余 蘭 汪海波 陳 卓 方 成*

1(武漢輕工大學(xué)移植工程實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)2(武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，武漢 430023)

草魚魚皮膠原蛋白與NIH3T3成纖維細(xì)胞的相容性

余 蘭1汪海波2陳 卓1方 成1*

1(武漢輕工大學(xué)移植工程實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)2(武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，武漢 430023)

體外檢測(cè)草魚魚皮酸溶性膠原蛋白(FASC)的細(xì)胞相容性。采用MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度的FASC溶液或FASC涂層膠對(duì)NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖能力的影響(n=6)；利用transwell趨化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度的FASC溶液對(duì)成纖維細(xì)胞的趨化作用(n=3)；利用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度FASC涂層膠的細(xì)胞通透性(n=3)。結(jié)果表明，F(xiàn)ASC溶液濃度依賴性地促進(jìn)NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖，16 μg/mL的FASC溶液在48和96 h的增殖率分別為63.7%±7.9%和87.3%±8.7%，較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.001)。NIH3T3細(xì)胞能夠在FASC涂層膠上生長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，增殖率均無顯著性差異(P> 0.05)。趨化實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ASC溶液各濃度梯度組與陰性對(duì)照組的趨化指數(shù)均有顯著性差異(P< 0.05)，提示FASC對(duì)成纖維細(xì)胞具有趨化作用。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞可以通過FASC涂層膠。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)ASC與NIH3T3細(xì)胞具有良好的相容性。

膠原蛋白；魚皮；草魚；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞相容性

引言

理想的生物創(chuàng)傷材料應(yīng)能為細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)提供合適的空間結(jié)構(gòu)、力學(xué)支持，并可以模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境[1]。哺乳動(dòng)物膠原蛋白作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，為細(xì)胞的黏附、遷移和增殖提供了必要的生物環(huán)境[2-4]。海綿狀Ⅰ型膠原蛋白材料與細(xì)胞外基質(zhì)具有極為相似的三維空間結(jié)構(gòu)，用于大范圍組織缺損修復(fù)的再生基質(zhì)[5-6]。人工生物材料具有增強(qiáng)誘導(dǎo)及減少重構(gòu)的作用，但更重要的作用是利于細(xì)胞增殖和分布，這要求材料具備生物相容的綜合性能[7]。在前期研究中已經(jīng)初步確定，魚皮膠原蛋白在動(dòng)物體內(nèi)具有良好的組織相容性[8]。本研究將草魚魚皮膠原蛋白與NIH3T3成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)，用以驗(yàn)證其細(xì)胞相容性。

1 材料和方法

1.1 材料

草魚魚皮酸溶性膠原蛋白(fishskin acid-soluble collagen, FASC)海綿，用草魚魚皮經(jīng)乙酸提取法經(jīng)冷凍干燥制得[9]；NIH3T3成纖維細(xì)胞(武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心)；胎牛血清(杭州四季青)；雙抗、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、IL-8趨化因子(美國Sigma)；結(jié)晶紫(武漢博士德)；Transwell趨化小室(美國康寧)；酶標(biāo)儀(美國伯樂)；倒置顯微鏡(重慶明光)。

1.2 FASC溶液與細(xì)胞共培養(yǎng)的MTT實(shí)驗(yàn)

用1%醋酸5 mL將5 mg FASC海綿溶解，然后在4℃、20倍體積的PBS液中透析24 h(透析袋的截留分子量為大于14 kD)，再將透析過的溶液配制成濃度為0.5 mg/mL的FASC母液。

當(dāng)NIH3T3細(xì)胞傳至第3代時(shí)，將單層NIH3T3細(xì)胞用胰酶消化，吸去消化液后，再用含10%胎牛血清的DMEM配制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液含F(xiàn)ASC的質(zhì)量終濃度分別為2、4、8、16 μg/mL，同時(shí)設(shè)陰性空白對(duì)照組(只加入細(xì)胞懸液)和本底調(diào)零孔(只加入DMEM溶液)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，各組均設(shè)置6個(gè)平行孔，每孔加入100 μL上述液體，水平輕搖使其混勻。放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)48和96 h后，每孔加入20 μL的MTT試劑，4 h后吸去MTT溶液，加入150 μL的DMSO，10 min后測(cè)定490 nm的OD值并計(jì)算增殖率[10]。細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-本底OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-本底OD值)-1] ×100%。

