于士婷，尹翌秋，孫天霞，張麗軒，王敏，趙大慶，王思明，*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，吉林長春130012）

響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞水溶性蛋白提取工藝

于士婷1，尹翌秋2，孫天霞1，張麗軒1，王敏1，趙大慶1，王思明1，*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，吉林長春130012）

通過響應(yīng)面法（RSM）確定枸杞水溶性蛋白最佳提取工藝。以枸杞蛋白提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗考察各個影響因素對枸杞蛋白提取率的影響程度。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法（RSM）優(yōu)化提取供工藝條件，確定最佳提取工藝。依據(jù)designexpert8.0.6試驗軟件回歸分析確定提取時間對枸杞水溶性蛋白提取率影響較大，分析得出枸杞水溶性蛋白提取的最佳工藝參數(shù)為pH8.60，液料比18.83∶1（mL/g），提取時間9.79 h。此條件下枸杞水溶性蛋白理論提取率7.82%。但考慮到此參數(shù)給實際操作帶來了諸多不便，故把枸杞水溶性蛋白的提取最佳工藝條件修正為pH9.0，提取時間10 h，液料比20∶1（mL/g）。對修正參數(shù)進行3次重復(fù)驗證試驗得枸杞水溶性蛋白的實際提取率為7.69%，與預(yù)測值接近。

枸杞；枸杞水溶性蛋白；提??；響應(yīng)面法

構(gòu)杞（Lycium Barbarum L.）是茄科（Solanaeeae）植物，屬多年生落葉灌木，是我國傳統(tǒng)的中藥材和保健品。我國有7個品種2個亞種，其中寧夏枸杞分布最為廣泛，也是唯一被載入中國藥典的枸杞物種，在我國西、北方地區(qū)（如寧夏、新疆、西藏、陜西、山西等）廣泛分布，具有補肝腎、生精血、抑制脂肪在肝細胞中沉淀、增強免疫功能、促進肝細胞新生的作用。

現(xiàn)代科學(xué)對寧夏枸杞的研究越來越多，主要涉及枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素等成分。但目前國內(nèi)外對寧夏枸杞蛋白以及枸杞蛋白的食品功能特性的研究卻少見報道。近代研究發(fā)現(xiàn)，枸杞蛋白具有抗氧化、增強機體免疫力、抗腫瘤、防衰老、增加造血功能等活性功能，因此枸杞蛋白的大規(guī)模開發(fā)及利用具有一定的市場價值，而優(yōu)化試驗則具有一定的必要性[1-2]。目前枸杞除少量用作中藥外，其大部分的加工副產(chǎn)品成為加工廢棄物被拋棄，造成了資源浪費和環(huán)境污染。為了提高枸杞加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，促進資源的綜合利用，因此枸杞蛋白提取條件的優(yōu)化對開發(fā)和利用枸杞資源有重要的意義[3-5]。

響應(yīng)面方法（Response Surface Methology，簡稱RSM）是利用合理的試驗設(shè)計并通過試驗得到的一定的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)化工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。RSM在優(yōu)化研究中應(yīng)用頻繁，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中的實際問題的一種有效方法，它已廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域。

本文就提取中影響枸杞蛋白得率的幾個重要因素做了系統(tǒng)研究，并運用響應(yīng)面分析（Response Surface analysis，RSA）法對枸杞蛋白的提取條件進行了優(yōu)化。用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計，對試驗數(shù)據(jù)進行分析，對擬合數(shù)學(xué)模型進行了較為詳細的描述，得到了枸杞蛋白提取的最佳工藝參數(shù)。為枸杞資源的食用開發(fā)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏枸杞：購于長春市宏檢大藥房；Bradford蛋白定量試劑盒：購于天根（TIANGEN）；磷酸鹽緩沖液（pbs）：由長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程實驗室配制；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫納：北京化工廠。

1.2 儀器

pH計FE20：美國梅特勒-托利多公司；冷凍離心機Gentrifuge 5804R：德國Eppendorf公司；低溫真空冷凍干燥機LL3000：德國Heto；多功能酶標(biāo)儀Infinite M200Pro：瑞士Tecan公司；電子天平AL204：美國梅特勒-托利多公司；粉碎機GS-05：北京錕捷玉誠機械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白含量測定

蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定：采用酶標(biāo)儀，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，0、1、2、3、4、5、6 μL BSD標(biāo)準(zhǔn)溶液作為橫坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為Y=0.12X+0.208（R2=0.994 0），式中：Y為吸光度；X為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/μL。枸杞水溶性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Protein standard curve

1.3.2 原料預(yù)處理

以干枸杞原料用高速粉碎機粉碎，置于一次性干燥密封袋備用。

1.3.3 枸杞水溶性蛋白單因素試驗[6-7]

以枸杞水溶性蛋白提取率為衡量指標(biāo)，分別以pH值、提取時間、液料比、提取次數(shù)為影響因素，設(shè)計枸杞水溶性蛋白單因素試驗。

1.3.3.1 枸杞水溶性蛋白等電點的確定[8-10]

精密稱取枸杞粉5份，每份2.00 g，按液料比10∶1（mL/g）用蒸餾水25℃常溫下浸提（以下浸提都為蒸餾水25℃常溫浸提），之后用HCl分別調(diào)pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，提取時間2.5 h，提取次數(shù)1次，在室溫下以6 000 r/min離心60 s后，分別取不同pH值下上清液，用考馬斯亮藍法，分別測定不同pH值條件下各個樣品上清液中水溶性枸杞蛋白質(zhì)的含量，上清液蛋白質(zhì)提取率最低時的pH值即為蛋白質(zhì)的等電點。

1.3.3.2 pH值選擇試驗

精密稱取枸杞粉6份，每份2.00 g，按液料比10∶1（mL/g）浸提，分別用酸調(diào)至pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，提取時間10 h，提取次數(shù)1次，在室溫下以6 000 r/min離心60s后，以蛋白提取率為指標(biāo)，比較得出較佳的因素水平。

1.3.3.3 提取時間的選擇試驗

精密稱取枸杞粉6份，每份2.00 g，同液料比10∶1（mL/g）浸提，pH 8.0選取提取時間分別為：1.5、2.5、4、7、10、24 h進行浸提，提取次數(shù)1次，在室溫下以6 000 r/min離心60 s后，以蛋白提取率為指標(biāo)，比較得出較佳的因素水平。

1.3.3.4 液料比的選擇試驗

精密稱取枸杞粉4份，每份2 g，pH 8.0，選取液料比分別為：5∶1、10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）進行浸提，提取次數(shù)1次，在室溫下以6 000 r/min離心60 s后，以蛋白提取率為指標(biāo)，比較得出較佳的因素水平。

1.3.3.5 提取次數(shù)的選擇試驗

精密稱取枸杞粉4份，每份2 g，同液料比10∶1（mL/g）浸提，pH 8.0，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次進行浸提，提取時間10 h，每次合并上清液，在室溫下以6 000 r/min離心60 s后，以蛋白提取率為指標(biāo)，比較得出較佳的因素水平。

1.3.4 蛋白提取條件的響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design.Export 8.0的Box.Behnken中心組合試驗設(shè)計響應(yīng)原理，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計[11-13]，每個組合平行3次，提取率取平均值，因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1Response surface test factor level

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法

每個樣品處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)散點圖和統(tǒng)計分析。Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞水溶性蛋白等電點測定結(jié)果

枸杞水溶性蛋白等電點測定結(jié)果見圖2。

圖2 等電點pH值與提取率的關(guān)系Fig.2Relationship between the isoelectric point pH value and extraction rate

由圖2可以看出，枸杞蛋白在不同pH沉淀后，上清液中的蛋白質(zhì)含量在pH 3.5時最低。因此，pH 3.5為枸杞水溶性蛋白的等電點[14-16]。

2.2 pH值與提取率的關(guān)系

pH值與提取率的關(guān)系見圖3。

圖3 堿液pH值與提取率的關(guān)系Fig.3The relationship between pH value and alkali extraction rate

