馬曉梅,王 軍,2,曠文豐,褚 凱,陳 晨 ,毛偉力*

(1.上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

有機(jī)消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響

馬曉梅1,王 軍1,2,曠文豐1,褚 凱1,陳 晨1,毛偉力1*

(1.上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

為了篩選對發(fā)酵液中棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c的分生孢子產(chǎn)量無副作用的消泡劑，在PDA培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.4%和0.7%的10種消泡劑。其中天然油脂(豆油)、聚醚類(GPE-6330，GP-6301)和有機(jī)硅類(L-101a，L-104a)對菌株Tr148c的生長抑制率都顯著低于其它消泡劑(P≤0.05)。將篩選出的5種消泡劑進(jìn)行消泡測試，發(fā)現(xiàn)GPE-6330、L-101a和L-104a在消泡和抑泡能力上都分別顯著優(yōu)于豆油和GP-6301(P≤0.05)。考察了GPE-6330、L-101a和L-104a的用量及對菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響。在相同條件下，當(dāng)L-101a對發(fā)酵液的消泡和抑泡效果達(dá)到生產(chǎn)工藝要求時，其用量以及對菌株Tr148c分生孢子產(chǎn)量的影響都顯著優(yōu)于GPE-6330和L-104a(P≤0.05)。

木霉菌；有機(jī)消泡劑；液體發(fā)酵；消泡能力

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種已廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果和花卉等多種經(jīng)濟(jì)作物上的生防微生物，具有競爭、重寄生、抗生、誘導(dǎo)抗性和促進(jìn)生長等多種功能，在作物病害生物防治中起到了重要作用[1-2]。木霉菌孢子制劑是目前應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種主要形式[3]。如何獲得大量的木霉菌孢子，是制備木霉菌孢子制劑的關(guān)鍵[4]。雖然深層液體發(fā)酵技術(shù)為木霉菌孢子產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來了可能性，但在液體發(fā)酵過程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸加大以及培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物積累等原因，發(fā)酵液會產(chǎn)生大量的泡沫[5]。當(dāng)泡沫超過一定范圍時，極易造成發(fā)酵液漫罐、雜菌污染或必須降低裝料系數(shù)等不利影響[6]。張路軍等[7]采用有效的消泡劑，可使谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備利用率達(dá)90%。因此，對發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的泡沫加以控制，是一項必要的技術(shù)措施。

目前液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)所采用的消泡方法有物理消泡法(如機(jī)械攪拌、靜電、冷凍、高速離心、加/減壓和超聲波[8])和化學(xué)消泡法。添加化學(xué)消泡劑經(jīng)濟(jì)方便，而且消泡效果好，在液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[9]。發(fā)酵工業(yè)常用的化學(xué)消泡劑有4類，分別是油脂、聚醚、有機(jī)硅和聚醚改性硅氧烷[10]。不同的化學(xué)消泡劑對微生物菌體生長的影響不同，它們可能會降低或抑制發(fā)酵微生物的生長和產(chǎn)量。李剛等[11]發(fā)現(xiàn)消泡劑磷酸三丁酯對光合細(xì)菌生長的抑制作用極為顯著。崔耀軍[5]發(fā)現(xiàn)消泡劑LB-625不僅對BAA中溫ɑ-淀粉酶發(fā)酵液體的消泡、抑泡作用明顯，而且對菌體生長無抑制作用，從而提高了發(fā)酵液的放罐體積和酶產(chǎn)量。

有機(jī)消泡劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、造紙和農(nóng)藥等多種行業(yè)的發(fā)酵生產(chǎn)中[12-15]。但有機(jī)消泡劑應(yīng)用于棘孢木霉菌分生孢子發(fā)酵生產(chǎn)的報道還很少。作者通過比較多種消泡劑在發(fā)酵過程中對棘孢木霉菌株Tr148c生長的影響和對泡沫的控制能力，篩選出適合菌株Tr148c深層液體發(fā)酵生產(chǎn)分生孢子的消泡劑，擬為工業(yè)化生產(chǎn)木霉菌孢子制劑和穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、培養(yǎng)基及試劑

棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c，由上海萬力華生物科技有限公司從采自安徽合肥的土壤樣品中篩選獲得，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No：5201)。