1.3 FASC涂層膠與細(xì)胞共培養(yǎng)的MTT實(shí)驗(yàn)

稱取70 mg FASC海綿粉碎后置于10 mL的10%醋酸溶液中，微波爐加熱15 min使其完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7，制備成含F(xiàn)ASC質(zhì)量濃度為7 mg/mL 的母液。再用母液配制質(zhì)量濃度為1、3、5、7 mg/mL的FASC溶液，分別加入96孔板中，各濃度均重復(fù)6孔，每孔加入50 μL，使FASC溶液鋪滿孔底，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。再把該裝置放入-20℃的冰箱里冷凍過夜，隨后放入-50℃的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，用75%的乙醇消毒后，在紫外光下風(fēng)干制成不同質(zhì)量濃度的FASC涂層膠，用于MTT實(shí)驗(yàn)。

在上述制備的FASC涂層膠的96孔板中，每孔加入100 μL密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，后續(xù)步驟與本文第1.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟一致，最后測(cè)定各組在490 nm的OD值。

1.4 Transwell趨化實(shí)驗(yàn)

當(dāng)NIH3T3成纖維細(xì)胞傳代至第三代時(shí)，用來做趨化實(shí)驗(yàn)。在趨化小室的上室加入200 μL無血清DMEM的細(xì)胞懸液(密度為2×105個(gè)/mL)，下室加入500 μL不同濃度的FASC-DMEM混合溶液，實(shí)驗(yàn)組FASC濃度為(2、4、8、16 μg/mL)。同時(shí)，設(shè)立陰性對(duì)照組(下室加入500 μL無血清培養(yǎng)基)和陽性對(duì)照組(下室加入500 μL含IL-8濃度為10 ng/mL的無血清培養(yǎng)基)，每組均設(shè)置3個(gè)平行孔。放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后取出趨化小室，吸去上室細(xì)胞懸液，用PBS洗3次，再加入0.25%胰酶消化2 min后，用無菌棉簽拭去Transwell聚碳酸酯膜上面的細(xì)胞。將聚碳酸酯膜下面浸入4%多聚甲醛固定20 min，用結(jié)晶紫染色3 min，在200倍倒置顯微鏡下，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)趨化到小室下室膜的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算趨化指數(shù)(chemotatic index, Ci)[11]。Ci=各觀察組下室細(xì)胞數(shù)/空白組下室細(xì)胞均數(shù)。

1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

按照本文第1.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，配制質(zhì)量濃度為1、2、3 mg/mL的FASC溶液，將配制好的FASC 溶液依次加入Transwell上室中，每孔加入FASC溶液100 μL，均勻平鋪于Transwell上室底，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，每組均設(shè)置3個(gè)平行孔。將趨化小室放入-20℃冰箱冷凍過夜，之后轉(zhuǎn)入-50℃的冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h，用75%的乙醇消毒后在紫外光下風(fēng)干，制成不同質(zhì)量濃度的FASC涂層膠用于侵襲實(shí)驗(yàn)。

做侵襲實(shí)驗(yàn)前，先將Transwell趨化小室的上下室各加入400 μL培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱里孵育過夜，再取出吸去培養(yǎng)基用無菌PBS洗2～3次，此步驟為水化FASC涂層膠。隨后，在上室加入200 μL無血清DMEM的細(xì)胞懸液(密度為2×105個(gè)/mL)，下室加入IL-8濃度為100 ng/mL的DMEM溶液500 μL，按照本文第1.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)、染色；200倍倒置顯微鏡下，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲到小室下室膜的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算侵襲指數(shù)(invasive index, Ii)。Ii=各觀察組下室細(xì)胞數(shù)/空白組下室細(xì)胞均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析使用 Prism (4. 00) 軟件，樣本均數(shù)及其隨機(jī)誤差用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)描述。多組樣本間比較使用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較使用t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析使用雙側(cè)比較，P<0.05則差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞在FASC溶液中的增殖情況

