黃小貞，趙懿琛

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025 )

·研究報(bào)告·

擬南芥PGK基因家族功能的初步分析

黃小貞1，趙懿琛2

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025 )

磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白家族，因而利用模式植物擬南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意義。擬南芥基因組中含有三個(gè)PGK基因家族成員(PGK1，PGK2和PGK3)，但是對(duì)于它們的基因表達(dá)模式和蛋白定位的研究還不是很清楚。本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了PGK基因家族的表達(dá)模式，結(jié)果表明三個(gè)PGK基因在擬南芥的各個(gè)組織器官和發(fā)育階段中都有表達(dá)。利用擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)三個(gè)PGK蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示PGK1和PGK3定位于細(xì)胞基質(zhì)，而PGK2定位于葉綠體。另外，我們分離得到了PGK2基因的T-DNA插入敲除突變體pgk2。pgk2在正常條件下表現(xiàn)出葉片黃化，PR1基因上調(diào)表達(dá)和H2O2過(guò)量積累等類似于超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡表型。進(jìn)一步的遺傳分析表明pgk2的細(xì)胞死亡表型和T-DNA插入位點(diǎn)緊密連鎖，暗示著pgk2的細(xì)胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的，因此PGK2可能在調(diào)控植物細(xì)胞程序化死亡過(guò)程中有重要作用。以上研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步探討PGK基因家族的功能具有重要的參考價(jià)值。

擬南芥；PGK基因家族；蛋白定位；細(xì)胞死亡

糖酵解是生命有機(jī)體能量代謝最重要的途徑之一，而磷酸甘油酸激酶(PGK，EC2.7.2.3)則在這個(gè)生理過(guò)程中有重要作用。在糖酵解第二個(gè)階段的第二步中，PGK作為關(guān)鍵酶催化1，3-二磷酸甘油酸(1，3-BPG)生成對(duì)3-磷酸甘油酸(3-PG)的可逆反應(yīng)：

對(duì)于大多數(shù)生物來(lái)說(shuō)是非常必要的，涉及到需氧菌的ATP產(chǎn)生、厭氧菌的發(fā)酵以及植物中碳的固定等[1]。在原核細(xì)胞中，PGK只有一種存在形式；而在大多數(shù)真核生物體內(nèi)，則含有2～3種PGK同工酶。這些同工酶不僅在生物體內(nèi)分布不同，還具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。PGK的編碼序列在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中都高度保守，該酶功能基因的突變會(huì)引起生物體各種代謝紊亂和異常。在微生物和動(dòng)物中，關(guān)于PGK突變的報(bào)道相對(duì)比較多[2]。大量研究表明，人類的PGK基因在神經(jīng)功能的紊亂、橫紋肌溶解以及腫瘤的生長(zhǎng)等方面有重要作用[3]；哺乳動(dòng)物中，PGK還具有二硫化物還原酶的催化活性[4]。在植物中，關(guān)于PGK蛋白晶體結(jié)構(gòu)以及酶的核心催化位點(diǎn)的報(bào)道研究較多[5，6]，而對(duì)PGK的基因表達(dá)和蛋白定位等生物學(xué)功能方面研究的比較少。近年來(lái)，雖然也有一些證據(jù)表明植物中的PGK可能涉及到生物脅迫和非生物脅迫的抗性反應(yīng)[7-9]，但總體而言，植物中PGK的功能仍然很不清楚。本文以模式植物擬南芥為研究對(duì)象，系統(tǒng)分析了擬南芥中三個(gè)PGK成員：PGK1、PGK2和PGK3的基因時(shí)空表達(dá)模式、蛋白定位以及可能的基因功能。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用材料是擬南芥(Arabidopsisthalinan)，其中野生型Columbia(Col-0)生態(tài)型和突變體Salk_071724均購(gòu)買自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center， ABRC)。植株生長(zhǎng)在光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度22℃左右的溫室中。

1.2 基因表達(dá)分析

用TRIZOL(Invitrogen)試劑提取各個(gè)植物組織的總RNA。之后用RNase free DNase(Takara)在37℃處理20 min，充分降解基因組DNA。取2 μg RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)和Oligo dT21合成cDNA鏈。設(shè)計(jì)基因特異的熒光定量PCR引物(PGK1-F：5′-ATGGCTTCCGCTGCCGCAAG-3′和PGK1-R： 5′-GAAGCTCGGAGAGCCTAGGGA-3′；PGK2-F：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和PGK2-R： 5′-AGTGACTGGCGTTGCTTCATC-3′；PGK3-F：5′-ACACAGTTGACATCCTCCTGC-3′和PGK3-R： 5′-TAGAGATGTGGCTCATCTTGTC-3′)；采用參考文獻(xiàn)[10]描述的方法進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)三個(gè)基因的表達(dá)模式，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[11]。

