趙占娟 李世杰 徐澤華 商亞貞 劉天軍

1(河北大學基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000)2(河北大學公共衛(wèi)生學院，河北 保定 071000)3(河北大學附屬醫(yī)院，河北 保定 071000) 4(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

光動力治療大鼠大面積創(chuàng)傷感染的實驗研究

趙占娟1李世杰1徐澤華2商亞貞3劉天軍4*

1(河北大學基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000)2(河北大學公共衛(wèi)生學院，河北 保定 071000)3(河北大學附屬醫(yī)院，河北 保定 071000)4(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

探討新型卟啉類光敏劑PA1介導的光動力抗菌療法治療大鼠大面積創(chuàng)傷感染的效果。體外培養(yǎng)創(chuàng)面易感染的3種菌株，有抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)、大腸桿菌(E.coli)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，探討3種細菌對PA1的吸收量、光照PA1的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度; 取清潔級雄性Wistar大白鼠40只，建立皮膚大面積創(chuàng)傷感染模型，創(chuàng)面滴加光敏劑PA1，用650 nm激光照射治療，檢測各實驗組的創(chuàng)面愈合率、不同時相點創(chuàng)面下的菌落數(shù)。結果表明，上述3種細菌對PA1的最大吸收量都發(fā)生于前30 min，以后趨于平穩(wěn)。光照PA1對3種細菌均有滅活作用，對MRSA和E.coli的最低殺菌濃度為31 μM，對P.aeruginosa的最低殺菌濃度為62.5 μM。體內實驗結果顯示，治療組的各項指標優(yōu)于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，高劑量治療組的各項指標優(yōu)于中、低量治療組(P<0.01)，為臨床治療大面積創(chuàng)傷感染積累一定的實驗經(jīng)驗。

光動力抗菌療法；創(chuàng)傷感染；光敏劑；卟啉衍生物

引言

各類皮膚破損性疾病是臨床多發(fā)病之一。體表皮膚受損為微生物侵入提供了途徑，而傷后內環(huán)境紊亂、免疫機能下降都增加了機體對感染的易感性。由于環(huán)境及治療因素的影響，使環(huán)境中菌群隨之而變遷。菌群多以金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌和大腸桿菌為代表[1]。由于抗生素的廣泛及不合理應用，使得細菌的耐藥性日益凸顯，而廣譜抗生素的濫用更是加快了細菌的耐藥性轉變，嚴重威脅到了人類健康。因此，尋求高效、低毒、廣譜的抗微生物藥物已經(jīng)迫在眉睫。

光動力抗菌療法(photodynamic antimicrobial therapy PACT)是基于光、光敏劑和氧3種因素協(xié)同作用的氧化損傷機制，單一用藥很難使病原菌產(chǎn)生耐藥性，從而倍受各國科學家的關注[2]。

PACT在治療由耐藥菌引起的大面積燒傷感染、皮膚病、慢性創(chuàng)面感染以及肺結核的實驗研究中表現(xiàn)出毒性小、殺菌范圍廣等優(yōu)點[3]，與抗生素相比，它還具有極少誘導產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點[4]，目前仍處于臨床前研究階段。

本實驗室在卟啉周邊引入多氨基極性基團，合成了一系列新型水溶性的光敏劑，前期的研究篩選出了一種具有良好理化性質的新型水溶性光敏劑PA1，有著良好的光動力抗菌活性作用。本研究將PA1應用于治療大鼠大面積創(chuàng)傷感染實驗，探討將其用于臨床光動力抗菌治療的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 化合物PA1

PA1為本實驗室自行合成(見圖1)，紫紅色粉末，體外實驗用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制為10-2mol/L，使用時用滅菌的液體LB培養(yǎng)基稀釋到10-4mol/L以下使用。動物實驗時用滅菌的PBS(pH=7.4)稀釋到10-4mol/L以下使用。

