張華，冉黃橋，楊能，顏復(fù)林，王亞坪，周濃

（重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000）

貝母粗多糖的4種類型樹脂純化

張華，冉黃橋，楊能，顏復(fù)林，王亞坪，周濃*

（重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000）

篩選出純化效果最佳的樹脂類型，以提高貝母粗多糖純化效果。太白貝母和甘孜川貝母粗多糖提取液分別經(jīng)過DA201-C型、AB-8型、201×4型、HPD600型共4種不同類型樹脂靜態(tài)吸附純化后，比較其對貝母粗多糖提取液其核酸脫除率、蛋白脫除率，色素脫除率的影響，以及對多糖損失率和羥基自由基清除效果的影響。研究顯示201×4型樹脂對貝母粗多糖純化效果最佳，核酸脫除率范圍在92.22%～94.41%之間，蛋白脫除率在94.13%～94.95%之間，脫色素率在69.14%～86.07%之間，多糖損失率在62.13%～94.47%之間，羥基自由基清除效果在25.72%～29.82%之間。AB-8型樹脂對貝母粗多糖純化效果次之、其次是DA201-C型和HPD600型大孔樹脂。201×4型樹脂對貝母粗多糖純化效果最佳。

太白貝母；甘孜川貝母；樹脂；粗多糖；純化

貝母是一種藥食同源植物，屬于百合科多年生草本植物。其具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗?jié)儭⒖寡“寰奂?、抗腫瘤等功效[1]。依據(jù)產(chǎn)地的不同，貝母可以分為川貝母、浙貝母、土貝母、伊貝母[2]?！疤棕惸浮睂儆诖ㄘ惸疙椣拢谴ㄘ惸溉胨幹匾粗?。多糖作為近年來研究的熱點之一。大量研究表明植物多糖具有抗衰老，等多種生物學(xué)功效，而且對機體幾乎沒有毒性，故對其生物學(xué)功效的研究愈來愈引起人們的重視[3]。貝母多糖提取純化工藝相關(guān)研究也越來越多，但仍然處于起步階段[4]。為了提高貝母多糖的品質(zhì)，本試驗著重研究經(jīng)過不同類型樹脂靜態(tài)吸附純化后，其對太白貝母粗多糖和甘孜川貝母粗多糖純化效果的影響，以期待得到貝母多糖純化效果最佳的樹脂類型。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀器

722型可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；FA1004型號電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH.S精密恒溫水浴鍋：江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；往復(fù)式水浴恒溫搖床、zxfd-5250十段編程鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器有限公司；低速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；FW80型高速試樣粉碎機：河北省黃市新興電器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GDYQ-701S超聲波清洗器：長春吉大小天鵝儀器有限公司。

1.2 試劑

乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、氯仿、硫酸（分析純）：重慶川東化工集團有限公司；氫氧化鈉（分析純）：四川西隴化工有限公司；30%過氧化氫（分析純）、水楊酸（分析純）、對照品為無水葡萄糖（批號20130701，供含量測定用）：成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；硫酸亞鐵（分析純）、正丁醇：成都市科龍化工試劑廠；蒽酮（分析純）：中國試劑網(wǎng)；水為超純水；抗壞血酸對照品（批號20150120，供含量測定用）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；201×4型樹脂：南開大學(xué)化工廠；DA201-C樹脂：勤實科技；AB-8樹脂、HPD600樹脂：東鴻化工有限公司。

1.3 樣品

太白貝母干燥顆粒樣品：四川成都荷花池中藥材市場；甘孜川貝母干燥顆粒樣品：四川省南充市嘉陵區(qū)四川農(nóng)貨特產(chǎn)直銷店。

2 方法

2.1 貝母樣品預(yù)處理以及粗多糖的提取

將貝母干燥品粉碎，并過60目篩（0.280 mm）保存于干燥器備用。參見姜峻等報道的方法[5]進行貝母粗多糖提取。精確稱取20.0 g貝母樣品（粉末）加蒸餾水定容至200 mL，80℃水浴提取1 h，以3 800 r/min離心10 min，過濾取濾液。以上水浴提取步驟重復(fù)操作3次。將3次濾液合并，濃縮到原體積的1/3，趁熱加入原濃縮液3倍～4倍體積的冷無水乙醇，之后放入4℃冰箱進行醇沉24 h。醇沉后取沉淀，加蒸餾水復(fù)溶，加入1/3倍體積Sevage試劑（氯仿∶正丁醇＝5∶1，體積比）振蕩2 min，之后以3 000 r/min離心10 min，取粗多糖水溶液，定容至100 mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 不同類型樹脂純化貝母多糖溶液