PDA培養(yǎng)基：在200 g去皮土豆中加入500 mL水，煮沸20 min，過濾，上清液中加葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，充分混勻，定容至1 L。分裝到1 L三角瓶中，裝液量500 mL，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至50 ℃，無菌條件下倒入培養(yǎng)皿，冷卻后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在200 g去皮土豆中加入適量的水，煮沸20 min，過濾，上清液中加甘露醇30 g·L-1、酵母粉1 g·L-1，充分溶解，定容至1 L。裝液量為150/500 mL[4]，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻后備用。

消泡劑：豆油(天然油脂)，GPE-6330、GP-6301、GP-6303(聚醚類)，T-30c(高碳醇)，L-101a、L-104a、TSA-673(有機(jī)硅類)，LX-601、LX-603(聚醚改性聚硅氧烷類)，市售。

1.2 方法

1.2.1 斜面菌種培養(yǎng)

向250 mL茄瓶中加入80 mL PDA培養(yǎng)基，1×105Pa下滅菌20 min。斜面靜置冷卻后，在無菌條件下接種菌株Tr148c，并放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，然后放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.2 種子液的制備

在無菌條件下，刮取茄瓶中斜面生長的菌株Tr148c分生孢子，用無菌水配成5×107個·mL-1的分生孢子懸浮液(用血球計數(shù)法統(tǒng)計分生孢子數(shù)目)，即得種子液。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

將150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基加入到500 mL三角瓶中，1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至室溫。按4%的接種量將種子液在無菌條件下轉(zhuǎn)接入三角瓶中，初始發(fā)酵液的孢子量為2×106個·mL-1，于轉(zhuǎn)速為200 r·min-1、28 ℃下發(fā)酵144 h[4]，即得發(fā)酵液。

1.2.4 消泡劑對菌株Tr148c生長抑制率的測定

分別將每種消泡劑按0.1%、0.4%、0.7%的用量添加到PDA培養(yǎng)基中混勻，以不加消泡劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對照。1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至50 ℃，在無菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，待PDA培養(yǎng)基冷卻凝固后，用滅菌打孔器取直徑為5 mm的Tr148c菌體塊，分別接種于不同處理的平皿中央。每個處理3個平行，將平皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。采用SPSS軟件，Duncan′s Multiple Range Test統(tǒng)計學(xué)方法分析，顯著性差異 (P≤ 0.05,n=3)統(tǒng)計各種消泡劑對菌株Tr148c生長的影響(相同字母表示無顯著性差異)，按下式計算生長抑制率：

式中：D0為空白對照Tr148c菌絲生長半徑；D為經(jīng)消泡劑處理的Tr148c菌絲生長半徑。

1.2.5 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定

消泡能力：在1 000 mL量筒中加入200 mL已發(fā)酵48 h的發(fā)酵液作為起泡液，以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，當(dāng)泡沫高度達(dá)到量筒800 mL的位置時，迅速加入0.02%的消泡劑，同時用秒表記錄泡沫完全消失的時間。消泡時間短，即消泡劑的消泡能力強[9]。

抑泡能力：向1 000 mL量筒中加入200 mL上述發(fā)酵液、0.02%的消泡劑，攪拌均勻后以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，記錄10 min內(nèi)泡沫的生成量。泡沫生成量少，即消泡劑的抑泡能力強[9]。

1.2.6 消泡劑用量及其對菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響

將篩選出的消泡劑在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行用量(泡沫控制能力)及對菌株Tr148c產(chǎn)孢量影響的測試：在9個10 L發(fā)酵罐中，分別裝入6.5 L發(fā)酵培養(yǎng)液，加入0.1%篩選出的消泡劑(每種消泡劑做3個平行，隨機(jī)排列)，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至室溫，在無菌條件下加入4%的種子液，初始培養(yǎng)液的孢子量為2×106個·mL-1；同時將發(fā)酵罐在溫度28 ℃、通氣量5.8 L·min-1、攪拌速度250 r·min-1下培養(yǎng)144 h。用發(fā)酵罐中的消泡電極測定泡沫液位，以超過罐體80%為臨界點。每個發(fā)酵罐配備10%的消泡劑，當(dāng)發(fā)酵罐中的泡沫液位超過罐體80%時，自動流加消泡劑。分別在發(fā)酵60 h、84 h和108 h時記錄消泡劑用量，測定孢子量。

將篩選出的綜合性能最好的消泡劑，用以上相同的測試方法在2個750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行重復(fù)性驗證實驗。發(fā)酵罐在溫度28 ℃、通氣量250 L·min-1、攪拌速度150 r·min-1下培養(yǎng)144 h。每個發(fā)酵罐配備10%的消泡劑，消泡劑用量的記錄和孢子量的測定同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 消泡劑對菌株Tr148c生長的影響(圖1)

