孫明慧 孟慶輝 趙敏 王炎

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (哈爾濱工業(yè)大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué)) (哈爾濱工業(yè)大學(xué))

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交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯固定化漆酶的性質(zhì)1)

孫明慧 孟慶輝 趙敏 王炎

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (哈爾濱工業(yè)大學(xué)) (東北林業(yè)大學(xué)) (哈爾濱工業(yè)大學(xué))

為探究交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯為載體的固定化漆酶的優(yōu)勢(shì)，采用單因素分析法，在不同條件下對(duì)固定化漆酶和游離漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：與游離漆酶相比，固定化漆酶與底物2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)的親和力下降，但穩(wěn)定性明顯提高，最適pH值也發(fā)生了變化。固定化漆酶的最適溫度為60 ℃，比游離漆酶升高了5 ℃；固定化操作pH為3.5時(shí)，固定化漆酶的酶活力最高。固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚降解時(shí)間為24 h時(shí)，降解率達(dá)到了85%，酶活力保持80%以上，漆酶的使用效率和穩(wěn)定性明顯提高。

交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯；漆酶；固定化漆酶；游離漆酶

The experiment was conducted to study the advantage of laccase immobilization with the carrier being cross-linked polyglycol diacrylate. The control variate method was used to investigate the activity between laccase immobilization and free laccase from different conditions. Comparing with free laccase, appetency between immobilized laccase and 2,2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) descends, but the stability was improved and the optimum pH changed. The pH effect in the immobilization process was conducted simultaneously. The proper temperature of immobilized laccase was 60 ℃ and 5 ℃ higher than that of free laccase. The activity of immobilized laccase got the highest level when pH was 3.5. At last, the immobilized laccase was used in the biocatalysis of 2,4-dichloro-phenol. Results indicate that the degradation ratio achieved 85% in 24 h, and the kept activity was more than 80% with better use efficiency and stability of laccase.

漆酶屬于氧化型酶，能夠催化多種酚型和非酚型化合物分解，底物主要包括單酚、甲基替代單酚、多酚、聚甲氧基苯、苯硫醇、芳香胺等易氧化的化合物[1]。在工業(yè)染料脫色[2]、工業(yè)污水處理等領(lǐng)域，具有重要應(yīng)用價(jià)值[3]。游離酶雖然活性高，但卻因其易流失、易變性失活、回收利用困難、損失量大等缺點(diǎn)，在工業(yè)化使用中存在困難[4]。因此，實(shí)現(xiàn)漆酶的固定化，是推行漆酶在工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。

本文探究了一種較為新穎的固定化材料，即交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯，將它作為載體包裹漆酶，并以此進(jìn)行研究。孟慶輝[5]研究證明，最佳固定化條件為0.075 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液稀釋103倍的漆酶溶液，以酶液量30 mL∶載體0.1 g的比例，在pH為3.5的偏酸性環(huán)境中固定4 h后取出，4 ℃下靜置15 h，在此條件下載體上漆酶的負(fù)載量為0.792 mg/g。本文在此基礎(chǔ)上研究了固定化漆酶的穩(wěn)定性、酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)2,4-二氯苯酚(DCP)的降解特性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器

漆酶，是由諾維信(中國)公司贈(zèng)送，未作進(jìn)一步純化處理；交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯，自合成；標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn)；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，SIGMA公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)G-250、4-氨基安替比林、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鐵氰化鉀，均為分析純；2,4-二氯苯酚，為化學(xué)純。

pHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；離心機(jī)，Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2 漆酶的固定化方法

稱取一定質(zhì)量交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯，放入燒杯，在燒杯中加入適量稀釋后的漆酶溶液，封口，放入搖床，搖床溫度設(shè)置為25 ℃，固定化4 h，然后放在4 ℃條件下靜置15 h。將固液分離開，棄掉液體；得到的固定化漆酶顆粒，將其用蒸餾水沖洗多次并檢測(cè)洗滌液蛋白含量，需洗到洗滌液中無蛋白檢出。隨后，對(duì)固定化漆酶顆粒進(jìn)行低溫烘干，得到干燥的固定化漆酶。