OD490值越高，表示活細(xì)胞數(shù)目越多。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組的吸光度呈濃度依賴性(P<0.05)，NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖率與FASC濃度呈正相關(guān)。16 μg/mL的FASC溶液在48和96 h的增殖率分別為(63.7 ± 7.9)%、(87.3 ± 8.7)%，較空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ASC溶液有促成纖維細(xì)胞增殖的作用。

圖1 NIH3T3細(xì)胞與FASC溶液共培養(yǎng)MTT實(shí)驗(yàn)的OD值和增殖率Fig.1 The OD values and the proliferation rates of MTT tests for co-culturing of NIH3T3 fibroblasts and FASC solutions

2.2 細(xì)胞在FASC涂層膠上的增殖情況

從圖2可以觀察到，NIH3T3成纖維細(xì)胞能夠在不同質(zhì)量濃度的FASC涂層膠上生長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值兩兩比較無顯著差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組兩兩比較OD值無顯著差異(P>0.05)，說明FASC涂層膠不干擾細(xì)胞增殖。這是因?yàn)镕ASC涂層膠是通過高溫?zé)嶙冃灾频玫?，已?jīng)失去膠原蛋白活性。它類似于侵襲實(shí)驗(yàn)中Transwell小室膜上可使用的Matrigel膠，在培養(yǎng)時(shí)間4 d內(nèi)不被降解[12]。FASC膠作為成纖維細(xì)胞粘附的基質(zhì)，不干擾成纖維細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

圖2 NIH3T3細(xì)胞與FASC涂層膠共培養(yǎng)MTT實(shí)驗(yàn)的OD值Fig. 2 The OD values of MTT tests for co-culturing of NIH3T3 fibroblasts and FASC coating gums (P>0.05)

2.3 FASC溶液對(duì)NIH3T3細(xì)胞的趨化性

在倒置顯微鏡下可見，經(jīng)結(jié)晶紫染色的NIH3T3成纖維細(xì)胞呈紫紅色，散在分布于趨化小室微孔膜下面(見圖3)。實(shí)驗(yàn)組隨著FASC溶液濃度的升高，趨化到膜下的細(xì)胞數(shù)量也增多，各實(shí)驗(yàn)組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明FASC溶液對(duì)NIH3T3成纖維細(xì)胞的趨化能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(見圖4)。同時(shí)，趨化指數(shù)與FASC溶液濃度也呈正相關(guān)(P<0.05)(見圖4)。

圖3 趨化實(shí)驗(yàn)形態(tài)(淺色箭頭：Transwell膜的微孔；深色箭頭：趨化到膜下面的細(xì)胞)。(a) 陰性對(duì)照組；(b) 陽性對(duì)照組；(c) 2 μg/mL FASC溶液組；(d) 4 μg/mL FASC溶液組；(e) 8 μg/mL FASC溶液組；(f) 16 μg/mL FASC溶液組Fig. 3 The morphology of chemotatic experiments (The red arrow indicates a micropore of transwell membrane; the black arrow indicates a cell transiting membrane). (a) Negative control group; (b) Positive control group; (c) 2 μg/mL FASC solution group; (d) 4 μg/mL FASC solution group; (e) 8 μg/mL FASC solution group; (f) 16 μg/mL FASC solution group

圖4 向FASC溶液趨化并通過膜的NIH3T3細(xì)胞數(shù)和趨化指數(shù)(與對(duì)照組相比，*表示P<0.05,**表示 P<0.01)Fig.4 The counts and chemotatic indexes of NIH3T3 fibroblasts transiting through membrane towards FASC solutions(Compared with negative group, * indicates P<0.05, ** indicates P<0.01)