由圖1可以看出，當(dāng)消泡劑用量為0.1%和0.4%時，GP-6303、T-30c、LX-601和LX-603對菌株Tr148c的生長抑制率都超過了30%，T-30c甚至超過了60%，顯著高于其它消泡劑對菌株Tr148c的生長抑制率(P≤0.05)；當(dāng)消泡劑用量為0.7%時，GP-6303、T-30c、LX-601、LX-603和TSA-673對菌株Tr148c的生長抑制率分別為98.1%、67.76%、84.22%、71.76%和23.89%，顯著高于其它消泡劑對菌株Tr148c的生長抑制率(P≤0.05)；當(dāng)消泡劑用量為0.1%時，GP-6301對菌株Tr148c的生長有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)用量為0.4%和0.7%時，對菌株Tr148c的生長有一定的抑制作用。豆油、GPE-6330、L-101a和L-104a在任何用量下，對菌株Tr148c的生長不僅沒有抑制作用，相反有一定的促進(jìn)作用。特別是豆油，隨著用量的增加，促生長作用不斷增強。因此，選擇豆油、GPE-6330、GP-6301、L-101a、L-104a進(jìn)行消泡和抑泡能力的測定。

圖1 消泡劑對菌株Tr148c生長的影響

2.2 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定結(jié)果(表1)

表1 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定結(jié)果

Tab.1 Determination results of anti-foaming and foam- suppressing capabilities with defoaming agents

由表1可以看出，GPE-6330消泡能力顯著優(yōu)于豆油和GP-6301(P≤0.05)。雖然L-101a、L-104a和GP-6301的消泡時間之間無顯著性差異，但它們都顯著少于豆油所用的消泡時間(P≤0.05)。同時GPE-6330、L-101a和L-104a的抑泡能力顯著優(yōu)于GP-6301和豆油(P≤0.05)。因此，選擇GPE-6330、L-101a和L-104a進(jìn)行10 L發(fā)酵罐實驗。

2.3 消泡劑的用量及其對菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響測定結(jié)果

在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行菌株Tr148c的發(fā)酵實驗，消泡劑的用量及其對菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響見圖2。

圖2 消泡劑的用量(a)及其對菌株Tr148c產(chǎn)孢量(b)的影響

由圖2a可以看出，菌株Tr148c在10 L罐的發(fā)酵過程中，消泡劑L-101a、L-104a和GPE-6330的用量都隨著發(fā)酵時間的延長而增加，其中GPE-6330在發(fā)酵至84 h和108 h時的用量(145.2 mL、378.6 mL)都顯著少于L-104a的用量(170.6 mL、435.4 mL)(P≤0.05)，但顯著高于L-101a的用量(81.7 mL、173.4 mL)(P≤0.05)。

由圖2b可以看出，雖然菌株Tr148c的產(chǎn)孢量在所測試的3種消泡劑中，都隨著發(fā)酵時間的延長而增多，但當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到84 h和108 h時，加入了L-101a的菌株Tr148c的產(chǎn)孢量(1.75×108個·mL-1、2.25×108個·mL-1)都顯著高于加入了L-104a的產(chǎn)孢量(0.95×108個·mL-1、1.45×108個·mL-1)和GPE-6330的產(chǎn)孢量(1.25×108個·mL-1、1.65×108個·mL-1)(P≤0.05)。表明，L-101a在10 L發(fā)酵罐中，不僅具有良好的消泡、抑泡作用，同時對菌株Tr148c的菌絲生長及產(chǎn)孢的影響最小。因此，選用L-101a在750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行重復(fù)性驗證實驗。

在符合工藝要求條件下，菌株Tr148c在750 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了兩批次發(fā)酵，最終產(chǎn)孢量分別為2.3×108個·mL-1和2.4×108個·mL-1，有機(jī)消泡劑L-101a用量分別為11.0 L和10.5 L，達(dá)到了測試的預(yù)期要求。

