彭 俊，歐陽(yáng)云，2*，譚涵宇，李文娟，吳權(quán)龍，彭清華*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224001）

密蒙花滴眼液對(duì)去勢(shì)雄兔干眼癥淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響

彭 俊1，歐陽(yáng)云1，2*，譚涵宇1，李文娟1，吳權(quán)龍1，彭清華1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224001）

目的 觀察不同濃度密蒙花滴眼液對(duì)去勢(shì)雄兔角結(jié)膜干燥癥淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響，并探討其療效。方法 將 42只雄兔隨機(jī)分為：空白組（A），模型組（B），密蒙花滴眼液低（C）、中（D）、高（E）濃度組，安慰劑組（F），睪酮組（G），每組6只。除A組外各組切除雙側(cè)睪丸及附睪。術(shù)后第3天開(kāi)始C-F組給予滴眼液，3次/d；G組注射丙酸睪酮，每3天1次。各組術(shù)前和術(shù)后第4周各測(cè)量一次SIT和BUT。4周后處死兔子，摘取雙眼淚腺，采用免疫組化法檢測(cè)淚腺中TNF-α和IL-1β，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 （1）SIT與BUT：B、F組前后比較，B組與其他各組及C組與D、E、G組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（2）治療后各組TNF-α、IL-1β比較：B、F組與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；C組與D、E、G組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）TNF-α、IL-1β表達(dá)結(jié)果：A、G組未見(jiàn)表達(dá)；B、F組大量表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒；C、D、E組散見(jiàn)表達(dá)。結(jié)論 密蒙花滴眼液具有與雄激素相似的抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)的作用，但弱于雄激素。密蒙花滴眼液中、高濃度作用無(wú)明顯差異，但均較低濃度要優(yōu)。

干眼癥;密蒙花滴眼液；去勢(shì)雄兔；淚腺細(xì)胞；炎癥因子

干眼 （dry eye）又稱角結(jié)膜干燥癥（keratocon junctivitis sicca），是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量異常，或動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和（或）眼表組織病變特征的多種疾病的總稱[1]。干眼為常見(jiàn)眼表病，多為雙眼發(fā)病，流行病學(xué)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率遠(yuǎn)較人們想象的要高。我們?cè)谇捌诘呐R床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)密蒙花對(duì)干眼癥具有良好的治療效果[2-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將密蒙花生藥制備成密蒙花滴眼液，用于干預(yù)去勢(shì)雄兔所致雄激素減少性干眼癥動(dòng)物模型，探討密蒙花滴眼液對(duì)雄激素減少所致干眼癥淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用42只健康成年新西蘭長(zhǎng)耳白兔，雄性，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 YZ5H型裂隙燈顯微鏡、YZ11D型直接檢眼鏡均為蘇州六六視覺(jué)科技股份有限公司產(chǎn)品；Leica RM2125RTS型石蠟切片機(jī) （德國(guó)Leica公司）、B1 Digital數(shù)碼顯微鏡 （德國(guó)Motic公司）、Image Pro Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng) （美國(guó)Media Cybernetics公司）等，以上實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)器材均由由湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和眼科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 藥品 丙酸睪酮注射液：天津金耀藥業(yè)有限公司（規(guī)格：1 mL：25 mg）；注射用青霉素鈉：廣州白云山天心制藥股份有限公司；氯化鈉注射液：江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司（規(guī)格：500 mL：4.5 g）；水合氯醛分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；滅菌注射用水：上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司；Schirmer試驗(yàn)濾紙、熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙：天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。密蒙花滴眼液及安慰劑滴眼液均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥物制劑教研室制備。密蒙花滴眼液規(guī)格：低濃度為0.17 g/mL；中濃度為0.33 g/mL；高濃度為0.67 g/mL。安慰劑滴眼液為配制成與密蒙花滴眼液相同顏色及pH值的注射用水。

