包怡紅，梁敏，趙行，常晨，徐福成

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑河市中俄林業(yè)科技合作園區(qū)，黑龍江黑河164300）

俄羅斯野生藍(lán)莓引種前后營(yíng)養(yǎng)成分含量及抗氧化活性的比較分析

包怡紅1，梁敏1，趙行1，常晨1，徐福成2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑河市中俄林業(yè)科技合作園區(qū)，黑龍江黑河164300）

為了研究引種栽培對(duì)于野生藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分及抗氧化活性的影響，選取俄羅斯阿穆爾州騰達(dá)市的野生藍(lán)莓（藍(lán)莓RU）和將該種野生藍(lán)莓經(jīng)引種栽培讓其自然生長(zhǎng)于中國(guó)黑河市二站鄉(xiāng)的野生藍(lán)莓（藍(lán)莓HH）為原料，采用福林酚法、pH示差法、亞硝酸鈉-硝酸銀比色法和電感耦合等離子體-質(zhì)譜法（ICP-MS）等方法分析比較了兩種藍(lán)莓的活性成分（多酚、花色苷、黃酮）、礦物質(zhì)元素和糖酸含量，并對(duì)水提物和醇提物的抗氧化能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，藍(lán)莓RU的可溶性固形物、還原糖、多酚含量高于藍(lán)莓HH，但總酸、花色苷、黃酮含量低于藍(lán)莓HH。二者的Ca、Mn、P、Zn、Cr元素含量存在顯著差異（P＜0.05），其他的礦物質(zhì)元素差異不顯著（P＞0.05）。藍(lán)莓RU水提物與醇提物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原力高于藍(lán)莓HH，但藍(lán)莓HH的羥基自由基的清除率高于藍(lán)莓RU。

野生藍(lán)莓；引種前后；主要成分；抗氧化活性

BAO Yihong1,LIANG Min1,ZHAO Hang1,CHANG Chen1,XU Fucheng2
(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.Forestry Science and Technology Cooperation Park Between China and Russia in Heihe City,Heihe 164300,China)

藍(lán)莓又稱藍(lán)漿果、越橘，杜鵑花科越橘屬植物，為多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實(shí)形狀近似圓形，顏色呈藍(lán)色，外被一層白色果粉[1-2]。藍(lán)莓分布于北半球的亞熱帶和溫帶，全世界約有400種[3]。其不僅含有有機(jī)酸、糖類、多種礦物質(zhì)元素、維生素，還含有多種活性成分（如多酚、花青素、黃酮等），因此藍(lán)莓除了可以鮮食外，還可應(yīng)用于制藥和化妝品行業(yè)[1，4]。研究表明，藍(lán)莓具有抗氧化[5]、抑菌[6]、減輕輻射誘發(fā)的肺傷害[7]、抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖、改變酶活、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8-9]、抗衰老[10]、增強(qiáng)人體免疫力[11]、保護(hù)視力[12]等作用。

目前，研究者對(duì)藍(lán)莓活性成分的提取及功能活性進(jìn)行了較多的研究。如孟憲軍等[13]提取藍(lán)莓多糖，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗氧化性。CHORFAN等[14]采用硅膠和C-18和DSC-SCX陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)野生藍(lán)莓的花青素進(jìn)行固相萃取得到高純度花青素，并進(jìn)行自由基清除能力的研究。美國(guó)塔夫茨大學(xué)的研究人員[15]曾對(duì)60種不同果蔬的抗氧化能力進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，藍(lán)莓的抗氧化能力位列前茅。

有醫(yī)學(xué)研究表明[16]，一些重大疾?。ㄈ缒[瘤、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病以及衰老等）均是由自由基氧化損傷所致，因此抗氧化活性具有很重要的研究意義。雖然近年來(lái)，廣大研究者對(duì)藍(lán)莓及其抗氧化性進(jìn)行了大量研究，但是，同種藍(lán)莓引種栽培前后于不同生長(zhǎng)條件下的藍(lán)莓之間成分及抗氧化活性的差異鮮有研究。本試驗(yàn)選取俄羅斯阿穆爾州騰達(dá)市的野生藍(lán)莓（藍(lán)莓RU）和將該野生藍(lán)莓引種栽培于中國(guó)黑河二站鄉(xiāng)的藍(lán)莓（藍(lán)莓HH）為原料，分析比較了二者的主要成分，水提物和醇提物的抗氧化活性，為藍(lán)莓的引種栽培以及產(chǎn)品開發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

俄羅斯野生藍(lán)莓（藍(lán)莓RU）產(chǎn)于俄羅斯阿穆爾州騰達(dá)市（東經(jīng)124°43′，北緯55°09′）；中國(guó)黑河二站鄉(xiāng)藍(lán)莓（藍(lán)莓HH）引種栽培于黑河市二站鄉(xiāng)（東經(jīng)126°58′，北緯49°40′）并自然生長(zhǎng)；福林酚、苯酚、蘆丁、沒食子酸（純度≥98%）、鐵氰化鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氯化鐵、硫酸亞鐵、硝酸銀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NexION 300X電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀（Inductively coupledplasma-massspectrometry，ICP-MS）：鉑金埃爾默企業(yè)管理有限公司；722型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；VBR20手持式折光儀：上海醫(yī)聯(lián)控溫儀器廠；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；天量系列LT1002E電子天平：常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓的預(yù)處理