1.3 酶活力的測(cè)定

(1)游離漆酶的活性測(cè)定[6]：以ABTS為底物，在比色皿中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、稀釋104倍的漆酶溶液和1 mmol/L的ABTS溶液各1 mL；測(cè)定25 ℃條件下，反應(yīng)體系在光照420 nm處，反應(yīng)初始以及反應(yīng)3 min時(shí)的吸光度值，計(jì)算漆酶活力。

(2)固定化漆酶的活性測(cè)試[7]：以ABTS為底物，在25 ℃條件下，測(cè)定初始時(shí)ABTS和緩沖液混合液在420 nm處的吸光度值；然后用固定化漆酶催化ABTS分解反應(yīng)3 min后，立即進(jìn)行冰浴(時(shí)間為9 min)，迅速終止反應(yīng)，離心取上清液，測(cè)定其在420 nm處的吸光度。

(3)酶活力的計(jì)算方法：在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)，催化1 μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量，定義為1個(gè)U[8]。漆酶的活力計(jì)算公式為：

PV=((AV/εt)×1 000)/V0；

(1)

PM=((AV/εt)×1 000)/M0。

(2)

式中：PV為游離漆酶的酶活力；PM為固定化漆酶的酶活力；A為反應(yīng)時(shí)間t內(nèi)的吸光度變化值(A<0.5)；V為比色皿中溶液的體積(3 mL)；M0為固定化漆酶的質(zhì)量(g)；V0為反應(yīng)體系中游離漆酶溶液體積(mL)；ε為底物ABTS在420 nm處的消光系數(shù)(360 mmol-1·cm-1)[7]。

固定化漆酶的酶活力單位是“U/(g·min)”，在默認(rèn)時(shí)間為1 min時(shí)也記作U/g，表示每克固定化漆酶所對(duì)應(yīng)的酶活力。

(4)檢測(cè)固定化漆酶活力指標(biāo)有2個(gè)，分別是固定化效率和負(fù)載量[9]，計(jì)算公式如下：

固定化效率=((加入總酶活力-上清液總酶活力)/加入總酶活力)×100%；

負(fù)載量(T)=((加入總酶蛋白含量-上清液蛋白含量)/載體質(zhì)量)×100%。

1.4 固定化漆酶處理2,4-二氯苯酚

在錐形瓶中加入100 mL一定濃度的2,4-二氯苯酚的溶液，實(shí)驗(yàn)組加入定量的固定化漆酶，對(duì)照組只加入載體不加入固定化漆酶。分別封口放入搖床中慢速(50 r/min)振蕩，使反應(yīng)物與反應(yīng)底物充分接觸。每間隔一段時(shí)間取0.5 mL上清液，測(cè)定其在510 nm處的紫外分光光度值(方法為4-氨基安替比林法)，得到催化動(dòng)力學(xué)曲線。探究在不同條件下，如底物濃度、pH、酶量等條件不同時(shí)，會(huì)對(duì)固定化漆酶分解2,4-二氯苯酚產(chǎn)生何種影響。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 漆酶最佳固定化條件

2.1.1 漆酶固定化時(shí)間的選擇

取7份各0.2 g的交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯，在固定化時(shí)間不同、其他都相同的條件下固定，固定化時(shí)間為1～7 h，每隔1 h取1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，而靜置時(shí)間都為12 h，然后測(cè)定固定化漆酶的活力。結(jié)果顯示，固定化漆酶活力最高時(shí)，固定化時(shí)間為4 h(見圖1)。

圖1 固定化時(shí)間對(duì)固定化漆酶活力的影響

2.1.2 靜置時(shí)間的選擇

如上，取9份0.2 g載體，同條件下進(jìn)行固定(靜置時(shí)間不同)；上一步實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果，取固定化時(shí)間4 h；而靜置時(shí)間為變量每隔3 h取1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為0、3、5、7、13、15、17、20、24 h。結(jié)果顯示，固定化漆酶的活力最高時(shí)，靜置時(shí)間為15 h(見圖2)。

