吳龍?jiān)拢惉?，向福?*，付自建，王普健，何峰，2

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

杏鮑菇多糖的酶法提取及其保濕和抗氧化活性評(píng)價(jià)

吳龍?jiān)?，陳瑤1，向福1，2*，付自建1，王普健1，何峰1，2

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃岡438000）

利用纖維素酶提取杏鮑菇中多糖，基于單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并探討了多糖提取物的保濕性和抗氧化活性。結(jié)果表明，酶法提取的最佳工藝條件為纖維素酶用量0.7%，料液比1∶15（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時(shí)間120 min。在此條件下，杏鮑菇多糖的提取率為2.42%。同時(shí)，1%杏鮑菇多糖的保濕性在2 h內(nèi)優(yōu)于5%甘油，總抗氧化能力相當(dāng)于VC的90.8%～96.7%，對(duì)羥基自由基清除能力可達(dá)到VC的82.2%，表明所提取的杏鮑菇多糖具有良好的保濕性和抗氧化活性。

杏鮑菇多糖；酶法提取；保濕性；抗氧化活性；羥基自由基清除能力

WU Longyue1,CHEN Yao1,XIANG Fu1,2*,FU Zijian1,WANG Pujian1,HE Feng1,2
(1.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huanggang 438000,China; 2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huanggang 438000,China)

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）為側(cè)耳科側(cè)耳屬食用菌，也叫刺芹側(cè)耳，集食用、食療、藥用于一體，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有鮑魚和杏仁香味，被譽(yù)為“平菇王”、“草原上的美味牛肝菌”[1]。杏鮑菇含有豐富的真菌多糖，是其主要活性成分[2]?，F(xiàn)代研究表明，杏鮑菇多糖及其衍生物不僅具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等活性[2-7]，同時(shí)還能增強(qiáng)免疫、調(diào)理腸胃以及防止動(dòng)脈硬化[8-10]，甚至還具有保濕功效[11]，在醫(yī)藥食品、化妝美容等領(lǐng)域利用價(jià)值高，開發(fā)前景廣。

常用多糖提取方法（如水提、堿提、酸提、醇提等）存在提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)或者易引起多糖降解、影響生物活性等問題[2，11]。酶能溫和高效地降解生物大分子，酶法提取有利于杏鮑菇多糖活性成分的溶出，不破壞生物活性，且副產(chǎn)物少，實(shí)用安全。

近年來，從天然物質(zhì)資源中獲取兼具保濕和營(yíng)養(yǎng)雙重功能的天然保濕劑已逐漸引起人們的關(guān)注[11]。天然真菌多糖作為重要的保濕材料，研究其高效安全的提取工藝和抗氧化、保濕等功效活性，對(duì)科學(xué)利用杏鮑菇資源、深入開發(fā)高附加值產(chǎn)品具有現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

本研究采用酶法提取杏鮑菇多糖，通過單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，并以維生素C（vitaminC，VC）為對(duì)照[12]，評(píng)價(jià)其總抗氧化活性和羥基自由基清除能力；以甘油為對(duì)照[11]，評(píng)價(jià)杏鮑菇多糖的保濕性能，以期為杏鮑菇在化妝美容領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇子實(shí)體：市售，烘干，粉碎備用；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：上海金橞生物科技有限公司；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.99%）：上海麥克林生化科技有限公司；苯酚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：上海山浦化工有限公司；氯仿（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；正丁醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酸性纖維素酶（20 000 U/g）：湖北帝鑫化工制造有限公司；總抗氧化試劑盒（批號(hào)20161117）、羥基自由基試劑盒（批號(hào)20161121）：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian Cary 100 Scan型紫外可見分光光度計(jì)：美國Varian公司；Ax-205METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；GL-21M型醫(yī)用離心機(jī)：湖南平凡科技有限公司；GZX-9240MBE恒溫干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-C型恒溫振蕩器：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[13-14]所述方法，精密稱取10.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加超純水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品母液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL分別置于10 mL容量瓶，加超純水定容，配制成質(zhì)量濃度為0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、30 μg/mL、35 μg/mL、40 μg/mL、45 μg/mL、50 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL于試管，先后加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，靜置10 min后于常溫下振蕩10～20 min，靜置2～3 h，以不加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑為空白，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：A=0.015 6C+0.000 8，R2=0.999 5，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在5～50 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