2.4 討論

雖然多種有機(jī)消泡劑已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，但不同的發(fā)酵產(chǎn)品以及不同的發(fā)酵生產(chǎn)工藝所要求的有機(jī)消泡劑是不同的。朱文浩等[16]篩選了6種不同的有機(jī)消泡劑，測試它們對發(fā)酵液的消泡、抑泡能力，開發(fā)出了一種應(yīng)用在糖蜜酒精發(fā)酵中的高效消泡劑。胡廷等[17]對4種有機(jī)消泡劑進(jìn)行了篩選，選擇了一種有機(jī)硅消泡劑，應(yīng)用在味精發(fā)酵生產(chǎn)中。

目前，國內(nèi)外在消泡劑的性能測試方面尚無統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)良的消泡劑不但具有消泡效率高、經(jīng)濟(jì)成本低、安全無毒等特點[18]，同時還應(yīng)具備在發(fā)酵過程中不引起發(fā)酵產(chǎn)物代謝異常、符合發(fā)酵生產(chǎn)的工藝要求、不影響產(chǎn)量并有利于發(fā)酵產(chǎn)物的后續(xù)處理等特征[5]。劉躍等[9]和魏浩等[19]根據(jù)消泡劑的消泡、抑泡能力以及它們對菌體生長和發(fā)酵物產(chǎn)量的影響，篩選出一種最佳消泡劑。由此可見，當(dāng)選用的消泡劑與發(fā)酵物相容，同時還具有較好的消泡能力時，能提高發(fā)酵物的產(chǎn)量。本實驗選用有機(jī)硅類消泡劑L-101a用于棘孢木霉菌株Tr148c的液體發(fā)酵，用量少且對菌株的生長和分生孢子產(chǎn)量有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

通過平板測試對10種消泡劑與棘孢木霉菌株Tr148c的相容性進(jìn)行篩選，初篩出5種消泡劑進(jìn)行消泡、抑泡能力測定，進(jìn)而篩選出3種消泡劑GPE-6330、L-101a、L-104a進(jìn)行10 L發(fā)酵罐實驗，考察了消泡劑用量及其對菌株Tr148c產(chǎn)孢量的影響，最終篩選出了L-101a作為菌株Tr148c液體發(fā)酵的最佳消泡劑。作為一種有機(jī)硅消泡劑，L-101a不僅與菌株Tr148c相容性好，在液體發(fā)酵過程中的用量少且消泡、抑泡能力顯著，同時對菌株Tr148c菌體生長和分生孢子的產(chǎn)量具有促進(jìn)作用。

本研究初探了有機(jī)消泡劑在木霉菌發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，為消泡劑進(jìn)一步應(yīng)用于木霉菌孢子制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。

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Effect of Organic Defoaming Agent on Conidial Spore Production ofTrichodermaasperellumTr148c in Liquid Fermentation Process

MA Xiao-mei1，WANG Jun1,2，KUANG Wen-feng1，CHU Kai1，CHEN Chen1,MAO Wei-li1*

(1.ShanghaiW.L.H.Bio-techCo.，Shanghai201203,China；2.AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036,China)

InordertoscreenadefoamingagentusedintheliquidfermentationprocesswhichhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofTrichoderma asperellumstrainTr148c，0.1%，0.4%，0.7%ofeachof10defoamingagentswererespectivelyaddedintoPDAculturemedium.ThegrowthinhibitoryratesofstrainTr148cweresignificantlylower(P≤0.05)inthetreatmentswiththedefoamingagentsofnaturaloil(soybeanoil)，polyether(GPE-6330，GP-6301)andorganicsilicon(L-101a，L-104a)comparedtotheothers.Defoamingtestswith5selectedagentswereconducted，andtheresultsshowedthattheanti-foamingandfoam-suppressingcapabilitiesofGPE-6330，L-101aandL-104aweresignificantlybetter(P≤0.05)comparedtotheothers.ThedosagesofGPE-6330，L-101aandL-104a，andeffectsofthemontheconidialsporeproductionofstrainTr148cwereinvestigated.Whenanti-foamingandfoam-suppressingeffectsmetthetechnicalrequirementsunderthesameconditions，thedosageofL-101aduringthefermentationprocesswassignificantlyless(P≤0.05)andhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofstrainTr148ccomparedtothosewithGPE-6330andL-104a，respectively.

Trichodermaspp.;organicdefoamingagent;liquidfermentation;defoamingability

國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目(14C26213100929)

2016-10-13

馬曉梅(1987-)，女，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：759948123@qq.com；

毛偉力，博士，E-mail：weilimao@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.010

TQ458

A

1672-5425(2017)03-0040-05

馬曉梅,王軍,曠文豐,等.有機(jī)消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(3)：40-44.