崔施展，謝曉亮，賈東升，李榮喬，溫春秀，劉靈娣，韓進現(xiàn)

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

黑枸杞不同溶劑提取物抗氧化活性

崔施展，謝曉亮*，賈東升*，李榮喬，溫春秀，劉靈娣，韓進現(xiàn)

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

探究黑枸杞不同溶劑提取物體外抗氧化活性。分別以水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯，制備不同溶劑提取物，測定各提取物中總酚、黃酮含量，比較不同溶劑提取物體外抗氧化活性，并分析活性物質(zhì)含量及抗氧化能力的相關(guān)性。結(jié)果表明，50%乙醇提取物總酚、黃酮含量均最高，對DPPH、ABTS+自由基的清除能力及鐵離子還原能力最強，總酚含量與抗氧化活性具有較高的相關(guān)性。黑枸杞50%～75%乙醇提取物抗氧化活性相對較高。

黑枸杞；抗氧化活性；提取溶劑；總酚；黃酮

人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），包括超氧陰離子自由基、羥自由基等氧自由基，氧自由基具有強氧化性，具有一定的細胞毒性，過度積累會造成機體組織及細胞損害[1]。抗氧化劑具有清除氧自由基，增強機體免疫力等功能，但長期使用人工抗氧劑存在致畸、致癌等風(fēng)險[2]。黑枸杞具有較高的食用及營養(yǎng)價值，近年來受到人們的廣泛關(guān)注，利用黑枸杞制備安全高效、純天然的抗氧化劑，對體內(nèi)清除自由基，增強免疫力具有積極意義[3]。本研究比較了黑枸杞不同溶劑提取物的抗氧化活性，并對功效物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性進行了分析，為黑枸杞相關(guān)功能食品研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DGX-92438-2型干燥箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；FA2004型電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FC-10A冷凍干燥機：河北國輝實驗儀器有限公司；UV-6100S型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HBS-1096A酶標儀：南京德鐵實驗設(shè)備有限公司。

黑枸杞：采摘于河北省農(nóng)林科學(xué)院實驗園；沒食子酸（批號：201603110831）、蘆丁標準品（批號：201608100080）：上海純優(yōu)生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、DPPH、ABTS：購自美國Sigma；水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取物的制備

取新鮮黑枸杞55℃干燥，精密稱取黑枸杞100 g，按照1∶35（g/mL）加入不同提取溶劑，回流提取3次，2 h/次，減壓濃縮，冷凍干燥即得不同溶劑提取物。

1.2.2 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量[4]。沒食子酸標準曲線的繪制：精密稱取沒食子酸標準品20.0 mg，加入50%甲醇溶液8 mL，制備標準品溶液。精密吸取標準品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50%甲醇定容至1.0 mL，得系列標準品溶液，取系列標準品溶液0.2 mL，50%Folin-Ciocalteu試劑2.0 mL，0.2 g/L碳酸鈉溶液4.0 mL，蒸餾水定容至10.0 mL，25℃避光孵育2 h，760 nm處測定吸光值。以吸光值為X軸，沒食子酸濃度為Y軸，擬合回歸方程：Y=12.347X+1.372（R2= 0.997 1），在2.0 μg/mL～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?？偡雍繙y定：精密量取樣品溶液0.1 mL，按照以上操作，測定樣品總酚含量。

1.2.3 黃酮含量測定

采用三氯化鋁顯色法[5]。蘆丁標準曲線繪制：精密稱取蘆丁標準品20 mg，加入50%甲醇溶液10 mL，制備標準品溶液。精密吸取標準品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50%甲醇定容至1.0 mL，得系列對照品溶液，吸取系列標準品溶液1 mL，0.1 g/L AlCl3200 μL，1 mol/L醋酸酐200 μL，加蒸餾水至6.0 mL，室溫放置30 min，415 nm處測定吸光值。以吸光值為X軸，蘆丁濃度為Y軸，擬合回歸方程：Y=54.32X+0.187（R2= 0.999），在4.17 μg/mL～27.78 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。黃酮含量測定：精密量取樣品溶液0.1 mL，按照以上操作，測定樣品黃酮含量。

1.2.4 DPPH自由基清除能力[6]

將黑枸杞不同溶劑提取物分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，取各濃度樣品溶液2.0 mL，加入0.09 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，避光放置30 min，以2.0 mL乙醇作為空白對照，517 nm處測定吸光值，按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白吸光度；As為樣品吸光度。

1.2.5 ABTS+自由基清除能力[7]

將黑枸杞不同溶劑提取物分別配制成0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的溶液，稱取K2S2O40.050 4 g，加入7 mmol/L ABTS溶液100 mL，避光放置16 h。取各濃度樣品溶液1.0 mL，ABTS反應(yīng)液1.5 mL，50%甲醇2.5 mL，放置2 min后，745 nm處測定樣品吸光值，1.0 mL蒸餾水作為空白對照，按式（2）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A0為空白吸光度；As為樣品吸光度。

1.2.6 FRAP法測定抗氧化能力[8]

取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L FeSO4溶液300μL，加入9mLFRAP試劑，37℃水浴10min，593nm處測定吸光值，以吸光值為X軸，F(xiàn)eSO4濃度為Y軸，擬合回歸方程。配制不同濃度黑枸杞提取物溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，按照以上操作，測定樣品吸光值。樣品抗氧化活性以相同吸光度所需FeSO4表示，F(xiàn)RAP值越大表明抗氧化活性越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)資料用平均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間差異顯著性采用ANOVA檢驗，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同溶劑提取物總酚及黃酮含量

