肖玉潔，王 婷，黃立中*，楊 珊，周思春

（1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南 長沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

黃芩苷通過上調(diào)miR-126誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究

肖玉潔1，王 婷2，黃立中1*，楊 珊1，周思春1

（1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，湖南 長沙 410208；2.株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007)

目的 用黃芩苷干預人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，觀察黃芩苷對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響及作用機制。方法 用qRT-PCR檢測miR-126的表達變化，Western-blot檢測Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、p-p38和p53的表達，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果 miR-126在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達比正常乳腺細胞低，黃芩苷干預乳腺癌細胞后miR-126上調(diào)最為明顯（P<0.05）。用miR-126 mimics、miR-126 inhibitors轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，Western-blot顯示黃芩苷及miR-126 mimics作用于人乳腺癌細胞后Bcl-2表達水平下降，Caspase-9和Caspase-3的裂解產(chǎn)物、p-p38、p53表達增加，差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。MTT法顯示黃芩苷和miR-126均可抑制乳腺癌細胞的增殖，流式細胞術(shù)顯示黃芩苷與miR-126 mimics促進癌細胞凋亡。結(jié)論 黃芩苷可以抑制乳腺癌細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與通過上調(diào)miR-126調(diào)節(jié)凋亡相關基因有關。

乳腺癌；黃芩苷；miR-126；細胞凋亡

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，且發(fā)病率逐漸上升，其治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療及中醫(yī)藥治療等手段外，基因治療為新的發(fā)展方向[1-2]。microRNA正逐漸成為腫瘤診斷的指標，治療的新靶點，它可以通過調(diào)控下游通路影響腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[3-6]，其中miRNA-126是抑瘤性兼轉(zhuǎn)移抑制性的microRNA[7],但目前沒有臨床靶向藥。導師黃立中教授為中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學專家，臨床擅用黃芩治療乳腺癌，療效頗佳。黃芩苷(Baicalin，BAI)是黃芩的有效成分，抗腫瘤作用得到很多體內(nèi)外試驗的證實[8-10]，但從microRNA角度進行探討的研究很少。在前期試驗中已經(jīng)用miRNA芯片篩選出黃芩苷對乳腺癌細胞上調(diào)的4種miRNA：miR-126、miR-145、miR-100、let-7c[11]。本課題擬在前期試驗基礎上，通過轉(zhuǎn)染miR-126 mimics、miR-126 inhibitors，體外觀察黃芩苷對miR-126的調(diào)節(jié)作用，及促進乳腺癌細胞凋亡的機制，為乳腺癌的傳統(tǒng)中醫(yī)藥與基因治療的契合提供新思路及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中南大學湘雅醫(yī)學院中心實驗室細胞庫，正常乳腺細胞株Hs 578Bst購自上海拜力生物科技有限公司（均由美國標準生物制品收藏中心ATCC制備）。黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分數(shù)98.5%，產(chǎn)品批號：120608-201113。pMIR-REPORTTM質(zhì)粒購于美國Ambion公司。兔抗人Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、p53、p-p38單克隆抗體，山羊抗兔二抗，上海研晶生化試劑有限公司。

1.2 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（Heracell）：德國Heraeus公司。倒置顯微鏡（XDS-1B）：重慶光電儀器總公司。流式細胞儀（BD FACS Canto II)：美國BD公司。凝膠成像分體系統(tǒng)（GBOX-HR）：英國SYNGENE公司。PCR儀（2400 PCR system）：Perkin Elmer公司。熒光定量PCR儀（CFX96TOUCH）美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 乳腺癌細胞株MDA-MB-231及正常乳腺細胞株Hs 578Bst培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%小牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL)，37℃，100%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁生長，每間隔3天更換培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞用于進一步的實驗。

1.3.2 藥物制備 將黃芩苷干粉充分溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，配制成濃度為5 000 μmol/L的貯存液，避光，4℃保存?zhèn)溆?。使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度，DMSO的終濃度≤0.2%。

