孫昊，牛紅軍，王芃

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

酶-微波聯(lián)用法提取枸杞總黃酮

孫昊，牛紅軍，王芃*

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350）

研究酶-微波聯(lián)用法提取枸杞總黃酮的最佳工藝條件。采用纖維素酶提取枸杞總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)研究乙醇濃度、酶解溫度和酶解pH值對(duì)提取率的影響，確定最佳酶解條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)確定微波提取的最佳工藝參數(shù)，采用微波法進(jìn)一步提取酶解液中的枸杞總黃酮。酶解階段最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度45%，酶解溫度50℃，酶解pH4.0；微波階段的最佳工藝參數(shù)為：液固比30 mL/g，微波溫度65℃，微波時(shí)間4 min。該酶-微波聯(lián)用法提取枸杞總黃酮的提取率達(dá)1.560%。

枸杞子；總黃酮；纖維素酶；微波

枸杞子是傳統(tǒng)藥食兩用植物枸杞的干燥成熟果實(shí)，性甘，味平，歸肝、腎經(jīng)。隨著研究深入，其應(yīng)用價(jià)值逐漸顯現(xiàn)，在食品、保健品和醫(yī)藥中的應(yīng)用引起了重視，已形成綜合利用枸杞的產(chǎn)業(yè)鏈[1]。枸杞總黃酮是枸杞子中重要的活性物質(zhì)之一[2]，藥理學(xué)研究表明其具有降低血糖、抗脂肪肝、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗抑郁和抑制腫瘤等[3-6]功能。

目前，提取枸杞總黃酮的方法主要有微波輔助提取法、索氏提取法和超聲提取法等[7-9]，具有所需設(shè)備簡(jiǎn)易和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但枸杞總黃酮提取率仍有待提高。纖維素和半纖維素等是植物細(xì)胞壁的主要成分，纖維素酶能破壞細(xì)胞壁，利于枸杞總黃酮向胞外擴(kuò)散，提高提取率，利用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等提取活性成分的酶法是一種新型提取方法。微波提取具有提取效率高、雜質(zhì)少和溶劑用量少等特點(diǎn)。已有將酶法和微波法共同使用的酶-微波聯(lián)用法用于提取中藥材中黃酮的報(bào)道[10]。本試驗(yàn)利用酶-微波聯(lián)用法對(duì)提取枸杞總黃酮的工藝進(jìn)行研究，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到了提取枸杞總黃酮的最佳提取條件，為提高枸杞總黃酮提取率，進(jìn)一步促進(jìn)枸杞子中黃酮的應(yīng)用提供了參考。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

枸杞：產(chǎn)自寧夏中寧，干燥、粉碎，過(guò)篩取60目～80目枸杞粉，備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：上海圻明科技有限公司；纖維素酶（400 U/mg）：南京奧多福尼生物科技有限公司；亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器

UV-1800PC型紫外/可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；MAS-II型常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；ME204E型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝及優(yōu)化

稱量適量枸杞粉，以石油醚為溶劑索氏除脂，干燥。定量加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的纖維素酶，控制酶解溫度和溶液pH值，酶解一定的時(shí)間制得枸杞酶解混合物，真空抽濾，得酶法枸杞總黃酮提取液，測(cè)定其總黃酮濃度，得出總黃酮提取率。以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)纖維素酶用量、乙醇濃度、液固比、酶解溫度、酶解pH值和酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶法提取的工藝。

參照以上優(yōu)化后的酶解方案制備酶法枸杞總黃酮提取液，調(diào)整液固比，設(shè)定微波溫度，微波輔助提取一定時(shí)間后，趁熱真空抽濾，收集濾液，得酶-微波聯(lián)用法枸杞總黃酮提取液，測(cè)定總黃酮濃度，得出總黃酮提取率。以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)微波溫度、微波時(shí)間和液固比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化微波提取階段工藝。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于50 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，配制濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移入10 mL容量瓶，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，放置6min；再加入4%NaOH溶液4.0mL，用60%乙醇定容，搖勻，放置15 min。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值Y為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=10.870X+0.007 1，R=0.999 2。

2.3 樣品中總黃酮提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1 mL適當(dāng)稀釋后的提取液至10 mL容量瓶中，參照項(xiàng)目2.2采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法顯色，定容。在510 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算總黃酮提取率。

2.4 酶解提取階段條件的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

2.4.1.1 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，以液固比25 mL/g加入50%乙醇溶液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纖維素酶，在pH4.5，45℃條件下酶解2 h，結(jié)果見圖1。

圖1 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1Effect of enzyme dosage on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

總黃酮提取率隨酶用量增加而顯著增大，酶用量達(dá)0.3%時(shí)提取率為1.09%，之后，酶用量繼續(xù)增加對(duì)提取率影響不再顯著，綜合提取率和成本因素考慮，酶用量為0.3%較適宜。