1.3 蛋白定位載體的構(gòu)建

用兩步克隆法構(gòu)建PGK1、PGK2和PGK3三個(gè)蛋白的定位載體。第一步：設(shè)計(jì)擴(kuò)增三個(gè)基因全長(zhǎng)編碼區(qū)域(Coding DNA Sequence：CDS)的引物(PGK1-F(EcoRI)：5′-GAATTCCACATGGCTTCCGCTGC-3′和PGK1-R(Stu1)：5′-AGGCCTAACAGTGACTGGGATTG-3′； PGK2-F(BamHI)：5′-GGATCCCTCACTTTCACTCTCACTA-3′和 PGK2-R(StuI)：5′-AGGCCTAACAGTGACTGGCGTTGCTTCA-3′； PGK3-F：5′-ATGGCGACGAAGAGAAGCGTT-3′和PGK3-R(SmaI)： 5′-CCCGGGAGCTTCGTCGAGAGCGAG-3′)；以Col-0野生型的cDNA為模板，用高保真酶(Takara)擴(kuò)增出三個(gè)基因的CDS，連接T載體(Takara)送去測(cè)序。第二步，測(cè)序正確后從T載體上切下目的片段連接到C-端接有熒光蛋白(Green Fluorescent Protein： GFP)的定位載體[12]。

1.4pgk2純合突變體的鑒定

設(shè)計(jì)兩對(duì)鑒定引物(PGK2-P1：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和PGK2-P2：5′- GCAGTTGATTGATGTTTTGCTC-3′； 和PGK2-P1：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和LB： 5′-GCTGTTGCCCGTCTCACTGGTG-3′)利用PCR檢測(cè)出相應(yīng)的純合體。其中，P1/P2引物是根據(jù)T-DNA插入位置設(shè)計(jì)的基因特異的序列，LB是Salk突變體特異的插入序列。判斷突變體為純合體需要同時(shí)滿足：1.第一對(duì)引物PGK2-P1/ PGK2-P2在野生型(對(duì)照)中能得到大小符合PGK2-P1/LB特異基因序列長(zhǎng)度的 PCR片段，而在純合插入突變體中這對(duì)引物不能得到PCR產(chǎn)物；2.第二對(duì)引物PGK2-P1/LB在野生型(對(duì)照)中不能得到PCR產(chǎn)物，而在純合插入突變體中這對(duì)引物能得到大小符合T-DNA插入位置與基因序列中P1或P2距離長(zhǎng)度匹配的片段。

1.5 細(xì)胞死亡檢測(cè)

用伊文斯蘭(Evans Blue)染色劑，檢測(cè)死亡細(xì)胞[13]。首先將所要檢測(cè)的葉片剪下，浸泡在水溶的0.1% 伊文斯蘭溶液中，利用真空泵抽真空10 min，然后保持真空狀態(tài)30分鐘，重復(fù)該過(guò)程一次。之后，取出室溫放置4～6 h，將染色后的葉片用PBS緩沖液(0.2 M NaCl， 2.6 mM KCl， 10 mM KH2PO4， 1 mM K2HPO4， pH 7.4， 0.05% 吐溫20)清洗葉片數(shù)次，葉片上的藍(lán)色斑點(diǎn)即代表死亡的細(xì)胞。

1.6 過(guò)氧化氫檢測(cè)

用二氨基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)檢測(cè)過(guò)氧化氫積累。首先將要檢測(cè)的葉片剪下，浸泡在含有1 mg/mLDAB(pH 3.8)的溶液中過(guò)夜；之后用清水漂洗數(shù)次，然后再把葉片放進(jìn)體積比為1∶1∶3的乙酸∶甘油∶乙醇的混合液中，煮沸5～10 min進(jìn)行脫色處理。最后觀察葉片，棕色的部分即代表有過(guò)氧化氫積累。