1.3.3 轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染按說明書操作。分組：空白對照組（空白對照組中加入同濃度的二甲基亞砜溶液），黃芩苷組（根據(jù)前期試驗結(jié)果加入 50 μmol/L的黃芩苷，miR-126組 （miR-126 mimics轉(zhuǎn)染目的細胞），LNA組 （將鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA） 修 飾 乳 腺 癌 細胞），LNA-126組（LNA修飾miR-126 inhibitors，用于轉(zhuǎn)染后干擾細胞內(nèi)miR-126的表達）。

1.3.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miRNA（1）總RNA的提取：轉(zhuǎn)染60 h后,按試劑盒說明提取各組細胞的總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄：RNasin（40 U/μL）0.25 μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）0.5 μL，5× RT Buffer 4 μL，dNTP （10 mM）0.75 μL，DTT（1 mmol/L）2 μL，miR-RT primers（1 μmol/L）1.2 μL，總RNA1 μg，無酶水至20 μL。（3）PCR的引物的設計和合成：U6（內(nèi)參）上下游引物序列:U6-FTGCGGGTG CTCGCTTCGGCAGC，U6-R GGTG TCGTGGAGTCGA CATTTG；miR-126引物序列：TCAAGAGCAATAAC GAAAAATGT；pre-miR-126上下游引物序列：pre-miR-126-FAACGTACTATGTGTCCGATCGC，pre-miR-126-RTCAACAGTATCACGATAGCTTA；miR-126 in hibitors引物序列：ACATTTTTCGTTATTGCTCTTGA；pre-miR-126 inhibitors上下游引物序列：pre-miR-126 inhibitors-FCAGCGCGTACCAAAAGTAATA，pre-miR-126 inhibitors-RGTACCGTGAGTAATAATGCGC。（4）PCR擴增：2×SYBR Mix10 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，MiR-PCR primers（5μmol/L）0.4 μL，miRNA RT產(chǎn)物 2.0 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。上機95°C，3 min；95°C，12 s；62°C，35 s,共35個循環(huán)。

1.3.5 Western blot法檢測蛋白表達 （1）轉(zhuǎn)染72 h后用細胞裂解液提取細胞蛋白質(zhì)液。BCA法測蛋白濃度。（2）以SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。將硝酸纖維素膜與相應一抗反應 （除p53用1∶200稀釋外，均1∶1 000稀釋），4℃過夜，PBS洗膜，與二抗反應，室溫孵育2 h，避光顯色。分析p53、caspase-3、caspase-9、bcl-2、bax、p-p38，以GAPDH作為內(nèi)參。凝膠圖像分析：將膠片進行掃描或拍照，用FluorChenm Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國Alpha）分析目標條帶和內(nèi)參條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.3.6 MTT法檢測細胞生長情況 MDA-MB-231細胞（1×104個/mL）接種于96孔培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)；50 μmol/L黃芩苷作用于 MDA-MB-231細胞 72 h；加入20 μL MTT液37℃培養(yǎng)4 h；離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，將培養(yǎng)板低速振蕩10 min；測定細胞生長情況；酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD 490 nm處各孔的吸光值。細胞生存率(%)=OD藥物組/ OD空白對照組×100%

1.3.7 流式細胞分析 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測乳腺癌細胞凋亡和細胞周期，具體操作步驟如下：MDA-MB-231細胞培養(yǎng)在6孔板直到70%–80%的融合，收集懸浮細胞 （1～5）×106/mL，1 500 r/min離心5 min，棄上清；4℃預冷的PBS洗細胞兩次，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入400 μL 1× Binding Buffer重懸細胞；1 500 r/min離心5 min，棄上清，1 mL PBS液清洗細胞2次；加入5 μL Annexin V FITC，混勻后室溫避光孵育15 min；加10 μL PI染色液 （50 μg/mL），混勻，室溫避光30 min；流式細胞儀檢測分析，并用ModFit LT 3.0軟件確定細胞周期。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中miRNA表達的影響

以正常乳腺Hs 578Bst細胞為對照，用Realtime PCR檢測，發(fā)現(xiàn)miR-126、miR-145、miR-100、let-7c在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達比正常乳腺細胞的低（P<0.05）（見表1），黃芩苷干預乳腺癌細胞后miR-126、miR-145、miR-100、let-7c的表達均上調(diào)，而以miR-126上調(diào)最為明顯（見圖1），提示miR-126可能作為抑癌miRNA參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，黃芩苷可能通過上調(diào)miR-126起到抗乳腺癌作用。

