王俊，韓淑琴，*，李志銳，呂平

（1.中山職業(yè)技術(shù)學院，廣東中山528404；2.天津職業(yè)大學，天津300402）

龍眼殼黃酮的純化工藝研究

王俊1，韓淑琴1，*，李志銳1，呂平2

（1.中山職業(yè)技術(shù)學院，廣東中山528404；2.天津職業(yè)大學，天津300402）

采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮進行純化，對上樣量、pH值、洗脫液濃度等洗脫條件進行優(yōu)化，得最佳純化工藝條件為：上樣量為10 mL時，樣品濃度為0.264 mg/mL；pH值為3；洗脫液為90%的乙醇。同時對龍眼殼黃酮HPLC分析條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明最優(yōu)分析條件為：流動相，甲醇-水（25∶75，體積比）；流速，0.5 mL/min；波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量：4 μL；在此條件下經(jīng)柱層析法有效純化的龍眼殼黃酮樣品中蘆丁純度最高可達63.95%。

龍眼殼；黃酮；大孔徑樹脂；純化

龍眼（longgan）俗稱“桂圓”，是我國南方佳果。據(jù)文獻表明龍眼的莖、葉、花、果、殼中均含有豐富的黃酮、多酚、多糖類物質(zhì)。龍眼殼“味甘、性溫、無毒”，“治心虛頭暈、散邪祛風、聰耳明目”，“研細治湯火傷亦佳”[1-2]。龍眼果實含有14%～22%的殼，每年在龍眼肉等龍眼制品的加工制作過程中，會產(chǎn)生大量的龍眼殼廢料，而龍眼殼中所含主要活性物質(zhì)為黃酮類化合物[3-4]，對龍眼殼進行黃酮類物質(zhì)的提取利用將大大提高龍眼的綜合經(jīng)濟價值，大大提高龍眼種植業(yè)的經(jīng)濟效益。黃酮類化合物具有抗氧化性[5]，抗癌，調(diào)節(jié)血脂、血糖[6]，抗抑郁[7]，改善血液循環(huán)[8]，鎮(zhèn)痛等等作用，在化妝品、保健食品和藥品中都應用廣泛，具有廣闊應用前景。本文采用AB-8大孔徑樹脂柱層析純化龍眼殼黃酮粗提物，以濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液為洗脫液梯度洗脫，得5個洗脫液樣本后采用高效液相法檢測純度，考察本方法的價值和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼殼黃酮粗提物、無水乙醇、甲醇、AB-8大孔樹脂、蘆丁標準品：中國藥品與生物制品檢定所；氫氧化鈉、鹽酸等化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

玻璃層析柱：直徑2 cm，柱長32 cm；T6-紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀：中國上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；DZF-6050B箱真空干燥器：上海一恒科學儀器有限公司；HP-1100高效液相色譜儀：美國惠普。

1.3 方法

1.3.1 龍眼殼黃酮粗提物制備

石峽龍眼果殼，低溫烘干后粉碎備用；精確稱取龍眼殼粉末5 g，70%的乙醇溶液：龍眼殼粉末，以液固質(zhì)量比25∶1（mL/g）的比例浸泡1 h，后采用超聲微波協(xié)同萃取法提取。

提取工藝條件：提取時間一輪60 s，微波功率300 W、超聲波開啟，其中超聲微波開啟10 s后暫停10 s，第一次萃取完待萃取液冷卻后以同樣技術(shù)參數(shù)進行第二輪萃??；萃取完畢后過濾得龍眼殼黃酮粗提液，回收乙醇處理后，真空干燥得龍眼殼黃酮粗提物備用。

1.3.2 大孔徑樹脂的前處理

AB-8大孔徑樹脂，置于燒杯中加無水乙醇浸泡24 h，后用去離子水充分淋洗至無乙醇氣味，備用。采用流動法裝填大孔徑樹脂層析柱，裝填的過程中不斷敲擊柱壁使樹脂顆粒裝填嚴密無空隙。裝填高度達到要求后用去離子水過柱，使樹脂填充更加緊實。待層析柱穩(wěn)定后，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔徑樹脂柱層析條件優(yōu)化

2.1.1 洗脫液濃度對黃酮含量的影響

將龍眼殼黃酮粗提物用30%乙醇溶液溶解定容至10 mL，上樣至大孔徑樹脂層析柱，待樣品加載完畢后，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段接收得1號～5號龍眼殼黃酮樣品，樣品經(jīng)微孔濾膜過濾后冷藏待檢測。不同濃度乙醇洗脫所得樣品含量見表1。