圖1 化合物PA1的結構Fig.1 Chemical structural formula of PA1

1.1.2 主要儀器與試劑

半導體激光器(7404,Intense,USA，650 nm光纖輸出)，多功能酶標儀(Thermo3001，美國)，胰蛋白陳 (Oxoid，英國)，酵母提取物(Oxoid，英國)，氯化鈉(天津科威公司)，瓊脂(Oxoid，英國)，PBS緩沖液(Thermo，美國)，十二烷基硫酸鈉SDS(天津市江天化工技術有限公司)。

1.1.3 實驗菌株

標準質控菌株大腸埃希菌(Escherichia,E.coli)(ATCC 25922),抗藥性金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA) (臨床分離菌株),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)(ATCC 27853),由解放軍307醫(yī)院惠贈。

1.2 方法

1.2.1 不同能量密度的激光對MRSA的PACT作用

取處于對數(shù)生長期的菌液1 mL，離心，用PBS溶液洗滌，重懸至OD600=0.6；取上述菌液加入96孔培養(yǎng)板內，每孔200 μL；利用650 nm的激光照射，照射強度分別為2、4、6、8、10和12 J/cm2；采用涂布法，對樣品進行梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6等4個稀釋度迅速涂板，24 h后菌落計數(shù)，實驗重復3次。

1.2.2 吸收速度的測定[5]

1.2.2.1 標準曲線的配制

1)用0.1M-1%SDS分別配制PA1溶液濃度，分別為0.4、0.8、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 μM。吸取100 μL加入96孔培養(yǎng)板，每個濃度4個復孔。

2)測每孔的熒光吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.2.2 革蘭氏陰性菌及陽性菌對PA1吸收速度的測定

1)取處于對數(shù)生長期的細菌1 mL進行離心(9 000 g,1 min), 用PBS重懸到相應光密度OD600=0.6～0.8。

2)取8個離心管，加入上述菌懸液500 μL，再加入500 μL濃度為25 μM的PA1溶液混勻。

3)將上述離心管分別暗孵育0、10、20、30、40、80、160、320 min，然后離心(9 000 g,1 min)，用PBS洗，去上清，留取菌團備用。

4)在上述菌團中加入1 mL 0.1M-1% SDS，溶解細菌24 h。

5)用移液槍吸取100 μL裂解菌液，放入無菌96孔板中，每個濃度4個復孔。

6)上機檢測每孔的藥物熒光強度值(激發(fā)波長418 nm，發(fā)射波長658 nm)，根據(jù)標準曲線將測得的熒光強度值轉變?yōu)槊靠椎乃幬锖?，藥物含量用吸收量uptake (molecules/cells)表示，實驗重復3次。

1.2.3 試驗方法

采取光照PA1對革蘭氏陰性菌及陽性菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)、最小殺菌濃度(minimal bacteriacidal concentration, MBC)的試驗方法[6]。

1.2.3.1 MIC的測定

1)稱取一定量的藥物，用二甲基亞砜DMSO配制溶液，濃度為10-2mol/L。

2)藥液的配制：用移液槍吸取原液，用液體培養(yǎng)基稀釋到1000 μM, 然后用二倍稀釋法將藥物依次稀釋為500、250、125、63、32、16、8、4、2、10 μM濃度。

3)菌液的制備：取對數(shù)生長期的菌液用無菌肉湯，校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1～2×108CFU/mL。

4)接種物制備：將上述校正好的0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經(jīng)LB肉湯1∶1 000稀釋后，每孔中加100 μL至無菌96孔聚苯乙烯板。

5)MIC板制備：無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到上述96孔聚苯乙烯板中，第1～11孔加藥液，每孔100 μL，第12孔不加藥作為生長對照。此時，第1～11孔藥物濃度分別為500、250、125、64、32、16、8、4、2、1、0 μM，每個濃度4個復孔重復實驗。

密封后在搖床上暗孵育30 min，取出行激光照射，激光能量密度為6 J/cm2，光照后于暗箱中培養(yǎng)孵育16～20 h判斷結果。單純光敏劑對照組不用激光照射，其他方法同上進行操作。

6)結果判斷：小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC，陽性對照孔(即不含藥物)內細菌明顯生長試驗才有意義。若結果出現(xiàn)單一的跳孔，記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度；如出現(xiàn)多處跳孔，則不報告結果，重復試驗。