表1 黃芩苷上調(diào)的miRNA在正常乳腺和乳腺癌細胞中的表達情況 （±s，n=3）

表1 黃芩苷上調(diào)的miRNA在正常乳腺和乳腺癌細胞中的表達情況 （±s，n=3）

注：與Hs 578Bst細胞比較*P<0.05。

細胞Hs 578Bst MDA-MB-231 F值P值miR-126 1.06±0.25 0.14±0.12* 37.09 0.000 miR-145 1.07±0.28 0.40±0.18* 30.22 0.000 miR-100 0.68±0.25 0.28±0.18* 12.34 0.002 let-7 c 0.72±0.25 0.43±0.19* 7.081 0.009

2.2 Western-blot反應結(jié)果

Western-blot反應顯示黃芩苷及miR-126mimics作用于乳腺癌細胞72 h后觀察到p-p38、p53、Caspase-9和Caspase-3的裂解產(chǎn)物表達增加，Bcl-2表達水平下降（見圖1），均有統(tǒng)計學意義（見表2）。

表2 黃芩苷及miR-126對蛋白表達的影響 （±s，n=3）

表2 黃芩苷及miR-126對蛋白表達的影響 （±s，n=3）

注：與空白對照組比較*P<0.05。

組別空白對照組miR-126組黃芩苷組F值P值p53 0.99±0.17 1.19±0.21* 1.15±0.14* 4.162 0.038 Caspase-3 0.01±0.01 0.14±0.17* 0.11±0.14* 3.864 0.037 Caspase-9 0.00±0.01 0.18±0.25* 0.16±0.18* 3.345 0.022 Bcl-2 0.99±0.15 0.82±0.18* 0.87±0.11* 3.542 0.045 p-p38 1.01±0.16 1.35±0.24* 1.23±0.27* 7.146 0.041

圖1 MDA-MB-231細胞p53、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和p-p38的蛋白表達

2.3 黃芩苷對乳腺癌細胞生存率及凋亡的的影響

MTT法顯示，對于乳腺癌細胞MDA-MB-231，轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 72 h后細胞存活率較空白對照組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；黃芩苷作用后癌細胞的生存率較空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，黃芩苷與miR-126mimics均可促進 MDA-MB-231細胞凋亡，miR-126組效果更明顯，見表3。

表3 黃芩苷對乳腺癌細胞生存率及凋亡的影響 （±s，n=3）

表3 黃芩苷對乳腺癌細胞生存率及凋亡的影響 （±s，n=3）

注：與空白對照組比較*P<0.05。

組別空白對照組黃芩苷組miR-126組F值P值細胞生存率（%）95.91±15.93 78.61±12.70* 75.87±10.81* 3.836 0.015細胞凋亡率（% 0.04±0.02 1.98±1.58* 4.41±2.03* 4.526 0.008

3 討論

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，侵襲轉(zhuǎn)移導致腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移是患者的主要死因。其中三陰性乳腺癌(triplenegativebreastcancer，TNBC）沒有內(nèi)分泌及靶向治療藥物，侵襲力強，預后差，目前無標準治療方案，需要尋找新的治療策略。

miRNA-126可以通過網(wǎng)絡式調(diào)控改變腫瘤微環(huán)境抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，其下調(diào)促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移，導致不良預后[12]。miRNA-126，miR-17，miR-21等多個miRNA在乳腺癌中的表達及作用已經(jīng)得到確定，對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有診斷和治療意義[13]。miR-126是對乳腺癌的診斷及治療有重要意義的新靶點，但目前尚無針對miR-126的靶向藥應用于臨床。