表1 不同濃度乙醇洗脫所得樣品含量Table 1Sample content elution by different concentrations of ethanol

由表1數(shù)據(jù)可見采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮進行純化，以乙醇為洗脫劑，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段采集得5份純化樣品，樣品中蘆丁含量分別為：8.52%、9.98%、24.94%、48.99%、61.99%，呈梯度分布。結(jié)果表明用90%的乙醇溶液洗脫最好。

2.1.2 龍眼殼黃酮樣品上樣量對樹脂純化的影響

在樹脂中加入不同量的提取液，靜置60 min，測定流出液龍眼殼黃酮樣品的含量，結(jié)果如表2。

表2 不同上樣量對樹脂純化的影響Table 2Effects of different loading amount on resin purification

濃度在0.2 mg/mL～0.3 mg/mL范圍內(nèi)龍眼殼黃酮樣品對樹脂的吸附效果最好，說明不同濃度的龍眼殼黃酮樣品對大孔樹脂吸附有影響，原因是樹脂的吸附能力是有限的，濃度過高，龍眼殼黃酮樣品超出了其吸附能力，有一部分龍眼殼黃酮樣品不能被吸附，所以含量反而降低，選擇合適的龍眼殼黃酮樣品濃度尤為重要，在此條件下選擇0.264 mg/mL的龍眼殼黃酮濃度較好。

2.1.3 龍眼殼黃酮樣品pH值對樹脂純化的影響

取5只50 mL的三角燒瓶，各加入1 g處理好的樹脂和濃度為0.264 mg/mL的龍眼殼黃酮樣品25 mL，把pH值分別調(diào)到2.00、3.00、4.03、5.08、6.00，震蕩12 h后，測得結(jié)果如表3。

表3 不同pH值條件下的吸附率Table 3The adsorption rate at different pH conditions

由表3可得，pH值在3時吸附率最高，在3以下時吸附率隨pH值升高而降低，說明pH值對吸附率的影響較為明顯，pH值為3時，最有利于樹脂對龍眼殼黃酮樣品的吸附。

2.2 高效液相色譜柱條件優(yōu)化及蘆丁標準曲線的制備

2.2.1 流動相體積分數(shù)的選擇

綜合考慮洗脫能力以及成本等因素，選擇甲醇作為流動相。依次用體積分數(shù)為25%、50%、75%和100%的甲醇溶液進行等度洗脫（控制流速為1 mL/min），分別收集各自的洗脫液，測出洗脫液中龍眼殼黃酮類物質(zhì)的含量，繪制曲線，選擇最佳的洗脫液體積分數(shù)。試驗表明，當甲醇濃度為25%時，黃酮類物質(zhì)的含量較高、當甲醇濃度為50%時，黃酮類物質(zhì)的含量有點降低，當甲醇濃度為75%時，黃酮類物質(zhì)的含量有點偏低，當甲醇濃度為100%時，黃酮類物質(zhì)的含量最低。

甲醇的體積分數(shù)為25%時效果最好，甲醇體積分數(shù)過高時效果不太理想，這是因為色譜法是根據(jù)被分離物質(zhì)與色譜柱之間的吸附強弱來選擇不同的流動相和相應的體積分數(shù)。在上述4中不同體積分數(shù)的甲醇流動相中，25%的甲醇溶液的極性最大，故其洗脫效果最好。

2.2.2 流動相流速的選擇

將龍眼殼黃酮樣品以不同流速進行色譜分析檢測，測定流出液中龍眼殼黃酮的含量。流動相流速的選擇見表5。

表5 流動相流速的選擇Table 5Selection of mobile phase flow rate

由表5可知，隨著流速加快，龍眼殼黃酮的含量越來越低，流動相流速為0.2、0.5 mL/min時含量較為接近，差異不是很大。流動相流速為1、1.5 mL/min時含量降低較明顯。顯然此流速不適宜，流動性流速以慢為好，但是過慢會延長周期，從而提高成本。綜合考慮，流動相流速應為0.5 mL/min適宜。最后選擇高效液相色譜柱條件為：C18柱，流動相：甲醇-水（25∶75，體積比），流速：0.5 mL/min，波長：254 nm，柱溫：25℃，進樣量：4 μL。在此色譜條件下，參照張海軍等的《高效液相色譜法（HPLC）測定大豆異黃酮含量的研究》中標準曲線的制備及線性關(guān)系的考查[9]。

