徐黎， 端木羊羊， 張勇， Keenan Brown， 張曼玲， 程曉光

·肝臟脂肪定量診斷影像學(xué)專題·

定量CT測量動物肝臟脂肪含量的實驗研究

徐黎， 端木羊羊， 張勇， Keenan Brown， 張曼玲， 程曉光

目的：以Soxhlet化學(xué)萃取法的測量結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，探討定量CT(QCT)對離體動物肝臟標(biāo)本脂肪含量測量的準(zhǔn)確性。方法：選取5塊豬肝、5塊鵝肝和10塊鴨肝，分別使用QCT和Soxhlet化學(xué)萃取法測量每個樣本的脂肪含量。對QCT測得的肝臟脂肪含量(Fat%Q)和Soxhlet化學(xué)萃取法測得的肝臟脂肪含量(Fat%S)進行比較，并使用線性回歸分析研究Fat%Q與Fat%S之間的關(guān)系。結(jié)果：Soxhlet化學(xué)萃取法測得的豬肝、鴨肝和鵝肝的脂肪含量分別為0.5%～2.3%、7.2%～21.0%和35.0%～52.6%，QCT測得的肝臟脂肪含量低于Soxhlet化學(xué)萃取法，但兩種方法的測量結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.052)。兩種方法的測量結(jié)果高度相關(guān)(r=0.962，P<0.001)，F(xiàn)at%S可以通過線性方程Fat%S=0.74，F(xiàn)at%Q+7.272 (r2=0.965，P< 0.001)進行預(yù)測。結(jié)論：以化學(xué)Soxhlet萃取法作為驗證參考標(biāo)準(zhǔn)，使用常規(guī)CT和QCT體模能夠準(zhǔn)確測量離體動物肝臟樣本的脂肪含量。

肝臟脂肪含量； 定量CT； 體層攝影術(shù)，X線計算機； Soxhlet化學(xué)萃取法

酒精性肝臟脂肪變性(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)代表了一大類以肝臟內(nèi)脂肪沉積為特點，與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝異常有關(guān)的疾病。全世界普通人群NAFLD的發(fā)病率為9.0%～37%[1-4]，發(fā)達(dá)國家中NAFLD是慢性肝病的最常見病因[5,6]。

肝臟活檢是診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)，但是作為有創(chuàng)性檢查，并不適用于高風(fēng)險人群的疾病篩查和NAFLD患者的療效評估;此外活檢樣本體積小，存在取樣誤差[7]。目前可用于NAFLD患者肝臟脂肪變性評估的影像學(xué)方法包括超聲、 CT、MRI及磁共振波譜成像(magnetic resonance spectroscopy，MRS)[8,9]。CT評估肝臟脂肪變性是通過測量肝組織的CT衰減值(hounsfeld units，HU)來實現(xiàn)的，而肝臟與脾臟的CT衰減差值(difference in attenuation between liver and spleen，CTL-S)、肝臟衰減指數(shù)(hepatic attenuation index，HAI)、肝脾比值(ratio of hepatic attenuation to splenic attenuation，CTL/S)等參數(shù)均可用于肝臟脂肪變性的定量評估[10-12]；但是反映脾臟脂肪含量的CT測量值與很多因素有關(guān)，包括kV、X線濾過、受檢者體型大小和其他可能影響測量感興趣區(qū)內(nèi)X線能量的因素，且脾臟的CT值在不同個體間存在差異，因此，CT評估肝臟脂肪變性在不同受檢者間也存在差異。