不同樹脂類型包括：DA201-C樹脂、AB-8樹脂，201×4型號樹脂、HPD600樹脂。

分別稱取4 g樹脂，用蒸餾水充分清洗以去除表面雜質(zhì)，再用25 mL無水乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脹。之后棄去乙醇，用蒸餾水洗滌至無味，加20 mL 4%的HCl溶液浸泡3 h，再用蒸餾水洗滌至中性。再用20 mL 4%的NaOH溶液浸泡3 h之后，用蒸餾水洗滌至中性，最后加20 mL蒸餾水浸泡，保存4℃?zhèn)溆肹6]。

2.3 貝母多糖樹脂純化效果指標(biāo)檢測

2.3.1 核酸脫除率

取樣品原液和脫色后的樣品溶液，分別在260 nm波長處測定其吸光度，計算其核酸脫除率。

式中：A0為樣品原液吸光值；Au為樣品脫色后吸光值。

2.3.2 蛋白質(zhì)脫除率

取樣品原液和脫色后的樣品溶液，分別在280 nm波長處測定其吸光度，計算其蛋白質(zhì)脫除率。

式中：A0為樣品原液吸光值；Ap為樣品脫色后吸光值。

2.3.3 色素脫除率

取樣品原液和脫色后的樣品溶液，在420 nm和470 nm波長處分別測定其吸光度，計算其脫色率。

式中：A0為樣品原液吸光值；Ac為樣品脫色后吸光值。

2.3.4 多糖損失率

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL分別置于10 mL具塞試管中，蒸餾水補足至2 mL，將試管置入冰水中，沿試管壁加入蒽酮顯色劑（0.2 g蒽酮/100 mL濃硫酸）5 mL后同時搖勻，再將試管放入沸水煮沸10 min取出，立即放入冰水中冷卻5 min后在室溫中平衡10 min。在620 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖含量的測定[7]：將純化前和純化后貝母多糖溶液均稀釋32倍，取分別稀釋后的多糖樣品溶液2mL，其他步驟同上。將該多糖溶液測定吸光值帶入葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方程，計算粗多糖含量。多糖損失率的公式如下：

式中：M1為純化前多糖的質(zhì)量，mg；M2為純化后多糖的質(zhì)量，mg。

2.3.5 羥基自由基清除率的測定（抗氧化活性測定）

在10mL比色管中依次加入6 mmol/L的硫酸亞鐵水溶液1 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL后，一定濃度多糖提取液1 mL加入比色管中，然后加入0.1%的H2O21 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻后于37℃水浴30 min，測510 nm處的吸光度值A(chǔ)。按下式計算清除率[8]：

式中：A°為空白對照液的吸光值，即未加入貝母多糖溶液的吸光值；An為加入貝母多糖后的吸光值；An′為不加H2O2時的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 太白貝母粗多糖不同類型樹脂純化效果

不同類型樹脂對太白貝母粗多糖純化效果的影響見表1。

表1 不同類型樹脂對太白貝母粗多糖純化效果影響的結(jié)果（n=3）Table 1Purification effects of Taibai Fritillaria polysaccharide influenced by different types of resins（n=3）

由表1可知，不同類型樹脂對太白貝母粗多糖純化結(jié)果顯示，核酸清除率范圍在47.95%～92.22%之間，不同類型樹脂存在著顯著性差異，核酸清除效果由高到低的樹脂類型順序為201×4＞AB-8＞HPD600＞DA201-C型，其中201×4型樹脂核酸清除效果最佳。蛋白清除率范圍在55.75%～94.95%，蛋白清除效果最好的為201×4型，其次是HPD600型，AB-8型，DA201-C型。關(guān)于色素脫除率，在420 nm波長處色素脫除率范圍在24.94%～69.14%之間，脫除效果最好的是201×4型和AB-8型樹脂，兩者之前不存在顯著性差異；在470 nm波長處檢測色素脫除率范圍在30.38%～73.46%之間，脫除效果最佳的是201×4型樹脂。由表1分析可知201×4型樹脂清除核酸，蛋白，色素效果最佳。其次是AB-8型、HPD6000、DA201-C型。