挑選成熟度一致且無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的藍(lán)莓，凍存于-20℃的冰箱內(nèi)，備用。

1.3.2 活性成分的提取

（1）花色苷提取液的制備

將藍(lán)莓用研缽研磨破碎，按料液比1∶15（g∶mL）加入提取劑（體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液+0.1%濃鹽酸），于60℃條件下水浴避光提取90 min，抽濾、濃縮得到花色苷提取液。

（2）黃酮提取液的制備

磨碎的藍(lán)莓按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)65%乙醇溶液，60℃水浴提取2 h，抽濾，濃縮得到黃酮提取液。

（3）多酚提取液的制備

磨碎的藍(lán)莓按料液比1∶25（g∶mL）加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，于40℃、超聲功率為500W的條件下超聲提取90min。經(jīng)抽濾、濃縮得到多酚提取液。

1.3.3 測(cè)定方法

（1）糖酸指標(biāo)

可溶性固形物：手持式折光儀[17]；pH值：pH計(jì)[17]；還原糖含量：參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》的方法；總酸含量：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》的方法；

（2）礦物質(zhì)元素含量

參照陸美斌等[18]的方法采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。具體方法：精確定量稱取藍(lán)莓果汁0.5g（精確到0.0001g）左右，置于聚四氟乙烯微波消解管中，加8 mL硝酸浸泡過(guò)夜，再加3 mL過(guò)氧化氫按微波程序消解，待消解完全后，冷卻，在趕酸儀120℃條件下?lián)]酸3 h，用超純水轉(zhuǎn)移定容至25 mL，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

（3）活性成分

花色苷含量：參照DENEV P等[19]采用pH示差法。

黃酮含量：采用亞硝酸鈉-硝酸銀比色法[20]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，將不同質(zhì)量濃度的蘆丁在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.479 1x+0.013 05，R2=0.999 1。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中黃酮含量。

多酚含量：采用福林酚法[21]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以蒸餾水為空白，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.065 9x+0.031 37，R2=0.999 1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多酚的含量。

1.3.4 藍(lán)莓水提物和醇提物抗氧化測(cè)定

（1）藍(lán)莓水提物的制備

磨碎的藍(lán)莓按料液比1∶20（g∶mL）加蒸餾水，80℃水浴提取2 h。抽濾得到濾液，為藍(lán)莓水提物。

（2）藍(lán)莓醇提物的制備

磨碎的藍(lán)莓按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液，50℃水浴提取2h。抽濾得到濾液，為藍(lán)莓醇提物。

（3）DPPH自由基清除率的測(cè)定

取2mL不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓溶液加入2mL0.2mmol/L DPPH溶液，以溶劑為對(duì)照，立即搖勻，在室溫條件下置于暗處30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值。取不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓提取液2 mL，與2 mL溶劑混合在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度值。取2 mL DPPH與2 mL溶劑混合在波長(zhǎng)517nm處測(cè)吸光度值[22]。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。根據(jù)下列公式進(jìn)行DPPH自由基清除率計(jì)算：

式中：A0為2mL DPPH與2 mL溶劑的吸光度值；A1為2 mL不同濃度藍(lán)莓溶液與2 mL DPPH混合溶液的吸光度值；A2為2mL不同濃度的藍(lán)莓溶液與2mL溶劑的吸光度值。

（4）羥基自由基清除率的測(cè)定

參照孟阿會(huì)[23]的方法并作一些調(diào)整。在試管內(nèi)分別加入1 mL水楊酸乙醇溶液、1 mL FeSO4溶液、不同樣品質(zhì)量濃度的藍(lán)莓提取液7 mL，加入1 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。振蕩搖勻，于37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)吸光度值，以蒸餾水代替雙氧水作對(duì)照，以溶劑代替藍(lán)莓提取液作空白組。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。根據(jù)下列公式進(jìn)行羥基自由基清除率計(jì)算：

式中：A0為溶劑替代藍(lán)莓提取液的吸光度值；Ai0為蒸餾水替代雙氧水的吸光度值；Ai為不同濃度藍(lán)莓提取液的吸光度值。

（5）鐵離子還原力的測(cè)定

取2.5 mL不同樣品質(zhì)量濃度的藍(lán)莓提取液，加2.0 mL磷酸緩沖液（pH6.6）和2.5 mL1%的鐵氰化鉀，50℃水浴30 min，反應(yīng)結(jié)束迅速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，離心，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，靜置10 min，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度值。重復(fù)3次，取平均值[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩地野生藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)成分比較