1.1.4 試劑 Harris蘇木素，伊紅，3%過(guò)氧乙酸，羊抗兔TNF-α抗體（規(guī)格：200 μg/mL）均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗大鼠IL-1β抗體（規(guī)格：200 μg/mL）；過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶白卵素(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒，3，3-二氨基聯(lián)苯胺 （3，3-diaminobenzi dine，DAB）顯色劑均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 按照隨機(jī)排列表法分成7組，每組6只兔子。分別為：空白組（A）、模型組（B）、低濃度密蒙花滴眼液組（C簡(jiǎn)稱低劑量組）、中濃度密蒙花滴眼液組（D簡(jiǎn)稱中劑量組）、高濃度密蒙花滴眼液組（E簡(jiǎn)稱高劑量組）、安慰劑滴眼液組（F）、睪酮組（G）。

1.2.2 干眼癥動(dòng)物模型的建立 除正常對(duì)照組外，其余所有兔子均參照相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]的方法行雙側(cè)睪丸及附睪切除術(shù)。術(shù)后測(cè)量模型兔Schirmer I試驗(yàn)（SIT）和淚膜破裂時(shí)間（BUT），當(dāng) SIT＜10 mm，BUT＜12 s則造模成功。

1.2.3 術(shù)后給藥 除A、B組外，C-F組在術(shù)后第3天開(kāi)始予相應(yīng)滴眼液1滴滴雙眼，3次/d；G組丙酸睪酮注射液按2 mg/kg行大腿肌肉注射，每3天注射1次。

1.2.4 SIT和BUT測(cè)定 各組兔子均于造模前1天和術(shù)后第4周行SIT和BUT測(cè)定[11]。SIT試驗(yàn)：按照說(shuō)明書(shū)用法，將濾條按標(biāo)記線折疊后一端置于下瞼內(nèi)眥1/3處結(jié)膜囊內(nèi)，另一端垂掛在下瞼外部，輕閉雙眼，5 min后取出濾紙，2 min后觀察并記錄濾紙濕長(zhǎng)。BUT測(cè)定：將熒光素鈉試紙輕置于下瞼結(jié)膜囊內(nèi)3 s后取出，將裂隙燈顯微鏡調(diào)至鈷藍(lán)光觀察淚膜破裂時(shí)間并記錄。

1.2.5 標(biāo)本采集及炎癥因子表達(dá)觀察 所有兔子在術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)4周后，采用空氣栓塞法處死，摘取雙眼淚腺，將標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行石蠟包埋及切片。

淚腺組織進(jìn)行免疫組化染色，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β染色后情況，拍照并精確選取視野內(nèi)所有陽(yáng)性顆粒，采用Image-pro Plus 6.0分析軟件計(jì)算出平均光密度值，用于定量表達(dá)免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組兔子去勢(shì)手術(shù)前與治療后SIT值及BUT值比較

模型組和安慰劑組自身前后比較及與空白組比較，SIT與BUT值均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，密蒙花各濃度組和睪酮組SIT與BUT值無(wú)明顯降低（P＜0.01）；與密蒙花低濃度組比較，中、高濃度組和睪酮組SIT與BUT值無(wú)明顯降低（P＜0.01）；與安慰劑組比較，睪酮組SIT與BUT值無(wú)明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組雄兔去勢(shì)前與治療后SIT及BUT比較 (±s，n=12)

表1 各組雄兔去勢(shì)前與治療后SIT及BUT比較 (±s，n=12)

注：各組自身前后比較，**P＜0.01；治療后與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01；與低劑量組比較，●●P＜0.01；與安慰劑組比較，◆◆P＜0.01。

組別SIT（mm） BUT（s）術(shù)前 術(shù)后 術(shù)前 術(shù)后空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組安慰劑組睪酮組14.75±2.26 14.83±2.04 14.92±2.07 14.75±1.66 14.58±1.51 14.67±1.92 14.83±1.59 14.50±1.45 7.75±1.54**▲▲12.82±1.19★★14.17±1.11★★●●14.17±1.19★★●●7.50±1.62**▲▲●●14.33±1.15★★●●◆◆14.33±2.42 14.42±1.38 14.42±1.51 14.67±1.61 14.25±2.42 14.25±2.42 14.75±2.22 14.08±1.88 6.75±1.66**▲▲12.92±1.08★★14.08±1.24★★●●6.83±1.70★★●●6.83±1.70**▲▲●●14.50±1.24★★●●◆◆