1.2.3.2 MBC的測定

在MIC試驗基礎上，將所有清晰無菌生長的小孔內液體用涂布棒蘸取，分別涂布于相應的瓊脂平板培養(yǎng)基，放在36℃ 的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(24～48 h)，以瓊脂平板上菌落數(shù)不超過5個的最低藥物濃度作為該藥物對該菌株的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.4 受試動物

健康雄性(清潔級)Wistar大白鼠40只，體重210～230 g，均由北京華阜康實驗動物中心提供，動物合格證為SCXK(京)2009-0004。實驗前1周將大鼠置于實驗環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫20～25℃。受試動物實驗經(jīng)過中國醫(yī)學科學院倫理審查。

1.2.5 造模方法[7]

實驗當日大鼠禁食，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，將大鼠呈腹臥位固定在固定板上，背部剃毛并消毒；無菌條件下，在制傷部位用直徑15 mm的環(huán)鉆垂直于皮膚各壓出1個圓形痕跡(1.77 cm2)，沿壓痕用無菌彎手術剪剪去全層皮膚(剔除部分深筋膜)，制成圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，傷口止血備用。每只大鼠背部兩側各制備2個創(chuàng)面。充分止血后，在傷口表面覆蓋與創(chuàng)面大小相仿的圓形紗布，每塊紗布表面滴入50 μL新配制的MRSA(10億/mL)、E.coli(5億/mL)、P.aeruginosa(5億/mL)3種菌株混懸液，然后用紗布包扎固定。動物分籠飼養(yǎng)，給予充足的水和食物。創(chuàng)面感染模型成功，進行下一步實驗。

1.2.6 動物分組

造模后，將大鼠隨機分成模型對照組(生理鹽水組)、PACT高劑量治療組(6 MBC)、PACT中劑量治療組(3 MBC)、PACT低劑量治療組(1.5 MBC)，共4組，每組10只。

1.2.7 PACT治療方案

造模感染48 h后，在各組大鼠創(chuàng)面處敷上單層紗布，模型對照組每個創(chuàng)面只滴加50 μL的生理鹽水；PACT治療組的每只大鼠每個創(chuàng)面滴加50 μL(共200 μL)不同濃度的光敏劑，用波長為650 nm的激光(能量密度為60 J/cm2)局部照射每個創(chuàng)面表面10 min，其他部位避光。治療后移至暗室，避光飼養(yǎng)。由于創(chuàng)面還有殘存的光敏劑，第二天PACT治療組繼續(xù)照光1次，此為光動力抗菌治療1次。按照此種方法，進行光動力抗菌治療2次。

1.2.8 檢測指標

1)在體抑菌的影響。用無菌棉簽蘸取生理鹽水，由創(chuàng)面一側向另一側滾動，均勻涂抹全創(chuàng)面一次，并立即置入無菌試管里。檢測時，用生理鹽水倍比稀釋至10-6，然后每個稀釋梯度各取100 μL菌液涂布于普通肉湯瓊脂平板，每個梯度涂布兩個平板。37℃ 過夜培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并計數(shù)(colony forming units, CFU)。創(chuàng)面接種細菌24 h后，測定創(chuàng)面3種菌落總數(shù)量；其后從第3天起，每隔3 d測一次細菌CFU。

2)創(chuàng)面愈合率。建模后，每天觀察傷口愈合情況并拍照，于4、8、12、14 d用游標卡尺測量創(chuàng)面直徑，并計算創(chuàng)面面積，采用下列公式計算創(chuàng)面愈合率，有

創(chuàng)面愈合率(%)=

1.2.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 激光能量密度對MRSA的PACT影響[8]

使用不同能量密度的激光(650 nm)照射新型光敏劑PA1(6.25 μM)和MRSA的混懸液。由圖2(a)可以看出，隨著激光能量密度的增加，對細菌的滅活率也越大，但激光能量密度達到6 J/cm2后，PACT對細菌的滅活率也達到最大，增加能量密度，死亡率未見明顯變化，故本次試驗選取激光能量密度為6 J/cm2進行以下實驗。圖2(b)表示在沒有光敏劑的情況下單純激光光照對細菌的滅活率變化，可以看出隨著激光能量密度的增加，細菌的滅活率沒有明顯變化，故認為單純激光光照對MRSA 的菌株滅活沒有作用。