此外，不同類型樹脂對多糖損失率影響存在顯著性差異，多糖損失率在35.94%～62.13%之間，其中損失率最高的是201×4型樹脂，多糖損失率最低的是AB-8型和DA201-C型樹脂（35.94%～38.78%，P＜0.05）。不同類型樹脂對純化后多糖溶液抗氧化活性（羥基自由基清除率）存在影響，多糖自由基清除率范圍在12.46%～29.82%，其中抗氧化活性最高的是經(jīng)過201×4型樹脂純化后的多糖。

總體上來看，201×4型樹脂對太白貝母粗多糖純化效果較好，但是多糖損失率也相對較高。如果從多糖損失率角度考慮，可以選擇AB-8型樹脂。

3.2 甘孜川貝母粗多糖不同種類樹脂純化效果

不同類型樹脂對甘孜川貝母粗多糖純化效果的影響見表2。

表2 不同類型樹脂對甘孜川貝母粗多糖純化效果影響的結(jié)果（n=3）Table 2Purification effects of Ganzi Fritillari polysaccharide influenced by different types of resins（n=3）

由表2可知，不同類型樹脂對甘孜川貝母粗多糖純化結(jié)果顯示，核酸清除率范圍在6.87%～94.41%之間，不同類型樹脂核酸清除結(jié)果存在著顯著性差異，核酸清除效果由高到低的樹脂類型順序為201×4型＞AB-8型＞DA201-C型＞HPD600型，其中201×4型樹脂核酸清除效果最佳。蛋白清除率范圍在8.89%～94.13%之間，蛋白清除效果最好的為201×4型樹脂，其次是AB-8型和DA201-C型樹脂，最差的是HPD600型樹脂。關(guān)于色素脫除率，在420 nm波長處色素脫除率范圍在19.08%～81.71%之間，脫除效果最好的是201×4型和AB-8型樹脂，兩者之前不存在顯著性差異；在470 nm波長處檢測色素脫除率范圍在10.32%～86.07%之間，脫除效果最佳的是201×4型和AB-8型樹脂。由表2分析可知201×4型樹脂清除核酸，蛋白，色素效果最佳。其次是AB-8型、DA201-C型、HPD6000型樹脂。

同時，不同類型樹脂對多糖損失率影響也存在顯著性差異，多糖損失率在43.71%～94.47%之間，其中損失率最高的是201×4型樹脂（94.47%），多糖損失率較低的DA201-C型和AB-8型樹脂（43.71%～44.41%）。不同類型樹脂對純化后多糖溶液抗氧化活性存在影響，多糖自由基清除率范圍在8.96%～25.72%，其中抗氧化活性最高的是經(jīng)過201×4型樹脂純化后的多糖。