1.7 原生質(zhì)體制備和蛋白定位

制備完整原生質(zhì)體的試劑和方法主要參考文獻(xiàn)[14]。首先，將在短日照條件下生長(zhǎng)良好的野生型葉片，用鋒利的小刀切成1 cm 寬的葉條，然后將葉條浸泡在酶解緩沖液中(500 mM mannitol， 10 mM CaCl2， 5 mM MES/KOH (pH 5.5)， 3% cellulase， and 0.75% Macerozym)，并置于搖床中輕搖、酶解4～6 h；酶解過(guò)程中通過(guò)顯微鏡檢查酶解效果，以能夠觀察到較多原生質(zhì)體為最佳酶解時(shí)間。酶解完成后，利用60 mm 的尼龍膜(Saryu Textiles， Mumbai， India)收集過(guò)濾去掉雜質(zhì)；并用懸浮緩沖液清洗原生質(zhì)體(0.65 M sorbitol， 1 mM CaCl2， 0.5 mM MgCl2and 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid(HEPES)-KOH， pH 7.0)，最后低速離心收集原生質(zhì)體。將帶有GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體建好之后，用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取相應(yīng)質(zhì)粒，利用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中，溫室培養(yǎng)12 h后用激光共聚焦顯微鏡(LSM510， Carl Zeiss， Oberkochen， Germany)觀察蛋白定位情況。掃描程序采用紅綠光雙通道掃描模式，用488 nm的波長(zhǎng)激發(fā)GFP綠色熒光，用543 nm波長(zhǎng)激發(fā)葉綠體自發(fā)紅光。實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)轉(zhuǎn)化帶有GFP的空載體作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥中PGK基因家族的氨基酸序列同源性比較

早期研究結(jié)果表明，擬南芥含有三個(gè)PGK的同工酶[15]，分別是PGK1(AT3G12780)、PGK2(AT1G56190)和 PGK3(AT1G79550)。根據(jù)公布的擬南芥Col野生型基因組序列(http：//www.arabidopsis.org/)，PGK1編碼481個(gè)氨基酸，PGK2編碼478個(gè)氨基酸，PGK3編碼401個(gè)氨基酸。通過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)和網(wǎng)站BLAST (http：//www.arabidopsis.org/cgi-bin/wublast/wublast)發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)基因的氨基酸序列相似度較高 (圖1)。其中，PGK1和PGK2的同源性達(dá)到87%，PGK1、PGK2與PGK3的同源性都為76%。

2.2 擬南芥PGK基因的組織表達(dá)模式檢測(cè)

為了更好的了解PGK1、PGK2和PGK3基因的表達(dá)特點(diǎn)，我們檢測(cè)了PGK1、PGK2和PGK3在野生型的各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況。如圖2所示，PGK三個(gè)基因的組織表達(dá)特異性各有不同，但整體在植株的根、幼苗、成熟苗、莖、開放的花器官和果莢都有表達(dá)。PGK1和PGK3在幼苗中的表達(dá)量比在成熟苗中的表達(dá)量高，并且它們?cè)诨ㄆ鞴僦械谋磉_(dá)量也比較高，而在根和莖中的表達(dá)量則相對(duì)比較低。PGK2基因則主要是在成熟苗中表達(dá)比較強(qiáng)，在根、莖、花和果莢等器官中表達(dá)相對(duì)較弱。

2.3 擬南芥PGK家族的蛋白定位分析

為了更好的了解PGK1、PGK2和PGK3蛋白的生物學(xué)功能和定位，我們構(gòu)建了它們的全長(zhǎng)CDS連接熒光蛋白GFP的定位載體，利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行定位觀察。結(jié)果如圖3所示：對(duì)照組單獨(dú)轉(zhuǎn)化帶有GFP的空載體顯示熒光信號(hào)在整個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)；而PGK1和PGK3這兩個(gè)蛋白則主要在細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)；PGK2的熒光信號(hào)很明顯共定位于自發(fā)紅光的葉綠體中，兩種信號(hào)完全重疊，顯示出黃色，這個(gè)結(jié)果充分說(shuō)明PGK2共定位于葉綠體中。

圖1 擬南芥中PGK三個(gè)同源基因的氨基酸序列比較Fig. 1 Comparison of amino acid sequences of three PGK homologous genes in Arabidopsis thaliana

圖2 擬南芥中三個(gè)PGK的基因表達(dá)模式比較

Fig.2 Gene expression pattern of threePGKsinArabidopsisas identified by quantitative real-time PCR