2.4.1.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，以液固比25 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)為40%、45%、50%、55%和60%的乙醇溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的纖維素酶，在pH4.5，45℃條件下酶解2 h，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2Effect of enzymolysis ethanol concentration on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

乙醇濃度增加，總黃酮提取率提高，當(dāng)乙醇濃度50%時(shí)達(dá)到最大值，之后顯著降低?？赡苁怯捎阼坭娇傸S酮極性較大，乙醇濃度過(guò)高導(dǎo)致極性降低反而不利于總黃酮溶解。

2.4.1.3 液固比對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，分別以液固比15、20、25、30、35 mL/g加入不同體積的50%乙醇溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的纖維素酶，在pH4.5，45℃條件下酶解2 h，結(jié)果見圖3。

圖3 液固比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3Effect of enzymolysis liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

加大溶劑體積，能使溶劑中總黃酮維持低濃度，使枸杞粉與溶劑中總黃酮有較大的濃度差，利于總黃酮溶出。隨著溶劑量增加，總黃酮溶出已較充分，即使繼續(xù)加大溶劑體積也無(wú)法持續(xù)使總黃酮提取率提高，結(jié)合節(jié)約溶劑的需要，認(rèn)為液料比20 mL/g較適宜。

2.4.1.4 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的纖維素酶，pH4.5條件下，分別35、40、45、50、55、60℃酶解提取2 h，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4Effect of enzymolysis temperature on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

溫度對(duì)總黃酮提取率影響顯著，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，總黃酮提取率明顯較高，表明50℃為酶的最佳酶解溫度，枸杞細(xì)胞壁破壞效果較好，利于總黃酮溶出。

2.4.1.5 酶解pH值對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的纖維素酶，分別在pH值3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0條件下，50℃酶解提取2 h，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5Effect of enzymolysis pH on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

pH4.0時(shí)，總黃酮提取率最高，表明復(fù)合酶在pH4.0溶液中活性最大，利于總黃酮溶出。隨著pH值增大，酶的酶解能力下降，不能較好破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，總黃酮提取率降低。

2.4.1.6 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

取2 g枸杞粉，以液固比20 mL/g加入50%乙醇溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的纖維素酶，在pH4.0，50℃條件下分別酶解提取1、1.5、2、2.5、3 h，結(jié)果見圖6。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6Effect of enzymolysis time on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

隨著酶解時(shí)間增加，提取率隨之明顯提高，時(shí)間大于2 h后提高緩慢，提取3 h僅比2.5 h提取率高0.02%。結(jié)果表明，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間利于總黃酮的提取，但當(dāng)達(dá)到2.5 h時(shí)提取已較充分，即使延長(zhǎng)提取時(shí)間也不能明顯提高提取率，從節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間考慮，2.5 h為較適宜的提取時(shí)間。

2.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)提取率影響較大的因素：乙醇濃度、酶解溫度和酶解pH值，以總黃酮提取率作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)的酶解提取工藝。因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment

表2 酶解提取正交試驗(yàn)Table 2Design and results of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis phase

表3 方差分析結(jié)果Table 3The results of variance analysis

由表2和表3可知，各因素對(duì)枸杞總黃酮提取率的影響大小次序?yàn)椋好附鈖H值＞酶解溫度＞乙醇濃度，其中酶解pH值和酶解溫度有顯著影響。最佳的提取工藝條件為A1B2C2，即乙醇濃度45%，酶解溫度50℃，酶解pH4.0。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化得到的最佳酶解提取工藝提取枸杞總黃酮，重復(fù)3次。該提取工藝較穩(wěn)定，得率分別為1.378%、1.376%和1.401%，平均值為1.378%。即酶法提取枸杞總黃酮的提取率達(dá)1.378%。

2.5 微波階段提取條件的優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn)

2.5.1.1 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

設(shè)定微波溫度為60℃，取酶法枸杞總黃酮提取液，添加45%乙醇至液固比25 mL/g，分別微波輻射2、3、4、5、6 min，考察微波輻射時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.7Effect of time on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

當(dāng)微波4min時(shí)，提取率最高，之后下降。說(shuō)明微波作用促進(jìn)了總黃酮溶解，但微波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能對(duì)總黃酮造成破壞，故4 min為較適宜的微波提取時(shí)間。

2.5.1.2 微波溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

取酶法枸杞總黃酮提取液，添加45%乙醇至液固比25 mL/g，分別設(shè)定微波溫度為55、60、65、70、75℃，微波輻射4 min，考察微波溫度對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.8Effect of temperature on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

隨著微波溫度升高，總黃酮提取率不斷增大，65℃總黃酮提取率達(dá)最大值。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，提取率下降，可能溫度過(guò)高導(dǎo)致總黃酮被破壞，提取所得總黃酮量減少。因此，65℃為較適宜的微波提取溫度。

2.5.1.3 液固比對(duì)總黃酮提取率的影響

設(shè)定微波溫度為65℃，取酶法枸杞總黃酮提取液，以45%乙醇將液固比分別調(diào)整為20、25、30、35、40 mL/g，微波輻射4 min，考察液固比對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 液固比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.9Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids from Lycium barbarum L.