圖2 激光能量密度對抗藥性金黃色葡萄球菌存活率的影響。(a)不同能量密度的激光光動力抗菌作用; (b)單獨激光光照Fig.2 Effects of PA1-PACT. (a) MRSA strains as a factor of laser energy dose illumination at (650 nm); (b) Light alone

2.2 革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌對光敏劑PA1吞噬速度的測定

光敏藥物能否進入細菌內部對其PACT療效是非常重要的，由圖3可以看出，3種細菌對PA1的吸收隨著時間的延長而發(fā)生變化，且最大吸收都發(fā)生在前30 min內，以后趨于平穩(wěn)。鑒于30 min 細菌的吸收能達到最大，故本次體內、體外試驗選擇暗孵育的時間均為30 min。

圖3 抗藥性金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌對PA1吞噬量的測定Fig.3 Compound PA1 taken up by MRSA, E. coli and P. aeruginosa, as a factor of incubation time

2.3 激光光照光敏劑PA1對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的MIC和MBC的比較

表1顯示了光敏劑PA1對3種代表菌株光反應、暗反應的MIC和MBC。從實驗結果可見，光照PA1對3種細菌均有殺菌作用，對3種菌的MIC都為16 μM。而PA1對3種菌的MBC略有不同，對MRSA、E.coli的MBC(31μM)要低于對P.aeruginosa的MBC(62.5 μM)。

表1 光照光敏劑PA1對3種菌株的MIC和MBC

Tab.1 Minimal inhibitory concentration(MIC, μM) and minimal bactericidal concentration (MBC,μM) of the compound PA1 against MRSA,P.seuginosa,E.coli

激光能量/(J/cm2)MRSAP.aeruginosaE.coliMICMBCMICMBCMICMBC616311662.516310500>500>500>500500>500

2.4 光動力抗菌療法治療大鼠創(chuàng)傷感染試驗研究

2.4.1 創(chuàng)面愈合率比較

由表2可見，治療4d后，PACT高、中、低治療組愈合率均大于模型對照組(P<0.05)，PACT高劑量治療組的創(chuàng)面愈合率高于中、低劑量組的創(chuàng)面愈合率，差異無顯著性(P>0.05)。治療12d后，PACT治療組高、中、低劑量組愈合率具有顯著性差異(P<0.05)。治療14d后，PACT高劑量治療組已經(jīng)愈合(97.8±1.5)，愈合率優(yōu)于其他各組(P<0.01)，模型對照組的創(chuàng)面依然較大，愈合率很低(86.3±7.0)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各實驗組治療過程中不同時間點傷口愈合率(%)比較

Tab.2 Percentage of healing area (%) in the wound 4,8,12 and 14 days after treatment with the 4 different groups (n=10, mean±SD)

組別時間/d481214對照組17.5±8.835.0±8.867.5±9.086.3±7.0 高劑量28.4±7.7*50.2±10.4*90.8±3.6*97.8±1.5*中劑量23.8±9.6*47.9±12.0*87.9±5.9*95.3±3.0*低劑量22.7±8.6*47.0±13.1*84.2±7.7*90.6±4.0*△▲

注：*表示與對照組比較，P<0.05;△表示與高劑量組比較，P<0.05;▲表示與中劑量組比較，P<0.05。

Note:*Compared with the control group，P<0.05;△Compared with the high-dose group，P<0.05;▲Compared with middle-does group，P<0.05.