2.4 FASC涂層膠對(duì)NIH3T3細(xì)胞的通透性

在顯微鏡下可見，成纖維細(xì)胞能夠透過FASC涂層膠侵襲到小室下面(見圖5)。隨著FASC涂層膠的濃度增加，趨化到小室下室膜的細(xì)胞數(shù)量減少，侵襲指數(shù)隨FASC涂層膠的濃度增加而降低(見圖6)。實(shí)驗(yàn)組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明FASC涂層膠對(duì)細(xì)胞的通透性與其質(zhì)量濃度呈反相關(guān)。

圖5 侵襲實(shí)驗(yàn)形態(tài)(淺色箭頭：Transwell膜的微孔；深色箭頭：趨化到膜下面的細(xì)胞)。(a) FASC涂層膠；(b) 陰性對(duì)照組；(c) 1 mg/mL FASC涂層膠；(d) 2 mg/mL FASC涂層膠；(e) 3 mg/mL FASC涂層膠 Fig.5 The morphology of invasive experiment(The red arrow indicates a micropore of transwell membrane; the black arrow indicates a cell transiting membrane). (a) FASC coating gum; (b) Negative control group; (c) 1 mg/mL FASC coating gum; (d) 2 mg/mL FASC coating gum; (e) 3 mg/mL FASC coating gum

圖6 通過FASC涂層膠到下室膜的NIH3T3侵襲指數(shù)(與對(duì)照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)Fig.6 The invasive indexes of NIH3T3 fibroblasts transiting through FASC coating gums to the bottom chamber membrane (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with negative group)

3 討論

膠原蛋白材料在軟骨、腱、脂肪、皮膚、牙周膜、角膜等組織工程以及藥物緩釋載體、創(chuàng)面敷料、體外細(xì)胞擴(kuò)增等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有所利用[13]。哺乳動(dòng)物膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，同時(shí)亦是細(xì)胞黏附、增殖、分化的基質(zhì)，具有優(yōu)良的生物相容性、低抗原性，能夠承載不同類型的細(xì)胞，是應(yīng)用較為廣泛的生物材料，在組織工程研究中日益受到矚目[14]。成纖維細(xì)胞有維持組織結(jié)構(gòu)和參與損傷修復(fù)的功能，在組織損傷過程中，成纖維細(xì)胞在各種活化因素(如低氧、內(nèi)毒素等)的作用下，發(fā)生增殖、遷移、活化，并分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白、糖蛋白等[15]。研究表明，成纖維細(xì)胞的適度增殖可以促進(jìn)炎癥消退。在炎癥反應(yīng)初期，成纖維細(xì)胞與白細(xì)胞相互作用，加強(qiáng)白細(xì)胞的活化與增殖，同時(shí)成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及黏附分子作用于白細(xì)胞，促進(jìn)其進(jìn)入淋巴組織，最終可使炎癥消退。在炎癥過程中，中性粒細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的黏附作用可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，成纖維細(xì)胞也有類似于巨噬細(xì)胞的吞噬作用，能吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞，最終可使中性粒細(xì)胞清除，從而促進(jìn)炎癥成功地消退[16]。正常功能的成纖維細(xì)胞，能抑制單核細(xì)胞的增殖能力，防止炎癥的擴(kuò)大，同時(shí)成纖維細(xì)胞及其分泌物可起到防止病原菌的感染擴(kuò)散、介導(dǎo)免疫反應(yīng)等良性作用。因此，促進(jìn)成纖維細(xì)胞適度增殖對(duì)于慢性炎癥的恢復(fù)有積極的意義[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，非變性FASC溶液促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞的增殖，即溶液狀態(tài)的FASC具有促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活性[18]。而作為細(xì)胞黏附基質(zhì)的熱變性FASC涂層膠無細(xì)胞毒性及增殖刺激性，不干擾成纖維細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。FASC的特性能保障炎癥過程中成纖維細(xì)胞的適度增殖，并防止炎癥的擴(kuò)大[19]。炎癥后期成纖維細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)來修復(fù)組織損傷[20]。另外，在趨化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)FASC對(duì)成纖維細(xì)胞有趨化性，這說明FASC有類似于趨化因子的功能，在組織損傷過程中膠原蛋白可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞聚集，促進(jìn)后者的增殖和膠原合成[21]。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ASC涂層膠對(duì)成纖維細(xì)胞有通透性，在趨化因子的作用下成纖維細(xì)胞能夠通過FASC涂層膠的孔徑遷移到小室膜下面，通過的細(xì)胞數(shù)量與FASC涂層膠的質(zhì)量濃度成反相關(guān)。侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)ASC膠具有一定的通透性[22]。隨著FASC涂層膠質(zhì)量濃度的增加給細(xì)胞遷移帶來的阻礙更大，細(xì)胞更難以穿過FASC涂層膠的孔徑[23]。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)ASC在體外與NIH3T3成纖維細(xì)胞的生物相容性良好。