總體來看，201×4型樹脂純化甘孜川貝粗多糖效果較好，但是甘孜川貝多糖損失率也相對較高。如果從避免多糖損失角度考慮，可以選擇AB-8型樹脂。

4 討論與結(jié)論

本文選用了4種類型（DA201-C型、AB-8型、201×4型、HPD600型）的樹脂純化貝母粗多糖，201×4型樹脂的純化效果較好，但是多糖損失率較高，201×4型樹脂屬于陰離子交換樹脂（屬于強堿性），表明貝母粗多糖溶液的主要雜質(zhì)帶有陰離子基團，多糖也是含有陰離子基團。AB-8型樹脂是一種球狀、弱極性聚合物吸附劑。AB-8型樹脂顯示了對蛋白質(zhì)的清除效果，原因可能是溶液中的大部分蛋白帶有負電荷，帶有疏水基團，以及有一定的極性，故帶有弱極性的AB-8樹脂吸附效果較好[9]。相比較而言，DA201-C型樹脂純化一般。DA201-C型樹脂屬于大網(wǎng)孔型非極性吸附樹脂，其非極性不利于大分子蛋白以及核酸、色素等的脫除，但是其大網(wǎng)孔性依然可以起到一定的除雜效果。HPD600樹脂屬于極性類樹脂，其對于貝母粗多糖的純化效果較差，尤其是甘孜川貝母粗多糖的純化效果最差，說明甘孜川貝母粗多糖雜質(zhì)與太白貝母多糖多糖中雜質(zhì)極性存在著明顯差異，太白貝母粗多糖中雜質(zhì)極性要高于川貝母粗多糖中雜質(zhì)?？梢娯惸付嗵腔境尸F(xiàn)一定極性的高分子化合物。貝母多糖抗氧化活性測定結(jié)果均顯示去除雜質(zhì)越多的貝母粗多糖溶液，多糖羥基自由基清除率越高，表明多糖純度的提高有利于貝母多糖抗氧化活性的提高。

綜合以上研究結(jié)果顯示，對于太白貝母粗多糖以及甘孜川貝母粗多糖201×4型樹脂純化效果較好。

[1]CHEN M H,WANG H C,ZHU Y M,et al.Pharmacological research on Fritillaria[J].Anhui Agricultural Science Bulletin,2007,67(2)：441-471

[2]Hui L,CHEN S L,YAO H,et al.Research progress on resources in Bulbus Fritillariae Cirrhosae[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2008,33(14)：1645-1648

[3]ZHANG J S,FAN H,LI Y X,et al.Antiproliferative effects of four extracts from medicinal fungi on different tumor cells[J].Natural Product Research&Development,2000,12(2)：27-31

[4]CHEN L,SHEN L,WU Y M,et al.Antioxidant activity of water-soluble polysaccharide isolated from TaiBai Fritillariae[J].Food Science&Technology,2013,38(10)：214-217

[5]JIANG J,CHEN L J,WANG X M,et al.Extraction of polysaccharide from Bulbus fritillariae Thunbergil by Orthogonal Test[J].Modern Food Science&Technology,2011,27(7)：823-825

[6]WANG L B,ZHAO Y,XU Y Q.Purification Technology of Pumpkin Polysaccharides with Macroporous Adsorption Resin[J].The Chinese Society of Agricultural Machinery,2010,41(9)：138-142

[7]吳謀成.食品分析感官評定[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2002

[8]黨朵,劉曉風(fēng).伊貝母總黃酮的含量測定及抗氧化活性的研究[J].農(nóng)業(yè)機械,2013(2)：79-81

[9]吳玉和.大孔樹脂對中藥多糖的分離純化[D].天津：天津大學(xué), 2009：9-14

Crude Polysaccharide in Fritillaria Purified by Four Types of Resin

ZHANG Hua，RAN Huang-qiao，YANG Neng，YAN Fu-lin，WANG Ya-ping，ZHOU Nong*
（College of Life Science&Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China）

In order to enhance the purification efficiency of polysaccharide in Fritillaria（Beimu），the study tried to find out which type of resins was the best one for purification.Four different types（DA201-C，AB-8，201×4 and HPD600）of resin were studied.The nucleic acid removal rate，the protein removal rate，pigment removal rate，polysaccharide loss rate and the hydroxyl free radical scavenging effect were the index.The results showed that the type of 201×4 resin was the best one.Its nucleic acid removal rate，the protein removal rate，pigment removal rate，polysaccharide loss rate，the hydroxyl free radical scavenging effect was in the ranges of 92.22%-94.41%，94.13%-94.95%，69.14%-86.07%，62.13%-94.47%，and 25.72%-29.82%，respectively.The purification efficiency of AB-8 resin was the second one，followed by DA201-C and HPD600 resins. The type of 201×4 resin was the best one for purification of polysaccharide in Fritillaria.

Taibai Beimu；Ganzi Beimu；resin；crude polysaccharide；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.014

2017-01-02

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究計劃項目（cstc2016jcyjA0555）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（KJ1501015）；重慶三峽學(xué)院引進高層次人員科研啟動項目（14RC05）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（KJ1501025）；教育部“春暉計劃”合作科研項目（Z2015150）

張華（1982—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

*通信作者：周濃，男，副教授，碩士。