2.4.2 不同時間創(chuàng)面下菌落計數(shù)的比較

表3的實驗結果表明，在各個時間點，PACT治療組的痂下菌落數(shù)與模型對照組相比均降低；高劑量組對3種菌的抑制率高于中、低劑量組的抑制率，在后7～14 d具有顯著性差異(P<0.01)。

表3 各實驗組治療過程中不同時間點菌落數(shù)的比較

Tab.3 CFU in the wound after treatment 1,4,7,10 and 14 days with the 4 different groups (n=10, mean±SD)

組別時間/d01471014對照組3.2±1.93.2±1.63.2±1.62.9±3.0 2.8±1.52.3±1.1高劑量3.2±1.82.9±1.6*2.8±1.7*2.5±1.4*1.7±0.6*0.0±0.0*中劑量3.2±1.83.0±2.82.9±1.6*2.6±1.5*2.2±0.9*△1.6±0.5*△低劑量3.2±1.83.1±1.8△3.1±1.8△2.8±1.2*△▲2.5±1.41.9±0.6*△▲

注：*表示與對照組比較，P<0.05；△表示與高劑量組比較，P<0.05；▲表示與中劑量組比較，P<0.05。

Note:*Compared with the control group，P<0.05;△Compared with the high-dose group，P<0.05;▲Compared with middle-does group，P<0.05.

3 討論和結論

光動力抗菌療法PACT有三要素，即激光、光敏劑和氧，光敏劑的優(yōu)劣是目前PACT療效的關鍵因素。光敏劑是一類具有光活性的化合物，光照光敏劑具有很強的抗菌性能，它可以選擇性地富集在特定的組織上，在可見光或紫外光的激發(fā)下，在已確定的靶細胞上釋放光活化產(chǎn)物來達到殺死靶細胞的目的，從而起到殺菌的功效[9]。第一代光敏劑都是混合物且組成成分不確定，光動力治療效率差、毒副作用多等，因而開發(fā)新型的光敏劑是發(fā)展PACT治療的關鍵。本研究以四苯基卟啉為母核，引入了多氨基極性基團，獲得了一種結構單一、水溶性較好、單線態(tài)氧產(chǎn)率較高的化合物PA1。體外實驗結果表明，PA1對3種細菌均表現(xiàn)出較好的滅活效果，且無光照時化合物自身的MBC也較低(MBC>500 μM)，表明PA1是一種良好的體外抗菌光敏劑。體內實驗利用PA1-PACT治療了由耐藥菌引起的大鼠大面積創(chuàng)傷感染，結果顯示PACT治療組的各項指標都優(yōu)于模型對照組的各項指標(P<0.05或P<0.01)，高劑量PACT治療組的各項指標優(yōu)于中、低量PACT治療組的各項指標(P<0.01)，提示PACT有殺滅細菌、促進創(chuàng)面愈合的作用。

目前，PACT滅菌的機制尚不完全清楚。有研究認為，光敏劑受到激發(fā)會產(chǎn)生多種活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，損傷細菌質膜，滅活膜上的轉運系統(tǒng)和酶[10]，導致細菌DNA損傷[11]，達到治療的目的。今后，應進一步進行相關機制的實驗探討。

綜上所述，新型水溶性光敏劑PA1具有良好的光動力抗菌效果，體內(外)實驗均取得較好的療效，表明了PACT治療大面積創(chuàng)傷感染的可行性，這點與國外的一些PACT體內抗感染的實驗研究結果相符[12-13]。相信在將來，隨著新型光敏劑的出現(xiàn)及實驗條件的改善，PACT將成為臨床治療難治性細菌感染性疾病的一種新療法。

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Experimental Study on Photodynamic Therapy of Massive Trauma Rats

Zhao Zhanjuan1Li Shijie1Xu Zehua2Shang Yazhen3Liu Tianjun4*

1(BasicMedicalCollege,HebeiUniversity，Hebei，Baoding071000，China)2(SchoolofPublicHealth,HebeiUniversity，Hebei，Baoding071000，China)3(AffiliatedHospitalofHebeiUniversity，Hebei，Baoding071000，China)4(InstituteofBiomedicalEngineering,ChineseAcademyofMedicalSciences，Tianjin300192,China)

photodynamic antimicrobial therapy; wound infection; photosensitizer; porphyrin derivative

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 02.017

2016-05-13， 錄用日期:2016-12-07

天津市重大科技支撐項目(12ZCDZSY11900)；河北大學醫(yī)學學科建設項目(2015A2001)；河北大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(2015149)

O43；Q631；R641

D

0258-8021(2017) 02-0243-05

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: TianJunLiu@hotmail.com