4 結(jié)論

中國漁業(yè)的資源較豐富，可為魚皮膠原的開發(fā)供給充足的原料，具備開發(fā)安全、經(jīng)濟(jì)的膠原材料的潛力。但魚皮膠原蛋白應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的研究有待系統(tǒng)開展，特別是相關(guān)材料的生物相容性有待驗(yàn)證。本研究通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了未變性的FASC溶液促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖且具有趨化作用。熱變性的FASC涂層膠不干擾細(xì)胞增殖并具有一定的通透性，可作為基質(zhì)供細(xì)胞黏附。所用草魚魚皮酸溶性膠原蛋白(FASC)材料無細(xì)胞毒性，可供成纖維細(xì)胞黏附、遷移，具有細(xì)胞相容性優(yōu)勢(shì)，可以作為組織植入或敷蓋材料進(jìn)行開發(fā)利用。

(致謝：感謝碩士研究生呂楚風(fēng)和譚容容參與本研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作。)

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The Cytocompatibility of Ctenopharyngodon Idellus Fishskin Collagen with NIH3T3 Fibroblasts

Yu Lan1Wang Haibo2Chen Zhuo1Fang Cheng1*

1(LaboratoryofTransplantEngineering，WuhanPolytechnicalUniversity，Wuhan430023，China)2(CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering，WuhanPolytechnicalUniversity，Wuhan430023，China)

This study is aimed to test the cytocompatibility of fishskin acid-soluble collagen (FASC) of ctenopharyngodon idellus in vitro. The proliferation rates of NIH3T3 fibroblasts were detected using different concentrations of FASC solutions or coating gums by MTT experiment (n=6). The chemotaxis of fibroblasts towards FASC solutions were tested by chemotactic experiments of transwell (n=3). The cellular permeabilities in different concentrations of FASC coating gums were detected by invasive experiments of transwell (n=3). FASC solutions promote proliferation of NIH3T3 fibroblasts and the growth activity of the fibroblasts was dose-dependent on FASC. The proliferation rates of 16 μg/mL FASC solution in 48 and 96 h were (63.7±7.9)% and (87.3±8.7)%, that showed significant differences compared with the control group (P<0.001). NIH3T3 fibroblasts grew on FASC coating gums without significant differences compared with the control group (P>0.05). The chemotatic indexes showed significant differences between the concentration gradient groups of FASC solutions and the control group(P<0.05), which indicated that FASC has chemotaxis to fibroblasts. Invasion experiments showed fibroblasts could pass through FASC coating gums. These experiments confirmed that FASC possesses favourable cytocompatibility with NIH3T3 fibroblasts.

collagen; fishskin; ctenopharyngodon idellus; fibroblasts; cytocompatibility

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 02.011

2016-04-27， 錄用日期:2016-07-11

國家自然科學(xué)基金(21376183)；湖北省自然科學(xué)基金(2015CFC845)

R318

A

0258-8021(2017) 02-0205-06

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: fang_cheng@foxmail.com