圖2 靜置時(shí)間對(duì)固定化漆酶活力的影響

2.1.3 漆酶給酶量的選擇

酶液稀釋倍數(shù)的選擇：酶液的稀釋倍數(shù)，是漆酶固定化過程中的關(guān)鍵因素之一。本實(shí)驗(yàn)分別選擇稀釋倍數(shù)為1.0×102、2.5×102、5.0×102、1.0×103、2.5×103、5.0×103的酶液10 mL，分別用0.2 g等量載體進(jìn)行固定化，固定化時(shí)間和靜置時(shí)間都相同。由圖3可見：初始階段，漆酶溶液稀釋倍數(shù)與固定化后的活力呈負(fù)相關(guān)，在稀釋倍數(shù)為1.0×103時(shí)，酶活力達(dá)到最高值，隨后隨著漆酶溶液稀釋倍數(shù)的增加又與酶活力呈負(fù)相關(guān)，即隨著酶液稀釋倍數(shù)升高，固定化后的酶活力反而下降。

圖3 稀釋倍數(shù)對(duì)固定化漆酶活力的影響

給酶量的選擇：固定化酶在載體中含量的多少對(duì)固定化酶酶活力有很大影響。在1.0×103稀釋倍數(shù)前提下，控制固定化過程中加入的酶液量，分別在5～25 mL之間平均取5個(gè)數(shù)值，各用0.2 g載體進(jìn)行固定化。其中加酶量為15 mL酶活最高(見圖4)。

圖4 酶液量對(duì)固定化漆酶活力的影響

2.1.4 固定化pH值的選擇

分別用pH值為3.0～7.0(每隔0.5取1個(gè)值)的磷酸緩沖液代替蒸餾水，對(duì)原酶液進(jìn)行1.0×103倍稀釋。然后，分別用0.2 g等質(zhì)量的載體，在其他條件相同、但不同的pH環(huán)境下，進(jìn)行固定化、活力測(cè)試。結(jié)果顯示，在緩沖液pH為3.5時(shí)，固定化漆酶的活力最好(見圖5)。

圖5 固定化pH對(duì)固定化漆酶活力的影響

2.1.5 離子濃度選擇

等質(zhì)量同條件的固定化漆酶，在離子濃度不同，但pH相同的緩沖溶液中，進(jìn)行固定化漆酶的活性測(cè)試。研究表明，當(dāng)離子濃度為0.075 mol/L時(shí)，固定化漆酶的活力最高(見圖6)。

圖6 離子濃度對(duì)固定化漆酶活力的影響

2.2 固定化漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)pH值

取固定化漆酶9份(每份0.03 g)，分別進(jìn)行不同pH值環(huán)境下的活性測(cè)試。同樣對(duì)游離漆酶進(jìn)行了最適pH值測(cè)定(見圖7)。結(jié)果表明，當(dāng)pH=3.5時(shí)，固定化漆酶的活性最好；游離漆酶的最適pH值相對(duì)高些，為4.2。說明固定以后，漆酶的最適pH值稍微向偏酸性方向移動(dòng)，此時(shí)固定化漆酶比游離漆酶的耐酸性得到提高。

圖7 pH值對(duì)漆酶活力的影響

2.2.2 最適反應(yīng)溫度

對(duì)固定化漆酶和游離漆酶進(jìn)行最適反應(yīng)溫度測(cè)試(見圖8)。結(jié)果表明，游離漆酶在55 ℃時(shí)活性最高；固定化漆酶的酶活力，隨著溫度的上升而不斷地升高，在60 ℃時(shí)達(dá)到最高值。說明經(jīng)過固定化后的漆酶，比游離漆酶耐高溫性得到了提高。

圖8 漆酶活力與溫度的關(guān)系

2.2.3 米氏常數(shù)