2.2 治療各組雄兔淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的表達(dá)比較

與空白組比較，模型組和安慰劑組的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，密蒙花各濃度組和睪酮組的表達(dá)無(wú)明顯增加（P＜0.01）；與密蒙花低濃度組比較，中、高濃度組和睪酮組的表達(dá)無(wú)明顯增加（P＜0.05），但安慰劑組明顯增加（P＜0.01）；與安慰劑組比較，睪酮組的表達(dá)無(wú)明顯增加（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 術(shù)后各組雄兔淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1β平均光密度值 (±s，n=12)

表2 術(shù)后各組雄兔淚腺細(xì)胞中TNF-α、IL-1β平均光密度值 (±s，n=12)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與低劑量組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與安慰劑組比較，●●P＜0.01。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組安慰劑組睪酮組TNF-α 0.18±0.10 0.68±0.14** 0.35±0.14▲▲0.24±0.09▲▲★0.24±0.11▲▲★0.65±0.13**★★0.23±0.14▲▲★●●IL-1β 0.24±0.12 0.59±0.17** 0.41±0.16▲▲0.30±0.08▲▲★0.24±0.13▲▲★0.57±0.28**★★0.17±0.11▲▲★●●

2.3 各組TNF-α、IL-1β的表達(dá)觀察結(jié)果

A、G組：淚腺結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)TNF-α、IL-1β表達(dá)；B、F組：淚腺結(jié)構(gòu)模糊，TNF-α、IL-1β大量表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒；C、D、E組：淚腺結(jié)構(gòu)清晰，散見(jiàn)TNF-α、IL-1β表達(dá)。見(jiàn)圖1-2。

圖1 術(shù)后各組TNF-α免疫組化染色光鏡圖（×200倍）

圖2 術(shù)后各組IL-1β免疫組化染色光鏡圖（×200倍）

3 討論

2007年國(guó)際干眼病專題研究會(huì)賦予干眼病的最新定義是：淚液和眼球表面的多因素疾病，能引起患眼不適、視覺(jué)障礙和淚膜不穩(wěn)定，損害眼球表面。該病伴有淚膜滲透性增加和眼表炎癥[12]。與傳統(tǒng)的干眼病定義相比，該定義強(qiáng)調(diào)了炎癥在干眼病發(fā)病中的重要作用。盡管引起干眼癥的起始病因不同，但一旦進(jìn)入進(jìn)展階段，炎癥成為干眼癥發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵的因素。干眼癥患者淚液和結(jié)膜上皮中的多種細(xì)胞因子包括IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[13]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，性激素尤其是雄激素對(duì)淚液分泌有著重要的作用。雄激素通過(guò)刺激TGF-β的合成，降低淚腺中IL-1β、TNF-α的水平來(lái)發(fā)揮其免疫抑制的作用，有效地保護(hù)淚腺免于炎癥和變性，加速新陳代謝，調(diào)控淚腺和瞼板腺的形態(tài)及分泌功能。

干眼屬中醫(yī)學(xué)“白澀癥”范疇，又名“干澀昏花癥”及“神水將枯癥”“神氣枯瘁”。一般認(rèn)為干眼因肝腎虧損，陰血不足，目失濡養(yǎng)所致。密蒙花味甘，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱瀉火養(yǎng)肝、明目退翳之功效，主治目赤翳障、目昏干澀、肝虛目暗、視物昏花等癥[14-15]。現(xiàn)代研究認(rèn)為密蒙花中的活性成分為黃酮類物質(zhì)[16]，并且某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用[17]，可以用于治療因性激素水平下降所致的某些疾病，如骨質(zhì)丟失等[18]。

我們對(duì)密蒙花的前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，密蒙花提取物中主要成分為黃酮類，可起到擬雄激素效應(yīng)，可顯著抑制雄激素水平降低后大鼠干眼癥的發(fā)生，抑制淚腺細(xì)胞凋亡，維持淚腺基礎(chǔ)分泌量和淚腺的穩(wěn)定性[2-8]。