定量計算機斷層成像(quantitative computed tomography，QCT)最初應(yīng)用于上世紀(jì)80年代，并被用于脊柱骨密度(bone mineral density，BMD)的測量[13]。通過掃描前的質(zhì)量控制和掃描過程中使用校準(zhǔn)體模，QCT技術(shù)大大降低了來自CT掃描儀和患者本身差異對測量結(jié)果的影響，而校準(zhǔn)體模將組織的CT值轉(zhuǎn)化為物理密度。QCT測量腰椎骨密度準(zhǔn)確、可靠，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床診斷骨質(zhì)疏松和監(jiān)測治療效果。QCT體模內(nèi)包含脂肪和水樣本，理論上能夠?qū)⒔M織的CT值轉(zhuǎn)化為脂肪含量，CT值下降代表脂肪含量增加。Nagy等[14]的研究證實pQCT 對測量小動物的體脂和肝臟脂肪含量具有較高的準(zhǔn)確度，可用于觀察肝臟脂肪含量的變化。QCT和pQCT的測量原理相似。目前尚無QCT測量肝臟脂肪含量的報道，而對肝臟脂肪含量進行測量結(jié)果的驗證是有必要的。本研究以Soxhlet化學(xué)萃取法為參考標(biāo)準(zhǔn)，對動物肝臟脂肪含量的QCT測量結(jié)果進行驗證。

材料與方法

1.研究對象

2015年1月-2015年3月間購買的新鮮動物肝臟，包括5塊豬肝、5塊鵝肝和10塊鴨肝。

2.QCT測量肝臟脂肪含量

所有樣本在購買當(dāng)天采用Toshiba Aquilion 80排螺旋CT掃描儀和Mindways 固體體模(Mindways Software Inc.,Austin,TX,USA)進行QCT掃描。樣本包埋于兩片豬肉中(大小為450 mm×250 mm×50 mm)，以模仿腹部軟組織，并使樣本在掃描過程中隔絕空氣。掃描參數(shù)：螺距0.985，床高120 cm，120 kV，125 mA，層厚1.0 mm，視野500 mm×500 mm，采用標(biāo)準(zhǔn)算法進行重建。圖像傳輸至QCT工作站，使用4.2 Version QCT PRO 3D spine module 軟件(Mindways Software Inc.,Austin,TX,USA)進行分析。軟件處理原始數(shù)據(jù)后自動生成3D圖像，在矢狀面圖像中，將3個圓柱形興趣區(qū)(regions of interest，ROI) 放置于樣本中心，層厚為9 mm，層間隔為12～18 mm，橫截面積為180～200 mm2(圖1)，任何含有空氣、血管或肝內(nèi)膽管的區(qū)域均被排除在外。軟件自動輸出QCT骨密度 (BMDSample)，斜率(slope)和區(qū)域一致性校正(field uniformity correction，F(xiàn)UC)。BMDSample值為3個ROI 的BMD平均值。根據(jù)Mindways提供的計算公式，計算樣本的脂肪百分比(β)：

HULiver=1047.9+(slope+0.2174)×4.842-999.6

HUFat=942.9-(slope+0.2174)×31.42-999.6

在上述計算公式中，ρSample代表樣本的有效骨密度值，HULiver和HUFat分別為樣本中純肝組織和純脂肪組織的CT值，ρLiver和ρFat指取樣組織內(nèi)純肝臟組織和純脂肪的有效密度值，β即為取樣組織內(nèi)純脂肪的體積百分比;HULiver和HUFat的數(shù)值來源于相關(guān)文獻(xiàn)對正常肝臟組織和正常脂肪組織中平均原子組成的定義[15]，并參照Mindways固體CT校準(zhǔn)體模中參考物質(zhì)的衰減特性進行了標(biāo)準(zhǔn)化處理。

所有QCT掃描和ROI測量由同一位經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的放射科住院醫(yī)師完成。所有樣本間隔1個月由同一位醫(yī)師重復(fù)測量一次，以評價兩次QCT測量的一致性。

3.Soxhlet化學(xué)萃取法測量肝臟脂肪含量

所有樣本的Soxhlet化學(xué)萃取法測量脂肪含量在國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心化學(xué)分析室進行，依據(jù)肉類和肉制品總脂肪量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)采用Soxhlet 萃取法進行測量[16]。

將與QCT測量區(qū)域?qū)?yīng)的中心部分切下(大小為80 mm×30 mm×30 mm)，避開血管和肝內(nèi)膽管區(qū)域，在(103±2) ℃下烘干、稱重。烘干樣本的脂肪含量采用Soxhlet化學(xué)萃取法進行測量。樣本的脂肪百分比為測量所得的脂肪重量/烘干前樣本的重量。