在不同底物濃度下，分別測(cè)定同樣稀釋了104倍的游離漆酶和固定化漆酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，計(jì)算酶反應(yīng)的初速度。通過雙倒數(shù)做圖可計(jì)算米氏常數(shù)(Km，見圖9)。其中：游離漆酶的Km為7×10-5mol/L，固定化漆酶的Km為3.37×10-4mol/L，說明固定化漆酶與底物ABTS的結(jié)合能力降低。

2.2.4 固定化漆酶的穩(wěn)定性

pH值穩(wěn)定性：將干燥的固定化漆酶在酸性條件的微環(huán)境中(pH=3～5)保存1 h，其相對(duì)活力仍然很高，基本保持在80%左右；而游離漆酶在微環(huán)境中相對(duì)活力較高的pH范圍在4～6之間(見圖10)?？傮w看，與游離漆酶相比，固定化漆酶的pH穩(wěn)定性更偏向酸性，而在工業(yè)化應(yīng)用中，環(huán)境多偏酸性，這為固定化漆酶在工業(yè)化的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

熱穩(wěn)定性：將游離漆酶和干燥固定化漆酶置于70 ℃的水浴鍋中封閉加熱，每1 h進(jìn)行1次測(cè)試(見圖11)。加熱的時(shí)間越長(zhǎng)，固定化漆酶和游離漆酶的活性降低越明顯，尤其在1 h之內(nèi)活性急劇下降，固定化漆酶的活性隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，慢慢下降速率變小，但固定化漆酶活力仍然略高于游離漆酶。因此，與游離漆酶相比，固定化漆酶更加穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性能更好。

圖9 游離漆酶和固定化漆酶的反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的雙倒數(shù)曲線圖

圖10 固定化漆酶和游離漆酶的pH穩(wěn)定性

圖11 70 ℃下加熱時(shí)間對(duì)酶活力的影響

使用穩(wěn)定性：衡量固定化漆酶性能的另一個(gè)重要指標(biāo)，是它的使用穩(wěn)定性。研究結(jié)果(見圖12)表明，經(jīng)過2～3次使用后，固定化漆酶的酶活力均為初始酶活力的90%以上，且在使用了6次之后，活性仍為初始酶活力的60%以上。證明了固定化漆酶具有較好的使用穩(wěn)定性。

圖12 使用次數(shù)對(duì)固定化漆酶酶活力的影響

放置穩(wěn)定性：將游離漆酶和固定化漆酶同時(shí)放置于室溫下封閉保存，定時(shí)(24 h)測(cè)定1次活性(見圖13)。研究表明，固定化漆酶在放置過程中活性變化不大；而游離漆酶的活性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷的降低，但由于游離漆酶的初始酶活力較高，在12 d左右才與固定化漆酶活力相近。雖然固定化漆酶的活性遠(yuǎn)低于游離漆酶，但在存放過程中固定化漆酶更穩(wěn)定，更適合工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。

圖13 游離漆酶和固定化漆酶的放置穩(wěn)定性

2.2.5 固定化漆酶的活性

用最優(yōu)固定化條件下制得固定化漆酶，并對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)定。根據(jù)公式(1)、(2)計(jì)算得到固定化漆酶的最高活性為54.63 U/(g·min)(比活性為68.91 U/(mg·min))，遠(yuǎn)低于游離漆酶的活性(2 656.09 U/(mg·min))；漆酶的固定化效率為54.4%；負(fù)載量達(dá)到了0.793 mg/g載體。

2.3 固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚的降解

2.3.1 固定化漆酶與游離漆酶降解2,4-二氯苯酚(DCP)的比較

載體和周圍環(huán)境對(duì)DCP無任何的降解作用(見圖14)，而固定化漆酶可對(duì)DCP降解，因此說明是載體上的漆酶分子對(duì)其的降解作用；且時(shí)間越長(zhǎng)降解率越大。游離漆酶，因初始沒有損耗，因此降解速率會(huì)高于固定化漆酶；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，二者的變化速率減慢，最終固定化漆酶降解率為84.5%，而游離漆酶的降解率為89%左右。但是，在相同單位質(zhì)量蛋白的情況下降解二氯苯酚，所用固定化漆酶體積與游離漆酶體積比為13∶1。說明固定化漆酶降解DCP的效果更好。

pH值對(duì)催化降解效果的影響：由于微環(huán)境對(duì)酶的催化活性影響很大，因此本文研究了固定化漆酶降解DCP過程中pH值的影響(見圖15)。固定化漆酶對(duì)DCP降解的最適pH值在6～7之間，而游離漆酶在4～6之間。固定化漆酶在降解過程中最適pH值變大，說明可以克服漆酶僅在偏酸條件下才能使用的缺點(diǎn)，使用范圍也因此擴(kuò)大。