目前干眼癥的治療以藥物為主，臨床常用的藥物為人工淚液，該類藥物主要是緩解患者眼部的不適，無(wú)法從根本上改變干眼癥的病理狀態(tài)。本研究證實(shí)密蒙花滴眼液具有類激素效應(yīng)，能抑制雄激素缺乏所致兔淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)，維持淚腺基礎(chǔ)分泌量和淚腺的穩(wěn)定性，但其作用弱于雄激素。中、高濃度密蒙花滴眼液對(duì)TNF-α和IL-1β的抑制作用要強(qiáng)于低濃度密蒙花滴眼液，但中、高濃度密蒙花滴眼液的抑制作用差別不明顯。本研究既為干眼病的治療提供一種新的天然藥物，又可以避免長(zhǎng)期使用雄激素所帶來(lái)的副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Butterflybush Flower Eye Drops on Inflammatory Factors TNF-α and IL-1β in Lacrimal Gland Cells of Castrated Male Rabbits with Xerophthalmia

PENG Jun1,OUYANG Yun1,2*,TAN Hanyu1,LI Wenjuan1,WU Quanlong1,PENG Qinghua1*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Yancheng Traditional Chinese Medicine Hospital,Yancheng,Jiangsu 224001,China）

Objective To observe the effects of butterflybush flower eye drops at different concentrations on inflammatory factors TNF-α and IL-1β in lacrimal gland cells of castrated male rabbits with xerophthalmia.Methods The 42 male rabbits were randomly divided into blank group (A),model group (B),low concentrations butterflybush flower eye drops group (C),medium concentrations butterflybush flower eye drops (D),high concentrations butterflybush flower eye drops(E), placebo group (F)and testosterone group (G),six rabbits in each group.All rabbits of group B to G were cut off bilateral testis and epididymis.The rabbits of group C to F were dropped relevant Eye Drops there times a day.The rabbits of group G were injected testosterone propionate injection every 3 days.The SIT and BUT were determined at 4 weeks before and after operation,respectively.After 4 weeks,the lacrimal gland of all rabbits were killed and clipped.The TNF-α and IL-1β in lacrimalgland cellsweretested byimmunohistochemicalstaining method.Results (1)TheSIT and BUT weresignificantly different between group B and F before and after operation (P＜0.01).Compared with other groups,SIT and BUT was significantly different in group B before and after operation (P＜0.01).Compared with group D,E,G,there was significant difference in group C before and after operation (P＜0.01). (2)Comparison of TNF-α and IL-1β after treatment: there was significant difference between group B and F with other groups (P＜0.01).Compared with group D,E,G,the indicators in group C was significantly different(P＜0.05).(3)The expression of TNF-α and IL-1β were not found in group A and G.In group B and F:TNF-α and IL-1β wereexpressed in cellmembraneand cytoplasm heavyly,showing brownish granules with yellow.In group C,D and E,TNF-α and IL-1β were poorly expressed.Conclusion Butterflybush flower eye drops show a similar effect with androgen on depressing the expression of inflammatory factors TNF-α and IL-1β, but its effect is slightly weaker than the androgen.The depressing effect of medium and high concentration buddleia eye drops is better than the low concentration,while there was no significant difference between medium and high concentration.

xerophthalmia;butterflybush flower eye drops;castrated male rabbit;lacrimal gland cell;inflammatory factors

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.002

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（30772824，81574031）；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項(xiàng)目資助；湖南省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（2015SF2016-6）；湖南省發(fā)展改革委科研基金資助項(xiàng)目（湘發(fā)改投資[2014]658號(hào)）；長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重大專項(xiàng)（K1501014-31）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)眼科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目。

彭 俊，男，在讀碩士研究生，研究方向：眼表疾病、青光眼及眼底病的中醫(yī)藥研究。

*彭清華，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：pqh410007@126.com；歐陽(yáng)云，男，博士，主治醫(yī)師，E-mail：oyy123@126.com。

本文引用：彭 俊，歐陽(yáng)云，譚涵宇，李文娟，吳權(quán)龍，彭清華.密蒙花滴眼液對(duì)去勢(shì)雄兔干眼癥淚腺細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37(5):469-472.