4.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。QCT測量的觀察者內(nèi)一致性采用組內(nèi)相關(guān)性系數(shù)(intraclass correlation coefficients，ICC)進行計算。對所有樣本的QCT脂肪百分比測量值(Fat%Q)與Soxhlet化學(xué)萃取法脂肪百分比測量值(Fat%S)的比較采用非參數(shù)檢驗(Wilcoxon)，并計算Spearman分析的相關(guān)性系數(shù),采用線性回歸分析計算預(yù)測方程。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

圖1 QCT測量的ROI選取。QCT后處理軟件自動生成軸面、矢狀面和冠狀面圖像。在矢狀面圖像的樣本中心區(qū)域選取上、中、下3個ROI，每個ROI的層厚均為9mm，橫截面積為180～200mm2，層間隔為12～18mm。a) 軸面圖像; b) 矢狀面圖像; c) 冠狀面圖像; d) 在矢狀面圖像的樣本中心區(qū)域選取上部ROI; e) 選取中部ROI; f)選取下部ROI。

討 論

本研究結(jié)果顯示，使用CT掃描儀和QCT體模測量動物肝臟樣本得到的脂肪含量與Soxhlet化學(xué)萃取法得到的結(jié)果高度相關(guān)，而且肝臟樣本的脂肪含量可以通過線性方程由QCT測得的脂肪含量進行預(yù)測，表明QCT可應(yīng)用于臨床進行NAFLD疾病的診斷和療效評估。

目前，CT掃描已經(jīng)被臨床應(yīng)用于NAFLD的診斷，其中CTL/S是最常用的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。由于脾臟的CT值衰減存在個體間差異，使用CTL/S對人群進行肝臟脂肪含量的測量和治療效果的評估并不準(zhǔn)確。QCT通過使用體外校準(zhǔn)體模，能夠比較不同個體之間的肝臟脂肪含量，并且檢測其變化。此外，單次CT掃描獲得的QCT數(shù)據(jù)能夠同時測量腰椎BMD、腹部脂肪面積和肝臟脂肪含量，有助于一次性完成老年人常見的肝臟脂肪變性、骨質(zhì)疏松和肥胖相關(guān)性疾病的診斷和評價。

采用常規(guī)CT掃描測量肝臟脂肪含量存在的主要爭議在于X線輻射危害。隨著CT掃描技術(shù)的進步，肝臟CT掃描的輻射劑量已大幅度降低[17]。在不影響測量準(zhǔn)確性的前提下，QCT掃描的輻射劑量可以降至常規(guī)肝臟掃描的一半，而縮小掃描范圍可進一步降低輻射劑量[18]。

采用常規(guī)CT和QCT體模測量動物肝臟脂肪含量目前尚未見文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果顯示采用常規(guī)CT和QCT體模可以準(zhǔn)確地測量脂肪含量為0.5%～52.6%的動物肝臟樣本。Nagy等[14]采用pQCT 測量26只雌性小鼠的肝臟脂肪含量，結(jié)果顯示pQCT測量肝臟脂肪含量有較高的精確度(觀察者內(nèi)變異系數(shù)為0.3%)，而且pQCT測得的肝臟衰減值與化學(xué)萃取法測得的肝臟脂肪含量有很高的相關(guān)度(r=-0.98，P<0.01)。Lubura等[19]也進行了驗證CT定量測量小動物肝臟脂肪含量的相關(guān)研究，參考標(biāo)準(zhǔn)為生化法測定的肝臟甘油三酯含量,結(jié)果顯示Micro-CT測得的肝臟脂肪含量與化學(xué)萃取法測得的肝臟甘油三脂含量之間有很高的相關(guān)度(r2=0.915)，與本研究結(jié)果接近(r2=0.925)。