圖14 降解率-時(shí)間變化曲線

圖15 pH值對(duì)游離漆酶和固定化漆酶降解2,4-二氯苯酚的影響

底物質(zhì)量濃度對(duì)降解效果的影響：影響固定化漆酶降解DCP的因素有很多，例如，底物的質(zhì)量濃度不同也會(huì)影響固定化漆酶對(duì)DCP的降解能力(見圖16)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，降解效果最好。

圖16 底物質(zhì)量濃度對(duì)降解的影響

固定化漆酶量對(duì)降解的影響：對(duì)于相同質(zhì)量濃度的DCP溶液，酶量不同降解能力也不同(見圖17)。當(dāng)m(固定化漆酶量)∶m(酚量)=143∶1時(shí)，降解率最高，達(dá)到了85%。

降解時(shí)間對(duì)降解率的影響：實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)降解時(shí)間變更為30 h時(shí)，游離漆酶和固定化漆酶的降解能力均有提升，但提升的范圍很小(見圖14)。反應(yīng)時(shí)間變?yōu)?8 h時(shí)，兩者對(duì)DCP降解率達(dá)到穩(wěn)定。

2.3.2 固定化漆酶使用批次

取一定的固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚進(jìn)行降解，進(jìn)行了5批次實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)比游離漆酶，固定化漆酶在使用穩(wěn)定性方面有很大優(yōu)勢(shì)，酶活力達(dá)到初始值的80%以上，且在6.0h左右的降解率最高，到達(dá)到了40.6%，基本維持在32.9%以上。

圖17 固定化漆酶對(duì)DCP的降解批次

3 討論

漆酶在載體上的吸附，不僅受到固定化時(shí)間、靜置吸附時(shí)間以及給酶量的影響。而漆酶在載體上吸附的狀態(tài)并不是靜止的，整個(gè)過程是漆酶分子和載體間的動(dòng)態(tài)平衡，因此，載體對(duì)漆酶分子吸附量的大小，對(duì)固定化后漆酶顆?；钚缘陌l(fā)揮起著十分重要作用。由圖1、圖2可見，固定化漆酶的活性，先是隨著固定化時(shí)間和靜置時(shí)間延長(zhǎng)而增大的，經(jīng)過一段時(shí)間之后降低。原因是，開始時(shí)載體可吸附的蛋白量低于動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn)，時(shí)間越長(zhǎng)吸附的蛋白分子量越大，因此酶活力會(huì)上升。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附的蛋白分子越來越多，底物接近酶活力中心的概率越小，因此會(huì)有活性降低的現(xiàn)象[9]。圖3中的原液稀釋倍數(shù)對(duì)活性也有很大影響，在稀釋倍數(shù)為103時(shí)活性最高，兩端都呈下降狀態(tài)。原因是，當(dāng)稀釋倍數(shù)小，酶濃度高時(shí)，載體吸附蛋白量大，載體上的蛋白單位空間更小，因此與底物親和力下降。而當(dāng)稀釋倍數(shù)過大，酶濃度低，酶分子撞擊載體分子的概率小，因此載體上酶蛋白的吸附量小，導(dǎo)致酶活力降低。圖4中顯示，pH對(duì)固定化漆酶的活性影響也很大，原因是，H+參與了固定化的過程，首先當(dāng)H+遇到了CO后會(huì)攻擊碳原子，將電子云引到O周圍，因此CO變得不穩(wěn)定，碳原子親電性增加。酶蛋白分子上的NH2—親和有親電性C原子，使載體和酶蛋白分子更親和，兩者偶聯(lián)量增加。因此穩(wěn)定性更好，活性更高。盧磊等[10]實(shí)驗(yàn)證明，離子強(qiáng)度大會(huì)引起酶的變性失活，因此酶學(xué)活性降低，本文研究結(jié)果與之相似。