平行稱取3份杏鮑菇粉末10 g分別置于錐形瓶中，加入適量的纖維素酶，按照一定的料液比（g∶mL）加入不同體積的水，攪拌均勻，置于恒溫振蕩箱中酶解一段時(shí)間后放入沸水水浴鍋中滅酶15 min，然后冷卻到50～60℃左右抽濾，制得粗多糖溶液。采用Sevage法[15]對(duì)制得粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白，取100 mL粗多糖溶液加入離心管中，并加入等體積的4∶1（V∶V）的氯仿和正丁醇，充分搖勻后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清，去脂去蛋白兩次，合并上清液。在上清液中加入4倍體積的無水乙醇沉淀，常溫醇沉20 min，10 000 r/min離心10 min，取沉淀得多糖樣品[11]?？疾炖w維素酶用量（0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）、酶解時(shí)間（100 min、110 min、120 min、130 min）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃）對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響。

1.3.3 杏鮑菇多糖換算因子測(cè)定及提取率的計(jì)算

根據(jù)文獻(xiàn)方法[15]，多糖樣品在60℃干燥至質(zhì)量恒定，準(zhǔn)確稱取10 mg，加適量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，制得多糖儲(chǔ)備液。精確吸取多糖儲(chǔ)備液2.0 mL，按1.3.1方法處理后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖儲(chǔ)備液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（ρ0），換算因子計(jì)算公式如下：

式中：f為換算因子；m0為多糖質(zhì)量，μg；ρ0為多糖儲(chǔ)備液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為多糖儲(chǔ)備液體積，mL；D0為多糖的稀釋倍數(shù)。試驗(yàn)測(cè)得換算因子f=3.36。

將多糖樣品用20 mL去離子水溶解，稀釋250倍后再吸取2.0 mL，按1.3.1方法處理后在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其葡萄糖的質(zhì)量濃度，多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：Y為多糖提取率，%；ρ為多糖樣品液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為多糖樣品液體積，mL；D為樣品液的稀釋倍數(shù)；f為換算因子，3.36；m為杏鮑菇樣品的質(zhì)量，μg。

1.3.4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響較顯著的酶解時(shí)間、料液比和酶解溫度3因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化多糖提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for polysaccharides extraction process optimization

1.3.5 保濕性能評(píng)價(jià)[11]

以甘油和去離子水為參照，采用體外法評(píng)價(jià)杏鮑菇多糖粗提物的保濕性能。將杏鮑菇多糖提取物和甘油分別配成1%和5%的水溶液，選用76 mm×26 mm相同規(guī)格的載玻片3片，分別在載玻片表面貼一層醫(yī)用透氣膠帶，準(zhǔn)確吸取杏鮑菇多糖溶液、甘油溶液、去離子水各200 μL，分別點(diǎn)樣在透氣膠帶上，稱取初始質(zhì)量，然后在室溫下放置一定時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min）后稱質(zhì)量，失水率越低，則保濕性能越好。失水率計(jì)算公式如下：

式中：L為失水率，%；M0為初始質(zhì)量，g；Mt為一定時(shí)間后的載玻片質(zhì)量，g；t為放置時(shí)間，min。

1.3.6 總抗氧化能力評(píng)價(jià)

分別配制質(zhì)量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L的杏鮑菇多糖溶液，并以相同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對(duì)照，根據(jù)總抗氧化試劑盒說明書操作后，將測(cè)試管、對(duì)照管樣液在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸光度值。在37℃條件下，每毫升樣品每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，定義為一個(gè)總抗氧化能力單位（U），則總抗氧化能力計(jì)算公式如下：

式中：T為總抗氧能力，U/mL；As為測(cè)定管吸光度值；Ac為對(duì)照管吸光度值；Vt為反應(yīng)液總體積，mL；Vs為取樣量，mL；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3.7 羥基自由基清除能力評(píng)價(jià)