圖3 擬南芥原生質(zhì)體中三個(gè)PGK基因的蛋白定位

Fig.3 Localization of the PGK1、PGK2 and PGK3 proteins inArabidopsisprotoplast

2.4PGK2敲除突變體pgk2的表型和遺傳分析

為了更好的研究PGK基因家族功能，我們從ABRC訂購(gòu)了PGK1、PGK2和PGK3的T-DNA插入突變體，鑒定出純合體后分別命名為pgk1、pgk2和pgk3。其中，pgk1和pgk3的純合體，在正常生長(zhǎng)條件下沒(méi)有表現(xiàn)出任何表型。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)pgk2在正常生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)葉片黃化萎蔫的表型(圖4.a)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在pgk2中，PGK2基因基本不表達(dá)(圖4.b)，因此pgk2 確實(shí)是PGK2的功能缺失突變體。進(jìn)一步用伊文斯蘭和DAB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該突變體中積累了大量的死細(xì)胞(圖4.c)和過(guò)氧化氫(圖4.d)，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)蛋白(Pathogen Proteins， PRs)PR1在pgk2中被顯著上調(diào)了(圖4.e)，因此pgk2表現(xiàn)出植物程序化細(xì)胞死亡(Programmed cell death， PCD)的表型。PCD信號(hào)的形成通常伴隨著一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，包括細(xì)胞死亡，活性氧、水楊酸的大量積累和病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。pgk2具有類似PCD的表型，并且這種表型隨著植株的生長(zhǎng)而增強(qiáng)，無(wú)法完成開花結(jié)果最終死亡。

圖4 pgk2的細(xì)胞死亡表型Fig.4 The cell death phenotype of pgk2 plants

為了進(jìn)一步分析該突變體的遺傳特性，我們檢測(cè)了pgk2與野生型回交F1代和F2代。所有的F1代(N= 20)表現(xiàn)出野生型正常的表型，表明pgk2的細(xì)胞死亡表型是隱性基因控制的。360 株F2代中，突變型和野生型分別為 91株和269株，經(jīng)分離х2檢測(cè)比率符合1∶3 (х2= 0.061，p= 0.05)，表明pgk2的細(xì)胞死亡表型是單基因控制的。進(jìn)一步分析顯示，所有細(xì)胞死亡的pgk2突變體都具有卡那鏈霉素抗性(Kan-R)，并且都是T-DNA插入純合突變體(圖4.f)。從F2中隨機(jī)選擇具有Kan-R的細(xì)胞死亡突變體200株，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡表型植株和野生型植株分別為 64株和136株，經(jīng)х2檢測(cè)兩種表型符合1∶2(х2= 0.202，p<0.05)。因此，遺傳分析結(jié)果說(shuō)明pgk2細(xì)胞死亡的表型是和T-DNA插入位點(diǎn)緊密連鎖的，該結(jié)果暗示著pgk2的細(xì)胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的。

3 結(jié)論與討論

PGK廣泛存在于原生動(dòng)物、植物、線蟲以及哺乳動(dòng)物中，是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白家族，它們?cè)诩?xì)胞代謝過(guò)程中扮演著重要的角色[16-19]。擬南芥核基因組編碼三個(gè)PGK基因，Laurence Ouibrahim等通過(guò)生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)這三個(gè)基因在各個(gè)組織器官中廣泛表達(dá)[8]。本研究的熒光定量結(jié)果表明，擬南芥PGK三個(gè)基因確實(shí)在植株的根、幼苗、成熟苗、莖、開放的花器官和果莢中都有表達(dá)。其中PGK1和PGK3表達(dá)模式較為相似，暗示著它們可能在相同的組織部位和發(fā)育階段中起作用。但是這兩個(gè)蛋白同源關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，可能在功能上進(jìn)行相互補(bǔ)充。

蛋白的亞細(xì)胞定位對(duì)于基因生物學(xué)功能的執(zhí)行非常重要，有研究表明植物體內(nèi)至少存在著兩種定位類型的PGK同工酶[20，21]，分別是細(xì)胞質(zhì)中的PGK(cPGK)和質(zhì)體中的PGK(pPGK)[22]。雖然它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上非常相似，但各自承擔(dān)的功能不同。一般認(rèn)為胞質(zhì)中的cPGK主要參與糖酵解過(guò)程，而質(zhì)體中的pPGK則涉及到卡爾文循環(huán)中光合碳還原過(guò)程[8，22]。目前，關(guān)于擬南芥中PGK蛋白在原生質(zhì)體中的定位研究還沒(méi)有任何報(bào)道。本研究首次利用原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法確定了這三個(gè)蛋白的定位，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中確實(shí)存在兩種定位類型的PGK蛋白，與前人報(bào)道相符。研究結(jié)果表明PGK2定位于葉綠體中，而PGK1和PGK3則主要在細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)。PGK1和PGK2氨基酸序列相似程度較高，暗示它們可能起源于相同類型的PGK同工酶；但它們的組織表達(dá)模式和蛋白定位的不同，則表明這兩個(gè)蛋白在植物的不同發(fā)育階段和細(xì)胞的不同區(qū)域中起作用。糖酵解的過(guò)程主要是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，Atsushi Ikemoto認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)中的PGK負(fù)責(zé)糖酵解中至關(guān)重要的底物水平磷酸化[23]，PGK1和PGK3都定位于細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明這兩個(gè)基因主要功能可能是作為糖酵解的關(guān)鍵酶。因?yàn)镻GK1和PGK3的基因表達(dá)模式相近，定位相同，說(shuō)明它們可能存在著功能上的冗余，這兩個(gè)基因的敲除突變體pgk1和pgk3都沒(méi)有表現(xiàn)出明顯發(fā)育上的缺陷，也間接證實(shí)了這一點(diǎn)。