固定化漆酶能進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用，關(guān)鍵在于酶是否有穩(wěn)定的理化性質(zhì)。本文研究了固定化漆酶和游離漆酶的pH值、溫度、穩(wěn)定性等問題，以及固定化漆酶的米氏常數(shù)(Km)。研究表明，固定化漆酶的最適pH值較游離漆酶向酸性方向移動(dòng)，這是由于載體在結(jié)合蛋白分子時(shí)，需要消耗微環(huán)境中H+，使最適pH發(fā)生了改變，pH穩(wěn)定性也發(fā)生了變化。通常，游離漆酶的pH穩(wěn)定性范圍在4～6，被固定化后pH穩(wěn)定性范圍變成了3～5。Tisher et al[11]認(rèn)為，產(chǎn)生這種變化的原因，載體在反應(yīng)過程中產(chǎn)生質(zhì)子，由于CO中的O可以吸引電子云，使得NH2—中的H+解離出來，因此載體的微環(huán)境的H+增多，pH減小，整個(gè)體系pH穩(wěn)定性范圍發(fā)生偏移。固定化漆酶的最適溫度比游離漆酶升高了5 ℃，是由于載體特有的包埋結(jié)構(gòu)保護(hù)了酶蛋白分子，加上酶分子間的作用力以及載體與蛋白分子間的作用力相互所用，使得固定化漆酶的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，因此抗變性能力和熱穩(wěn)定性都有所提高。而游離漆酶由于較為離散，容易變性失活[11](見圖11)。衡量固定化漆酶性能的另一個(gè)重要指標(biāo)是使用穩(wěn)定性[12]，研究表明(見圖12)，固定化漆酶循環(huán)使用7次后，活性降低明顯，僅為原來的50%，但繼續(xù)使用后活性變化并不明顯，說明一部分蛋白為游離蛋白，并沒有完全結(jié)合在載體上，導(dǎo)致固定化漆酶穩(wěn)定性降低。固定化漆酶載體對(duì)漆酶分子的有效保護(hù)，主要體現(xiàn)在放置穩(wěn)定性。從圖13可見，固定化漆酶每日活性幾乎無變化，但游離漆酶的活性卻逐日降低，是因?yàn)檩d體特有的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)和溶脹性質(zhì)對(duì)漆酶的分子結(jié)構(gòu)的保持起到了保護(hù)的作用。

固定化漆酶活力遠(yuǎn)低于游離漆酶的活性，是由于漆酶在固定化過程中，搖床振蕩導(dǎo)致混合物體系整體溫度上升，溫度越高，酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)越可能發(fā)生變化，因此固定化過程中酶量損失較大。酶活力降低的另一個(gè)原因，是載體和環(huán)境中的雜質(zhì)，雜質(zhì)過多會(huì)影響酶與底物的親和力，從而導(dǎo)致酶活力降低[13-14]。

與游離漆酶相比，固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚的降解效果更好(見圖14)。在底物濃度13倍于游離漆酶體系的降解過程中，固定化漆酶最終達(dá)到了與游離漆酶幾乎一樣的降解效果。其中，載體對(duì)2,4-二氯苯酚完全沒有降解作用[15]。固定化漆酶的使用穩(wěn)定性特點(diǎn)，在這得到了完美的體現(xiàn)。降解的過程中，酶分子周圍的微環(huán)境對(duì)降解率有很大影響。例如，當(dāng)pH=6.5時(shí)，固定化漆酶降解效率最高，而游離漆酶的最適pH卻為5.5。原因，2,4-二氯苯酚本身就偏酸性，且固定化載體中CO具有的吸電子作用，使得—OH離解出H+，從而微環(huán)境pH降低，使固定化漆酶降解DCP最適pH發(fā)生偏移[16]。而底物的質(zhì)量濃度越大，降解效率越低，是因?yàn)檩^高質(zhì)量濃度的2,4-二氯苯酚具有毒性，使得部分漆酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去活力，因此降解率降低；若底物質(zhì)量濃度較低，對(duì)于少量的固定化漆酶而言，漆酶分子進(jìn)攻氯原子的幾率下降，也會(huì)因此導(dǎo)致降解率低。當(dāng)體系中固定化漆酶量(g)∶2,4-二氯苯酚(g)=143∶1時(shí)，達(dá)到了最好的降解效果，也是由于在此濃度時(shí)底物進(jìn)攻酶分子幾率增加，而此時(shí)底物對(duì)酶分子的毒性較弱，所以能得到最佳降解效果。