從圖3可知，隨著pH值的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢，pH值為8.0時，枸杞蛋白的提取率最高，達到1.890 7%；pH值為7.0和9.0時的提取率次之。故考慮，選取7.0、8.0、9.0為pH值的3個水平。

2.3 提取時間與提取率的關(guān)系

提取時間與提取率的關(guān)系見圖4。

圖4 時間對提取率的影響Fig.4Effect of time on extraction rate

從圖4可知，隨著浸提時間的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢，當(dāng)時間為7 h時，提取率最高，之后略有下降，這可能是提取時間增加后，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致。因此，選取4、7、10 h為時間的3個水平。

2.4 液料比與提取率的關(guān)系

液料比與提取率的關(guān)系見圖5。

圖5 不同液料比對提取率的影響Fig.5Effect of different liquid to material ratio on extraction rate

從圖5可知，枸杞蛋白提取率隨著液料比的增加而增加，在液料比15∶1（mL/g）時，枸杞蛋白的提取達最高；故綜合考慮選擇10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）為液料比的3個水平。

2.5 提取次數(shù)與提取率的關(guān)系

提取次數(shù)與提取率的關(guān)系見圖6。

圖6 不同提取次數(shù)對提取率的影響Fig.6Effect of different extraction times on extraction rate

圖6 可知，枸杞蛋白提取率隨著提取次數(shù)的增加的提取率呈現(xiàn)增加趨勢，從1次到2次呈現(xiàn)明顯地增加，之后緩慢?？紤]到節(jié)約人力物力等經(jīng)濟因素，經(jīng)綜合考慮提取次數(shù)選擇水提2次即可。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.6.1 模型的數(shù)學(xué)分析

由單因素試驗結(jié)果可知，提取時間、pH和液料比對枸杞蛋白提取率影響較大，而提取次數(shù)為4次時效果最好，但考慮到試驗實際操作的便利性，以提取次數(shù)兩次。故而用提取時間、pH和液料比3個因素對蛋白質(zhì)提取率（Y）的影響來進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。三因素三水平如表2所示，design expert8.0.6試驗設(shè)計軟件得出的試驗方案及結(jié)果見表3[17-19]。

表2 因素水平表Table 2Factor level table

表3 試驗方案及結(jié)果Table 3Experimental scheme and results

續(xù)表3試驗方案及結(jié)果Continue table 3Experimental scheme and results

以上邊的3個因素及其交互作用作為自變量，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值（Y），采用design expert8.0.6試驗軟件對表3的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合分析，得到以下回歸方程：Y=-87.65+22.14A-0.29B+ 0.71C+0.18AB+0.32AC+0.02BC+1.64A2-0.03B2-0.18C2對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗方差分析Table 4Variance analysis of response surface test

從表4可知，模型回歸項F值=13.75，P＜0.05，說明所選擇模型顯著。各因素的影響大小為提取時間＞pH＞液料比，表中的A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的Pr＞F值均小于0.01，說明這些均是較顯著的模型項。模型失擬項P＞0.05，不顯著，表示試驗誤差小，操作可行，模型對試驗擬合情況較好?；貧w方程能夠擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系?？梢酝ㄟ^回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。模型的的絕對系數(shù)R2=0.966 7，說明響應(yīng)值的變化有96.67%來自于所選變量優(yōu)化，因此回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)真實關(guān)系，可以利用該回歸方程預(yù)測最佳提取條件及其提取率。

2.6.2 各因素間的交互作用

根據(jù)響應(yīng)面法試驗設(shè)計所得的回歸方程，利用Design Expert 6.0軟件的作圖功能，做交互因素的響應(yīng)面分析圖和等高線圖，如圖7～圖9所示。

圖7 pH與液料比交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7Response surface and contour map of interaction between pH and liquid material ratio

該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白得率大小的影響程度。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱，圓形表示兩因素間交互作用較弱，橢圓表示兩因素間交互作用較強。