PGK2作為擬南芥中唯一定位于葉綠體的磷酸甘油酸激酶，它的功能研究得還不是很清楚。Laurence Ouibrahim發(fā)現(xiàn)PGK2的氨基酸發(fā)生突變，能改變植株對(duì)西瓜花葉病毒的抗性[8]。Rohit Joshi認(rèn)為在煙草中異位表達(dá)水稻的OsPGK2能改變轉(zhuǎn)基因煙草耐受鹽脅迫的能力[7]。本研究從擬南芥T-DNA突變體庫(kù)中篩選到PGK2的基因敲除突變體pgk2。利用PCR和遺傳分析，我們確認(rèn)了PGK2 基因中的T-DNA插入和pgk2 突變體中的PCD表型緊密連鎖，暗示著pgk2的PCD表型可能是由于PGK2的基因缺失造成的。PCD是生物體為調(diào)節(jié)自身動(dòng)態(tài)平衡，主動(dòng)清除有害或者多余細(xì)胞的一種受遺傳調(diào)控的生理過(guò)程[24]。植物中的PCD過(guò)程在某些方面和動(dòng)物的細(xì)胞凋亡存在類似之處，都會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核迅速破裂、染色質(zhì)凝聚、DNA 片段化等特征[25]。大量的研究結(jié)果表明，光照、ROS、激素、代謝酶，特別是葉綠體相關(guān)的代謝酶都參與了植物的PCD過(guò)程[26-29]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉綠體蛋白PGK2作為細(xì)胞代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶可能也參與了植物PCD的形成過(guò)程。以上研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步探討擬南芥以及其它生物體中的PGK家族基因功能具有重要的理論指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

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Functional analysis ofPGKgene family in Arabidopsis

HUANGXiao-zhen1，ZHAOYi-chen2

(1.TheKeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation)，InstituteofAgro-BioengineeringandCollegeofLifeSciences，Guiyang，Guizhou550025，China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

Phosphoglycerate kinase (PGK) belongs to an evolutionarily conserved protein family. Therefore， investigation of the functions of PGK gene family using model plant Arabidopsis thaliana has universal significance. The genome of Arabidopsis thaliana contains three members of PGK gene (PGK1，PGK2 and PGK3)， but the biological roles of these members are still unclear. In the present study， we examined the expression profiles ofPGKgene family using real-time fluorescence quantitative PCR. Our findings suggested that all three members of PGK gene are able to express in different tissues in different development stages and its expression was tissue-specific and developmentally controlled. Meanwhile， the subcellular localizations of PGK proteins were analysed using the transient transformation of Arabidopsis protoplast. The results demonstrated that the PGK1 and PGK3 proteins were localized in the cytoplasm， while PGK2 localized in the chloroplast. Additionally we also isolated a putative PGK2 gene knockout mutant:pgk2. Interestingly，pgk2 exhibited hypersensitive response-like (HR) phenotypes under normal conditions. Further genetic analysis reveals that the HR-like phenotype is tightly linked to the T-DNA insertion at a single locus， which suggests PGK2’s involvement in the regulation of plant programmed cell death. These data will be helpful in gaining a deeper understanding of the functions ofPGKgene family in plant.

Arabidopsisthaliana;PGKgene family; protein localization; cell death

2016-09-18；

2016-11-07

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2015]2053號(hào))；貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目合同(貴大人基合字[2014]63號(hào))。

Q94

A

1008-0457(2017)01-0012-06 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.002

*通訊作者：黃小貞(1982-)，女，博士，講師，從事植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆分子機(jī)制研究；E-mail：xzhuang@gzu.edu.cn。