黃芩苷的體內(nèi)外試驗顯示有抗乳腺癌作用，但具體機制有待進一步研究。本實驗選擇高侵襲力的人三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，從miRNA-126途徑探討黃芩苷對乳腺癌細胞凋亡的影響。在前期體外實驗通過不同濃度黃芩苷作用于乳腺癌細胞MDA-MB-231，免疫組化分析篩選出藥物最低有效作用濃度50 μmol/L，運用miRNA芯片篩選受藥物調(diào)控的差異miRNA。在本實驗中用qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)miR-126在乳腺癌MDA-MB-231細胞中的表達比正常乳腺細胞的低，黃芩苷干預乳腺癌細胞后miR-126明顯上調(diào)。用miR-126 mimics轉(zhuǎn)染乳腺癌 細 胞 ，Western-blot顯 示 黃 芩 苷 及 miR-126 mimics作用于人乳腺癌細胞后引起凋亡相關的基因表達發(fā)生改變：抑制凋亡的Bcl-2表達水平下降；激活p38途徑，進而激活Caspase-9，Caspase-9和Caspase-3的裂解產(chǎn)物表達水平上升；抑癌基因p53表達水平明顯提高。MTT法顯示 miR-126 mimics和黃芩苷均可抑制乳腺癌細胞的生長。流式細胞術(shù)檢測提示黃芩苷與miR-126 mimics作用于乳腺癌細胞后，均可促進細胞凋亡，miR-126 mimics的作用更明顯。

本研究提示miR-126可能作為抑癌miRNA參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，黃芩苷可能通過上調(diào)miR-126誘導了促細胞凋亡相關蛋白的表達，并抑制抗凋亡相關蛋白的表達，促進癌細胞凋亡，闡釋和豐富了黃芩苷的功效內(nèi)涵，為黃芩苷治療乳腺癌提供實驗依據(jù)和科學參考，為中醫(yī)藥防治乳腺癌提供新靶點、新方法、新思路。但是microRNA與細胞凋亡的信號通路非常復雜，具體機制還有待進一步的體內(nèi)、外試驗進行深入探討。

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（本文編輯 楊 瑛）

Mechanism of Baicalin on the Apoptosis of Breast Cancer Cells by Up-Regulating miR-126

XIAO Yujie1,WANG Ting2,HUANG Lizhong1*,YANG Shan1,ZHUO Sichun1
(1.College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Central Hospital of Zhuzhou,Zhuzhou,Hunan 412007,China）

Objective To observe the effect and mechanisim of baicalin on proliferation and apoptosis of breast cancer cell line MDA-MB-231.Methods The expression of miR-126 was detected by qRT-PCR,and the expression of Bcl-2,Caspase-9,Caspase-3,p-p38,p53 was deternined by Western-blot.The cell proliferation was determined by using MTT method and cell apoptosis was detected by flow cytometry.Results The expression of miR-126 in breast cancer MDA-MB-231 cells was lower than that in normal breast cells,and the most obvious increase in miR-126 regulation was the intervention of baicalin in breast cancer cells.MiR-126 mimics,miR-126 inhibitors were transfected into human breast cancer cell.The Western-blot showed that baicalin and the miR-126 mimics increased Bcl-2 expression,reduced Caspase-9 and Caspase-3, p-p38,p53 expressions in human breast cancer cells (P<0.05).The result of MTT method showed that baicalin and miR-126 mimics could inhibit the proliferation of breast cancer cells,flow cytometry showed that baicalin and miR-126 mimics could promote the apoptosis of cancer cells.Conclusion The baicalin could inhibit the proliferation of breast cancer cells,and promote the apoptosis of breast cancer cells.The mechanism may be associated with the regulation of apoptosis related genes by up-regulating miR-126.

breast cancer;baicalin;miR-126;apoptosis

R285.5;R737.9

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.005

2016-11-29

湖南省自然科學基金（2015JJ6080）；湖南省教育廳重點項目（15A139）；湖南中醫(yī)藥大學青年教師科研基金課題（22）。

肖玉潔，女，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學研究。

*黃立中，男，教授，博士研究生導師，E-mail：hlz992002@163.com。

本文引用：肖玉潔，王 婷，黃立中，楊 珊，周思春.黃芩苷通過上調(diào)miR-126誘導乳腺癌細胞凋亡的機制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017,37(5): 481-484.