)顯示：在530 nm處顯色劑-水的吸光度值接近于0，葡萄糖顯色液-水和葡萄糖顯色液-顯色劑的吸光度值接近重合，因此，為了消除測(cè)定過(guò)程中顯色劑的影響，本研究最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為530 nm。

圖1 葡萄糖顯色液及對(duì)比溶液的吸收光譜圖Fig. 1 The absorption spectrum with glucose solution and contrast solution

2.1.2 DNS用量確定 由圖2可知，吸光度隨著DNS用量的增加呈現(xiàn)先增加后緩慢下降的趨勢(shì)，DNS用量在2.0 mL時(shí)，吸光度值達(dá)到最大且穩(wěn)定，因此本研究確定DNS的最佳用量為2 mL。

圖2 DNS用量對(duì)吸光度的影響Fig. 2 Effect of different DNS dosage on absorbance

2.1.3 DNS顯色時(shí)間的確定 從圖3可以看出，隨著水浴時(shí)間的增加，吸光度隨之增大，在水浴7 min時(shí)吸光度值最大，其后一直保持穩(wěn)定，因此，本研究選擇顯色時(shí)間為7 min。

圖3 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of the reaction time on absorbance

2.2 線性關(guān)系考察

以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，得到還原糖測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=23.239C+0.0125，R2=0.9994。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0.008～0.048 g/L 之間與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一還原糖供試品樣液依法重復(fù)測(cè)定6次，其吸光度值分別為0.075、0.075、0.074、0.076、0.075、0.077，n=6，RSD為1.37%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.3.2 回收率實(shí)驗(yàn) 還原糖供試品樣液的回收率如表1所示，說(shuō)明采用DNS法測(cè)定萌發(fā)大麻種子中的還原糖，方法可行，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表1 還原糖回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 The recovery of reducing sugar

2.4 蒽酮法測(cè)定總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)做圖，得到總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.025C+0.0181，R2=0.9993。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在0.0042～0.025 g/L 之間與吸光度線性關(guān)系良好。

表2 萌發(fā)過(guò)程中總糖(蒽酮法)和還原糖(DNS法)的含量變化Tab.2 The content of total sugar(by Anthrone method) and reducing sugar(by DNS method) in the process of germination

2.5 萌發(fā)過(guò)程中總糖和還原糖的含量及變化

不同萌發(fā)時(shí)期云麻1號(hào)和M641的總糖和還原糖含量變化見(jiàn)表2。從表2可以看出，隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)兩個(gè)品種的還原糖含量緩慢持續(xù)降低，至24 h達(dá)到最低，24 h后還原糖含量開(kāi)始增加；而總糖含量從萌發(fā)開(kāi)始一直持續(xù)降低直至54h降至最低，54 h后總糖含量開(kāi)始增加；在24 h～54 h內(nèi)，還原糖含量隨總糖含量的降低而升高，在54 h～102 h還原糖的含量隨總糖含量增加而增加。萌發(fā)至24h時(shí)，云麻1號(hào)和M641還原糖的含量分別下降82.9%和17.8%，萌發(fā)至102 h還原糖含量分別增加為原含量的7.71倍和8.03倍。萌發(fā)至54 h時(shí)，云麻1號(hào)和M641總糖的含量分別下降31.9%和47.8%，萌發(fā)至102 h總糖含量分別增加為原含量的2.58倍和1.78倍?？偟膩?lái)說(shuō)，在大麻種子萌發(fā)過(guò)程中無(wú)論是同一品種還是不同品種之間還原糖和總糖的變化趨勢(shì)基本一致，都呈現(xiàn)出先緩慢下降后上升的趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

3.1 DNS法是檢測(cè)各類植物及植物種子中還原糖和總糖的常用方法[7，12-13]，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，而且實(shí)用性強(qiáng)，已廣泛用于各種研究及生產(chǎn)上。本研究對(duì)影響還原糖測(cè)定的因素比如吸收波長(zhǎng)、顯色時(shí)間和顯色劑用量進(jìn)行了考察，關(guān)于波長(zhǎng)的選擇在已知文獻(xiàn)中已有不少研究，如在枸杞中采用的是540 nm[6]，在八角中采用的是489 nm[7]，在鐵皮石斛中是520 nm[11]，而在本研究中最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm，這可能與大麻作物種子成分特性及組成比例等因素有關(guān)。本研究最終確定的DNS法測(cè)定還原糖最佳體系為：檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm，DNS用量2 mL，顯色時(shí)間7 min。

3.2 工業(yè)大麻種子在萌發(fā)過(guò)程中其糖類物質(zhì)的變化規(guī)律是研究大麻種子萌發(fā)機(jī)理的重要方面。本文初步探明了工業(yè)大麻種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性總糖和還原糖的含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。研究結(jié)果顯示，大麻種子在整個(gè)萌發(fā)過(guò)程中還原糖和總糖的含量均是先下降后上升，其中，在0～54 h內(nèi)，總糖含量一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是萌發(fā)初期大麻種子在利用脂肪等大分子物質(zhì)之前優(yōu)先利用小分子糖[14-15]，而還原糖含量變化不明顯，雖然在24 h出現(xiàn)了一個(gè)較低值，但整體呈較穩(wěn)定的狀態(tài)。而萌發(fā)54 h后，總糖和還原糖的含量均呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，這可能與脂肪酶活性的不斷增加將粗脂肪降解轉(zhuǎn)化成糖類或是蛋白質(zhì)通過(guò)脫氨基作用轉(zhuǎn)化為糖類有關(guān)[16-17]。

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Dynamic Changes of Total and Reducing Sugar in the Germination Process of Hemp Seeds and Optimization of Test Method

GUORong1，GUOMeng-bi1，CHENXuan1，CHENQiu-yu2，XUYan-ping1，GUOHong-yan1，YANGMing1，ZHANGQing-ying1*(1.IndustrialCropResearchInstitute，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming，Yunnan650205，China； 2.GardenandHorticultureInstitute，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201，China)

Dynamic changes of total sugar (by Anthrone method) and reducing sugar (by DNS method) in the process of hemp seed germination were investigated using seeds from two hemp (CannabissativaL .) varieties YunMa 1 and M641. The results showed that the optimum determination wavelength of DNS method was 530 nm， the proper volume of DNS reagent was 2.0 mL， and the optimal time for colour reaction was 7 min. The contents of total and reducing sugar increased distinctly after a slow declining in early stages of the germination process. The contents of total sugar of YunMa 1 and M641 increased by 158% and 78% respectively， and the reducing sugar increased by 671% and 703% respectively. The dynamic changes of total and reducing sugar in the germination process of hemp seeds revealed in this paper could provide reference for the research of germination mechanism and also for the determination of carbonhydrate of hemp seeds.

hemp seed； total sugar； reducing sugar； 3，5-Dinitrosalicylic acid (DNS)； Anthrone

2016-10-12；

2017-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360350)；云南省重點(diǎn)新產(chǎn)品項(xiàng)目 (2016BB005)。

S563

A

1008-0457(2017)01-0050-04 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.009

*通訊作者：張慶瀅(1973-)，女，碩士，副研究員，主要研究方向：大麻資源與育種研究；E-mail：zhqy0033@sina.com。