由圖7隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢；隨著液料比的增大，蛋白質(zhì)提取率也隨之提高后下降趨勢；由圖8隨著時間的遞增，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢；隨著pH的遞增，蛋白質(zhì)提取率也呈現(xiàn)逐漸升高后降低；由圖9隨著提取時間的升高，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢；隨著pH值的遞增，蛋白質(zhì)提取率也呈現(xiàn)先升高后緩慢下降趨勢；各交互作用的影響與單因素影響不一致，根據(jù)方差分析說明各個交互因素作用對響應(yīng)值有顯著影響。對提取率的回歸方程模型進行數(shù)學(xué)分析，得出蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件為：pH 8.60，液料比18.83∶1（mL/g），提取時間9.79 h。在此工藝下枸杞蛋白理論提取率為7.82%。

圖8 提取時間與pH交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8The response surface and contour map of the interaction between extraction time and pH

圖9 液料比與時間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9The response surface and contour map of the interaction between the liquid material ratio and the time

2.7 最佳工藝參數(shù)驗證性試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件回歸方程分析，得出枸杞水溶性蛋白提取的最佳工藝參數(shù)：pH值為8.60，液料比18.83∶1（mL/g），提取時間9.79 h。此條件下枸杞水溶性蛋白理論提取率7.82%。但考慮到此參數(shù)給實際操作帶來了諸多不便，故把枸杞水溶性蛋白的提取最佳工藝條件修正為pH為9.0，提取時間10 h，液料比20∶1（mL/g）。對修正參數(shù)進行3次重復(fù)驗證試驗得枸杞水溶性蛋白的實際提取率為7.69%，與預(yù)測值接近，說明二次多項式數(shù)學(xué)模型進行等高線疊加所得到的優(yōu)化區(qū)域符合設(shè)計目標(biāo)，試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性，通過本試驗方法可以得到蛋白質(zhì)含量較高的枸杞蛋白。

3 結(jié)論

以干枸杞為原料提取枸杞水溶性蛋白，枸杞水溶性蛋白的等電點為3.5；通過單因素試驗設(shè)計，以及在此基礎(chǔ)上通過設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析法試驗，得出各因素對提取率的影響的大小為：提取時間＞水提pH值＞液料比，驗證試驗進一步得到在pH值為9.0，提取時間10 h，液料比20∶1（mL/g），枸杞水溶性蛋白的提取率達至7.69%。本試驗結(jié)果可為規(guī)模化提取枸杞水溶性蛋白提供參考，但其理化性質(zhì)還有待進一步深入研究。

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Optimization of Water-soluble Protein Extraction Technology of Wolfberry by Response Surface Methodology

YU Shi-ting1，YIN Yi-qiu2，SUN Tian-xia1，ZHANG Li-xuan1，WANG Min1，ZHAO Da-qing1，WANG Si-ming1，*
（1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China；2.Gene Science Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Changchun 130012，Jilin，China）

To determine the optimum extraction wolfberry water-soluble protein by response surface methodology（RSM）.Wolfberry protein extraction rate by single factor experiment investigated the influence of various factors wolfberry protein extraction rate.On this basis，the application of response surface methodology（RSM）for optimization of extraction conditions，to determine the best extraction process.According to the design expert 8.0.6 testing software regression analysis identified a greater impact on the extraction time wolfberry water-soluble protein extraction rate，the analysis of water-soluble proteins derived wolfberry extract the optimum parameters pH8.60，liquid-solid ratio 18.83∶1（mL/g）extraction time 9.79 h.Wolfberry water-soluble protein extraction rate of 7.82%theory this condition.But consider this argument to practice a lot of inconvenience，so the water-soluble protein extract wolfberry optimum conditions corrected to pH9.0，extraction time 10 h，liquidsolid ratio 20∶1（mL/g）.Amendments parameter verification experiment was repeated 3 times the actual extraction rate of wolfberry water-soluble proteins 7.69%，close to the predicted value.

wolfberry；wolfberry water-soluble protein；extract；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.018

2016-10-21

吉林省中藥生物技術(shù)重點實驗室（20140622003JC）；吉林省中藥組學(xué)工程實驗室（2014N155）

于士婷（1994—），女（漢），碩士研究生，研究方向：中藥有效成分應(yīng)用與開發(fā)。

*通信作者：王思明（1987—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：中藥蛋白質(zhì)。