分別配制質(zhì)量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的杏鮑菇多糖溶液，并以相同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對(duì)照，根據(jù)羥基自由基試劑盒說明書操作后，將測(cè)定管、空白管、對(duì)照管樣液在波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光度值。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：H為羥基自由基清除率，%；OD1為測(cè)定管吸光度值；OD2為對(duì)照管吸光度值；OD3為空白管吸光度值。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用正交設(shè)計(jì)助手II v3.1和EXCEL 2003軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，通過F值分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 纖維素酶用量對(duì)多糖提取率的影響

考察纖維素酶用量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 纖維素酶用量對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖1可知，隨著纖維素酶量的增加，杏鮑菇多糖的提取率逐漸增大，當(dāng)纖維素酶用量為0.7%時(shí)，杏鮑菇多糖提取率達(dá)到最高，為1.44%；繼續(xù)增加酶用量至0.8%，杏鮑菇多糖提取率稍有下降，為1.41%，與1.44%無顯著差異（P=0.54＞0.05），即繼續(xù)增加纖維素酶量，多糖提取率趨于穩(wěn)定。這是由于酶量過多，酶分子已達(dá)飽和，與底物接觸過剩，降低了反應(yīng)速率，減少了多糖溶出[16]。因此，纖維素酶用量宜選擇0.7%。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

考察酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間從100 min增加到110 min，杏鮑菇多糖提取率顯著增加（P=0.04＜0.05），且當(dāng)酶解時(shí)間為110 min時(shí)，杏鮑菇多糖提取率達(dá)到峰值，為1.07%；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間至120 min，提取率顯著降低（P=0.03＜0.05），延長(zhǎng)至130 min時(shí)，提取率無顯著變化（P=0.68＞0.05），基本趨于穩(wěn)定。酶解時(shí)間對(duì)杏鮑菇多糖的提取率影響顯著，因此，選擇酶解時(shí)間110 min為宜。

2.1.3 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

考察料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖3可知，料液比對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響顯著。料液比從1∶10（g∶mL）增加到1∶15（g∶mL）時(shí)，杏鮑菇多糖提取率增加到峰值，為1.27%，差異性顯著（P=0.02＜0.05）；隨著料液比增加至1∶20（g∶mL）時(shí)，多糖提取率下降至0.73%，差異極顯著（P=0.001＜0.01），下降趨勢(shì)明顯。因此，選擇料液比1∶15（g∶mL）為宜。

2.1.4 酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響

考察酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of P.eryngiipolysaccharide

由圖4可知，酶解溫度＜60℃時(shí)，多糖提取率隨著溫度升高逐漸增加，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，杏鮑菇多糖提取率達(dá)到峰值，為1.30%，差異顯著（P=0.006＜0.01）；繼續(xù)升高酶解溫度到70℃，多糖提取率則顯著下降（P＜0.001）。這是由于纖維素酶在60℃達(dá)到最適酶解溫度，酶解活性最強(qiáng)，高于和低于該溫度其酶解活性降低，從而導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，選擇酶解溫度60℃為宜。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 杏鮑菇多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for extraction process optimization ofP.eryngii polysaccharide

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定纖維素酶用量為0.7%，以杏鮑菇多糖提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取酶解時(shí)間（A）、料液比（B）和酶解溫度（C）3個(gè)對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響較顯著的因素為變量值，設(shè)計(jì)L9（33）正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal experiments results

由表2和表3結(jié)果可知，各因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響次序?yàn)椋篊＞A＞B，即酶解溫度＞酶解時(shí)間＞料液比，但各因素的影響均不顯著。獲得最佳工藝條件為A3B2C1，即酶解時(shí)間120 min，料液比1∶15（g∶mL），酶解溫度50℃。該組合在表2的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，多糖提取率最高，為2.42%。

2.3 保濕性評(píng)價(jià)