2.3 蘆丁標準品線性關(guān)系的考察

在試驗過程中，我們對乙醇洗脫濃度、龍眼殼黃酮樣品上樣量、龍眼殼黃酮樣品的pH值、流動相體積分數(shù)、流動相pH值進行了優(yōu)化，分別得到了最佳的純化和分離條件。選擇純化過程中的最佳條件，得到5個龍眼殼黃酮樣品，然后再最佳的色譜條件下，分別對標準溶液、各濃度蘆丁標樣進行色譜分析。以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進而計算回歸方程為：Y=1 347.3X-27.63，R2=0.999 1。則由數(shù)據(jù)可以分析得出標準品具有良好線性關(guān)系。

2.4 HPLC檢測樣品與標準品

采用以上試驗優(yōu)化后最佳的工藝條件對樣品進行檢測，標準品、樣品的HPLC色譜圖見圖1～圖6。

由圖1～圖6和表6數(shù)據(jù)可見采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法對龍眼殼黃酮采用最優(yōu)條件進行純化，以乙醇為洗脫劑，采用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各30 mL梯度洗脫，分段采集得5份純化樣品，采用HPLC法，對樣品進行檢測，并與蘆丁標準品進行比對，所得5份樣品中蘆丁含量分別為：9.02%、10.28%、23.24%、45.09%、63.95%呈梯度分布。

圖1 蘆丁標準品HPLC色譜圖Fig.1HPLC chromatogram of rutin standard

圖2 樣品1 HPLC色譜圖Fig.2HPLC chromatogram of sample 1

圖3 樣品2 HPLC色譜圖Fig.3HPLC chromatogram of sample 2

圖4 樣品3 HPLC色譜圖Fig.4HPLC chromatogram of sample 3

3 結(jié)論

采用AB-8大孔徑樹脂柱層析法，以乙醇為洗脫液可有效純化龍眼殼黃酮粗提物；龍眼殼黃酮中主要成分為蘆丁；乙醇洗脫液濃度越高則所得純化后樣品中龍眼殼黃酮純度越高，其中洗脫液為90%乙醇溶液，流動相甲醇的體積分數(shù)為25%流動相流速應為0.5 mL/min時，所得純化樣品中蘆丁純度最高達63.95%。

圖5 樣品4 HPLC色譜圖Fig.5HPLC chromatogram of sample 4

圖6 樣品5 HPLC色譜圖Fig.6HPLC chromatogram of sample 5

表6 各樣品的HPLC檢測指標Table 6HPLC test result of each sample

[1]Jiang Yue-ming．Purification and some properties of polyphennol oxidase of longan fruit[J]．Food Chem,1999,66(1)：75-79

[2]江蘇新醫(yī)學院．中藥大詞典(上)[M]．上海：上海人民出版社,1997

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[6]董倩倩,陳立峰.二輕楊梅素藥理研究進展[J].中南醫(yī)藥,2005,3 (5)：295-298

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Study on Purification of Longan Shell Flavonoids

WANG Jun1，HAN Shu-qin1，*，LI Zhi-rui1，Lü Ping2
（1.Zhongshan Polytechnic，Zhongshan 528404，Guangdong，China；2.Tianjin Vocational Institute，Tianjin 300402，China）

ThelonganshellflavonoidswerepurifiedbyAB-8macroporousresincolumnchromatographymethod，thoseelutionconditions，suchasvolumeofsample，pHvalueandelutiondensitywereoptimized，andthebestpurification process conditions were the volume of sample，10 mL；the concentration of eluent，0.264 mg/mL；pH value，3；eluent，90%ethanol.Under these HPLC conditions[C18 column，mobile phase：methanol and water（25∶75，volume ratio），flow rate：0.5 mL/min，wavelength：254 nm，column temperature：25℃，sample quantity：4μL]，purification sample was tested and the result contrasted with rutin standard showed that the rutin concentration was up to 63.95%in sample under the optimal process condition and the column chromatography method.

longan shell；flavone；large aperture resin；purify

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.017

2017-01-04

中山市科技計劃項目（2014A2FC254）；天津市科技特派員項目（16JCTPJC47900）

王俊（1982—），女（漢），實驗師，碩士研究生，從事功能材料合成與檢測。

*通信作者：韓淑琴（1980—），女（漢），講師，主要研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取與應用。