隨著溶劑量增加，提取率呈先增大、后減小的趨勢(shì)。25 mL/g時(shí)提取率最高，當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增大時(shí)，提取率下降，可能是溶劑量過(guò)大導(dǎo)致微波衰減，提取效果變差。因此，25 mL/g為較適宜的液固比。

2.5.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率作為考察指標(biāo)，對(duì)液固比、微波溫度和微波時(shí)間3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)的微波提取工藝。因素水平見表4，試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 正交試驗(yàn)因素及水平表Table 4Factors and levels of orthogonal experiment

表5 酶-微波聯(lián)用法微波提取階段正交試驗(yàn)Table 5Design and results of orthogonal experiment

表6 方差分析結(jié)果Table 6The results of variance analysis

由表5和表6可知，各因素對(duì)微波提取階段枸杞總黃酮提取率的影響大小次序?yàn)椋阂汗瘫龋疚⒉〞r(shí)間＞微波溫度，其中液固比和微波時(shí)間有顯著影響。最佳的提取工藝條件為A3B2C2，即液固比30 mL/g，微波溫度65℃，微波時(shí)間4 min。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化得到的最佳微波提取階段工藝參數(shù)提取枸杞總黃酮，重復(fù)3次。得率分別為1.562%、1.563%和1.556%，平均值為1.560%，優(yōu)化所得工藝參數(shù)有效、穩(wěn)定。即優(yōu)化的酶-微波聯(lián)用法所提取枸杞總黃酮的提取率達(dá)1.560%。

2.6 比較試驗(yàn)

參照2.5優(yōu)化得到的微波階段的最佳提取工藝，取2 g枸杞粉，加入45%乙醇溶液，以液固比30 mL/g浸泡2.5 h后，在65℃，微波提取4 min，制得微波法枸杞總黃酮提取液。重復(fù)3次，枸杞總黃酮的提取率分別為1.10%、1.12%和1.09%，平均值為1.10%，即微波法提取枸杞總黃酮的提取率為1.10%。

結(jié)果表明，酶-微波聯(lián)用法提取枸杞總黃酮的效率明顯高于微波法和酶法。

3 結(jié)論

1）在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化酶法提取枸杞總黃酮的工藝參數(shù)，并進(jìn)一步優(yōu)化得到酶-微波聯(lián)用法提取枸杞總黃酮的工藝參數(shù)。得出酶解階段最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度45%，酶解溫度50℃，酶解pH4.0；微波階段的最佳工藝參數(shù)為：液固比30 mL/g，微波溫度65℃，微波時(shí)間4 min。該酶-微波聯(lián)用法能使枸杞總黃酮提取率達(dá)1.560%。

2）比較酶-微波聯(lián)用法、酶法和微波法3種提取方法對(duì)枸杞總黃酮提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶-微波聯(lián)用法提取率最高，比酶法和微波法分別增加了13.2%和42%。因此，酶-微波聯(lián)用法是一種較好的提取枸杞總黃酮方法，能很好地用于制備枸杞總黃酮。

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Study on Extraction of Total Flavonoids in Lycium barbarum L.with the Enzyme-Microwave Extraction Method

SUN Hao，NIU Hong-jun，WANG Peng*
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

To research the extract process of total flavonoids in Lycium barbarum L.with the enzyme-microwave extraction method.The effects of ethanol concentration，enzymolysis temperature and enzymolysis pH on the extraction rate of total flavonoids were studied by orthogonal experiment based on single factor experiment.Then enzyme hydrolysate were extracted by microwave method on the optimum technological parameters determined by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum extraction conditions of enzymatic hydrolysis phase was ethanol concentration 45%，temperature 50℃，pH4.0.The optimum extraction conditions of microwave phase was liquid-solid ratio 30 mL/g，temperature 65℃，time 4 min.The extraction rate of total flavonoids in Lycium barbarum L.was 1.560%under the optimum extraction conditions of cellulase-microwave extraction method.

Lycium barbarum L.；total flavonoids；cellulase；microwave

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.019

2016-08-20

天津市教育考試“十三五”科研規(guī)劃2016年度重點(diǎn)課題（AC2016003）

孫昊（1982—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：化學(xué)工藝與流程。

*通信作者：王芃（1964—），女，教授，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。