去離子水、1%杏鮑菇多糖溶液、5%甘油溶液在一定時(shí)間內(nèi)的失水率變化情況如圖5所示。由圖5可知，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，3種樣品的失水率均呈總體下降趨勢(shì)。從30min到120 min，去離子水的失水率由24%降至9.6%，各時(shí)間段失水率降低極顯著（P＜0.001）；5%甘油溶液從30 min到90 min，失水率明顯降低（P＜0.05），從90 min到120 min則降低極顯著（P＜0.001）；1%杏鮑菇多糖溶液從30 min到90 min，失水率降低不明顯（P＞0.05），從90 min到120 min則顯著降低（P＜0.01）。在120 min內(nèi)，盡管3種樣品的失水率曲線下降趨勢(shì)基本，但失水率最高的一直是去離子水樣品，其次是5%甘油溶液，1%杏鮑菇多糖溶液的失水率在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均最低，表明在120 min內(nèi)1%杏鮑菇多糖的保濕性優(yōu)于5%甘油。這與張志軍等[11]的研究結(jié)果一致。

圖5 三種樣品的失水率Fig.5 Rate of water loss of three samples

2.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

以VC為陽性對(duì)照，測(cè)定質(zhì)量濃度為10g/L、20g/L、30g/L、40 g/L杏鮑菇多糖樣品的總抗氧化能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6 杏鮑菇多糖和VC的總抗氧化能力的比較Fig.6 Comparison of total antioxidant activity ofP.eryngii polysaccharide and VC

在圖6中的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度VC的總抗氧化能力無明顯差異（P＞0.05），基本穩(wěn)定在99 U/mL左右；杏鮑菇多糖的總抗氧化能力則呈上升趨勢(shì)：在10 g/L質(zhì)量濃度時(shí)最低，為VC的90.8%，40 g/L時(shí)總抗氧化能力最強(qiáng)，達(dá)到96.35U/mL，相當(dāng)于VC的96.7%。表明杏鮑菇多糖具有一定的抗氧化能力，為相同質(zhì)量濃度VC的90.8%～96.7%。

2.5 杏鮑菇多糖清除羥基自由基能力評(píng)價(jià)

羥基自由基是在新陳代謝過程中產(chǎn)生的活潑自由基，毒性很大，作用于體內(nèi)酯類、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂而引發(fā)各種疾病[17]。檢測(cè)質(zhì)量濃度為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的杏鮑菇多糖和VC對(duì)羥基自由基清除能力，結(jié)果如圖7所示。

圖7 杏鮑菇多糖和和VC對(duì)羥基自由基清除能力的比較Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging activities of P.eryngiipolysaccharide and VC

由圖7可知，各質(zhì)量濃度下，杏鮑菇多糖的羥基自由基清除率均低于VC，且羥基自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)質(zhì)量濃度從30 g/L增加至40 g/L時(shí)，二者清除羥基自由基能力大幅增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，VC的羥基自由基清除率達(dá)到99.23%，杏鮑菇多糖則達(dá)到81.58%。表明杏鮑菇多糖具有一定的羥基自由基清除能力，可達(dá)到相同質(zhì)量濃度VC的82.2%。

3 結(jié)論

本研究基于單因素和正交試驗(yàn)，建立了酶法提取杏鮑菇中多糖的工藝。獲得杏鮑菇多糖提取的最佳工藝條件為：纖維素酶用量0.7%、酶解時(shí)間120 min、料液比1∶15（g∶mL）、酶解溫度50℃。在此條件下，多糖提取率為2.42%。在120min內(nèi)，1%杏鮑菇多糖的保濕性優(yōu)于5%的甘油；總抗氧化能力為相同質(zhì)量濃度VC的90.8%～96.7%，表明所提取杏鮑菇多糖具有良好的保濕性和抗氧化能力；羥基自由基清除率達(dá)到相同質(zhì)量濃度VC的82.2%，具有良好的羥基自由基清除能力。因此，杏鮑菇多糖可作為一種兼具保濕和抗氧化雙重功能的天然保濕劑，具有較好的應(yīng)用前景。

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R284.2

0254-5071（2017）05-0161-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.034

2017-02-18

大學(xué)生創(chuàng)新培育項(xiàng)目（sgpx201601）

吳龍?jiān)拢?995-），女，本科生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取。

*通訊作者：向福（1977-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源利用。