4 結(jié)論

漆酶最佳的固定化條件：酶液量30 mL∶載體(交聯(lián)聚乙二醇二丙烯酸酯)0.1 g，酶液濃度為稀釋103倍的漆酶液，固定化操作時(shí)，PBS溶液濃度為0.075 mol/L，pH=3.5，固定時(shí)間4 h，之后4 ℃條件下靜置15 h。

固定化漆酶在60 ℃時(shí)體現(xiàn)了最佳活性，比游離漆酶的最適溫度55 ℃升高5 ℃；70 ℃下，固定化漆酶比游離漆酶更不易失活；固定化漆酶的最適pH=3.5，比游離漆酶的最適pH向偏酸方向移動(dòng)；固定化漆酶的pH穩(wěn)定范圍3～5，游離漆酶在pH為4～6之間的微環(huán)境中相對(duì)活力保持較高；固定化漆酶的Km為3.37×10-4mol/L，固定化漆酶對(duì)底物的降解能力小于游離漆酶；固定化漆酶使用6次后，酶活力保留仍為60%以上；固定化漆酶活力日變化不大，游離漆酶的活性逐日降低，穩(wěn)定性得到提高。

固定化效率為54.4%；固定化漆酶活力為54.63 U/(g·min)，載體負(fù)載量為0.793 mg/g載體；遠(yuǎn)低于游離漆酶的活性2 656.09 U/(mg·min)。

實(shí)驗(yàn)中采用固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚(DCP)進(jìn)行了降解，并對(duì)降解過程中的各個(gè)條件因素，如底物質(zhì)量濃度、pH、給酶量等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：底物質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí)，固定化漆酶對(duì)相應(yīng)底物的降解效果最好；固定化漆酶降解時(shí)，最適pH范圍在6～7之間，而游離漆酶降解的最適pH范圍在4～6之間，最適pH范圍向堿性方向移動(dòng)。當(dāng)固定化漆酶量(mg)∶2,4-二氯苯酚量(mg)=143∶1時(shí)，24 h后降解效率高達(dá)85%；與游離漆酶相比，固定化漆酶對(duì)2,4-二氯苯酚的降解能力提高，當(dāng)降解時(shí)間延長(zhǎng)，降解率變化速率減小并逐漸趨近于0；在固定化漆酶降解2,4-二氯苯酚5次實(shí)驗(yàn)中，酶活力的保留能力均達(dá)80%以上。

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更 正

2017年第45卷第2期文章《秦嶺火地塘林區(qū)不同海拔森林土壤NO通量》一文中，作者侯琳和陳書軍的單位由陜西秦嶺森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站，改為西北農(nóng)林科技大學(xué)，特此更正。

Immobilization of Laccase on Cross-linked Polyglycol Diacrylate//

Sun Minghui(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Meng Qinghui(Harbin Institute of Technology); Zhao Min(Northeast Forestry University); Wang Yan(Harbin Institute of Technology)//

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(4)：99-105.

Cross-linked polyglycol diacrylate; Laccase; Immobilized laccase; Free laccase

1)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51678120)。

孫明慧，女，1992年6月生，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。E-mail：503023421@qq.com。

趙敏，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail：82191513@163.com。

2017年1月5日。

Q554

責(zé)任編輯：張 玉。