圖2 QCT與Soxhlet化學(xué)萃取法對肝臟樣本脂肪含量測量結(jié)果的箱形圖。 圖3 QCT與Soxhlet化學(xué)萃取法對肝臟樣本脂肪含量測量結(jié)果的分布散點圖，兩種測量方法之間存在線性關(guān)系，線性回歸方程為Fat%S=0.74 Fat%Q+7.272 (r2=0.965,P<0.001) 。

在NAFLD患者和相關(guān)高風(fēng)險人群中，非增強CT被證實能可靠而有效地定量測量肝臟脂肪含量[20,21]。Shores等[20]的研究表明，肥胖患者測得的CTL-S (r=-0.80,P<0.001)、CTL/S(r=-0.80,P<0.001)這兩個參數(shù)與針吸穿刺和楔形切除肝臟活檢樣本中化學(xué)法測得的甘油三酯濃度呈高度負(fù)相關(guān)。除肝臟脂肪以外，肝臟和脾臟內(nèi)過多的鐵沉積、服用某些藥物(如胺碘酮)，都可能影響CT衰減值，從而降低對不同患者肝臟脂肪含量定量測量和疾病進展預(yù)測的準(zhǔn)確性[12,22,23]。

本研究的主要不足在于所有研究樣本均為離體樣本，樣本中含有的空氣氣泡可能影響QCT的測量準(zhǔn)確性。此外，本研究中所有動物肝臟樣本均為超市隨機購買，缺乏脂肪含量為20%～35%的肝臟樣本，而這一脂肪含量分布區(qū)間在臨床上對應(yīng)嚴(yán)重的肝臟脂肪變性。

綜上所述，以Soxhlet化學(xué)萃取法作為驗證參考標(biāo)準(zhǔn)，使用常規(guī)CT和QCT體模能夠準(zhǔn)確測量離體動物肝臟樣本的脂肪含量，進而可為臨床診斷肝臟脂肪變性和監(jiān)測疾病進展提供重要參考。

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Fat content measurement of animal livers using quantitative computed tomography

XU Li,DUANmu Yangyang,ZHANG Yong,et al.

Department of Radiology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China

Objective：To study the fat content measurement of animal livers in vitro by quantitative computed tomography (QCT) using chemical Soxhlet extraction technique as the standard reference.Methods：Five pig livers,5 goose livers and 10 duck livers were collected and QCT as well as chemical Soxhlet extraction were used individually to measure fat content for each sample.Fat percentage of all samples determined by QCT (Fat%QCT) and by Soxhlet chemical extraction (Fat%Soxhlet) was compared.Furthermore,linear regression analysis was used to detect the relationship between Fat%QCT and Fat%Soxhlet.Results：The fat percentage of pig liver,duck liver and goose liver measured by chemical extraction ranged from 0.5% to 2.3%,7.2% to 21%,and 35% to 52.6% respectively.The fat content of liver measured by QCT was lower than that measured by chemical Soxhlet extraction method,but there was no statistical significant difference between results of two methods (P=0.052).The two measurements were highly correlated (r=0.962,P<0.001).Fat%Soxhlet could be predicted by Fat%QCT with the equation as: Fat%Soxhlet=0.74 Fat%QCT+7.272 (r2=0.965,P<0.001).Conclusion：Fat content of animal liver can be measured accurately with a conventional computed tomography (CT) scanner with QCT phantom and software compared to the chemical Soxhlet extraction as standard reference.

Hepatic fat content; Quantitative CT; Tomography,X-ray computed; Chemical soxhlet extraction

100035 北京，北京積水潭醫(yī)院放射科(徐黎、端木羊羊、張勇、程曉光)；Mindways Software, Austin, TX, USA(Keenan Brown)；100094 北京，國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心化學(xué)分析室(張曼玲)

徐黎(1979-)，女，江蘇常州人，博士研究生，主要從事肌骨系統(tǒng)影像診斷、人體組織成分測量工作。

程曉光，E-mail：xiao65@263.net

國家自然科學(xué)基金青年項目(81401407)

R575.5; R814.42

A

1000-0313(2017)05-0466-05

10.13609/j.cnki.1000-0313.2017.05.008

2016-12-28 修回如期:2017-02-23)