不同溶劑提取物總酚和黃酮含量見表1。

表1 不同溶劑提取物中總酚和黃酮含量（±s）Table 1Contents of total phenolics and flavonoids in extracts of different solvents

表1 不同溶劑提取物中總酚和黃酮含量（±s）Table 1Contents of total phenolics and flavonoids in extracts of different solvents

注：同一列字母不同表示差異顯著，P<0.05。

提取溶劑總酚含量/（mg/g）黃酮含量/（mg/g）水147.26±1.57a70.54±8.66a50%乙醇254.38±1.29b155.31±16.37b75%乙醇214.33±0.98c184.69±15.77b乙醇156.73±0.99d93.21±12.14c正丁醇89.66±0.87e62.31±8.54a乙酸乙酯82.63±0.79f58.35±7.62a

黑枸杞不同溶劑提取物總酚和黃酮含量具有較大差異。50%乙醇提取物總酚含量最高為（254.38± 1.29）mg/g，乙酸乙酯提取物總酚含量最低；75%乙醇提取物黃酮含量最高，為（184.69±15.77）mg/g，其次為50%乙醇（155.31±16.37）mg/g。

2.2 不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力

不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力結(jié)果見圖1。

圖1 不同溶劑提取物清除DPPH自由基能力Fig.1Scavenging ability of DPPH free radical by different solvent extracts

不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力在一定濃度范圍內(nèi)0.1 mg/mL～0.6 mg/mL呈線性關(guān)系，隨著濃度的增加，清除能力增強，清除能力依次為：水提取物＞50%乙醇提取物＞70%乙醇提取物＞乙醇提取物＞正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物。

2.3 ABTS+自由基清除能力

不同溶劑提取物清除ABTS+自由基能力結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑提取物清除ABTS+自由基能力Fig.2Scavengingability of ABTS+radical by different solvent extracts

不同溶劑提取物均具有一定ABTS+清除能力，在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，對ABTS+清除能力隨提取物濃度的增加而升高，乙酸乙酯提取物清除能力最強，不同溶劑提取物清除ABTS+能力依次為：乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞乙醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物＞50%乙醇提取物。

2.4 FRAP法測定抗氧化活性

不同溶劑提取物FARP值結(jié)果見圖3。

FeSO4回歸方程：Y=1.232 1X+0.014 5，R2=0.992，在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。黑枸杞不同溶劑提取物的鐵離子還原能力隨提取物濃度的增加而升高，其中70%乙醇提取物濃度為1.0 mg/mL時活性最強。

圖3 不同溶劑提取物FARP值Fig.3FARP value of different solvent extracts

2.5 多酚、黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

黑枸杞抗氧化活性與總酚、黃酮含量的相關(guān)系數(shù)（r）見表2。

表2 黑枸杞抗氧化活性與總酚、黃酮含量的相關(guān)性Table 2The correlation of antioxidant activity of black wolfberry with total phenols，flavonoid content

黑枸杞提取物對DPPH、ABTS+自由基清除能力及鐵離子還原能力與總酚含量呈正相關(guān)，在一定范圍內(nèi)隨著總酚含量的升高，抗氧化活性增加；對DPPH和ABTS的抗氧化活性與黃酮含量無明顯相關(guān)性，鐵離子還原能力與黃酮含量呈正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

酚類及黃酮類化合物是植物提取物抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，本研究比較了不同提取溶劑提取物的體外抗氧化活性，并測定了不同溶劑提取物中總酚和黃酮含量，分析了總酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性。黑枸杞各溶劑提取物均表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性，抗氧化活性與樣品濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，總酚含量與抗氧化能力具有顯著相關(guān)性，黃酮與抗氧化能力無顯著相關(guān)性，50%～75%乙醇提取物抗氧化活性最強，這與酚類化合物主要為中等極性化合物相一致[10]。本試驗對黑枸杞不同溶劑提取物的抗氧化活性進行了研究，篩選了黑枸杞抗氧化活性較強的提取溶劑，為后期黑枸杞的相關(guān)開發(fā)提供理論參考，但各活性成分間的相關(guān)性及是否存在相互作用，有待進一步探究。

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Antioxidant Activity of Extracts from Different Solvents of Black Wolfberry

CUI Shi-zhan，XIE Xiao-liang*，JIA Dong-sheng*，LI Rong-qiao，WEN Chun-xiu，LIU Ling-di，HAN Jin-xian
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Medicinal Plant Research Center，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

The antioxidant activity of different solvent extracts of black wolfberry was explored.Preparation of water，50%ethanol，75%ethanol，ethanol，n-butyl alcohol，ethyl acetate solvent extract，determination of total phenol and flavonoids content in the extract，comparison of antioxidant activity of different solvent extracts in vitroand the correlation between the content of active substances and antioxidant capacitywereanalyzed.The resultsshowed that，50%ethanol extract of the total phenol，flavonoids were the highest，50%ethanol extract had the strongest scavenging ability to DPPH and ABTS free radical and the ability of iron ion reduction，The content of total phenol had a high correlation with the antioxidant activity.The antioxidant activity of ethanol extract from black wolfberry 50%-75%was relatively high.

Black wolfberry；antioxidant activity；extraction solvent；total flavonoids；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.009

2016-12-13

崔施展（1989—），男（漢），助理研究員，本科，主要從事中藥功能食品研究。

*通信作者：謝曉亮（1962—），男，研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究；賈東升（1982—），男，副研究員，碩士，主要從事中藥功能食品研究。