生長(zhǎng)于不同環(huán)境的兩種自然生長(zhǎng)的藍(lán)莓：藍(lán)莓RU和藍(lán)莓HH，盡管外觀沒有明顯區(qū)別，但成分含量卻有所差別，具體結(jié)果見表1和表2。

表1 兩種藍(lán)莓中糖酸指標(biāo)Table 1 Sugar and acid indexes of two kinds of blueberry

由表1可知，藍(lán)莓RU的pH值、還原糖含量和可溶性固形物高于藍(lán)莓HH，而總酸含量低于藍(lán)莓HH。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，兩種藍(lán)莓的4種成分含量差異性顯著（P＜0.05），尤其是還原糖含量，二者相差較多，這可能是由于阿穆爾州騰達(dá)市的緯度高于黑河，使得藍(lán)莓RU所接受的日照時(shí)間要長(zhǎng)于藍(lán)莓HH，從而導(dǎo)致藍(lán)莓RU進(jìn)行的光合作用時(shí)間長(zhǎng)，而呼吸作用時(shí)間較短，積累了更多的糖類化合物。

表2 兩種藍(lán)莓中礦物質(zhì)元素的含量比較Table 2 Comparison of mineral elements content in two kinds of blueberrymg/kg

由表2可知，兩種藍(lán)莓均含有豐富的礦物質(zhì)元素，其中K含量最高，其次是Ca、Mg、P，此外，還含有Fe、Zn等人體所需的礦物質(zhì)元素。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明兩種藍(lán)莓中礦物質(zhì)元素Ca、P、Zn、Mn、Cr的含量存在顯著性差異，而K、Mg、Fe、Cu、Co無(wú)顯著性差異。這可能由于兩個(gè)地方的土壤條件對(duì)藍(lán)莓中礦物元素的形成起到了主導(dǎo)因素。

2.2 活性成分的含量

研究表明藍(lán)莓中存在著多種活性成分。本試驗(yàn)的不同產(chǎn)地的兩種藍(lán)莓中活性成分（多酚、黃酮、花色苷）的含量如圖1所示。

圖1 兩種藍(lán)莓中活性成分含量比較Fig.1 Comparison of active components contents of two kinds of blueberry

由圖1可以看出，兩種藍(lán)莓的三種活性成分存在一定程度的差異。其中，藍(lán)莓HH的花色苷和黃酮含量高于藍(lán)莓RU，而多酚含量低于藍(lán)莓RU，通過(guò)顯著性分析，結(jié)果顯示這三種活性成分含量存在顯著性差異（P＜0.05）。這可能是由于這兩種野生藍(lán)莓的生長(zhǎng)環(huán)境，如光照、濕度等均會(huì)影響野生藍(lán)莓成熟期間花色苷、黃酮和多酚在果內(nèi)的累積。

2.3 水提物抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

以蒸餾水為溶劑代替水提藍(lán)莓溶液作空白對(duì)照，采用1.3.4中DPPH自由基清除率的測(cè)定方法對(duì)兩種藍(lán)莓水提物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2 兩種藍(lán)莓水提物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on DPPH free radicals

由圖2可知，藍(lán)莓RU的DPPH自由基清除率要高于藍(lán)莓HH。在樣品濃度增加的過(guò)程中，兩種果的清除能力都在逐漸上升，但藍(lán)莓RU清除能力上升的速度更快。在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，藍(lán)莓RU和藍(lán)莓HH的DPPH自由基清除率分別為93.22%、75.48%，二者相差較多。這可能是因?yàn)樗{(lán)莓RU中的多糖含量高于藍(lán)莓HH。大量研究已經(jīng)表明，植物多糖具有一定的抗氧化活性。

2.3.2 清除羥基自由基能力

以蒸餾水為溶劑代替藍(lán)莓提取液作空白對(duì)照。兩種藍(lán)莓水提物對(duì)羥基自由基的清除率見圖3。

圖3 兩種藍(lán)莓水提物對(duì)·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on·OH

由圖3可知，藍(lán)莓HH的羥基自由基清除率要高于藍(lán)莓RU。在樣品濃度增加的過(guò)程中，兩種果的清除能力都在逐漸上升，且二者上升速度基本保持平行。在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，藍(lán)莓RU和藍(lán)莓HH的羥基自由基清除率分別為42.62%和48.24%，相對(duì)于DPPH自由基而言，兩種藍(lán)莓的羥基自由基清除能力偏低。

2.3.3 Fe3+還原力的測(cè)定

兩種藍(lán)莓水提物對(duì)Fe3+還原力見圖4。

圖4 兩種藍(lán)莓水提物對(duì)Fe3+還原能力Fig.4 Reducing capacity effect of aqueous extracts from two kinds of blueberry on Fe3+

由圖4可知，藍(lán)莓RU對(duì)Fe3+還原力高于藍(lán)莓HH，在1～5 mg/mL范圍內(nèi)，隨樣品濃度的增加，吸光度值隨著增加，但藍(lán)莓RU增加速度較快，且在樣品質(zhì)量濃度由4mg/mL變?yōu)? mg/mL時(shí)，吸光度值明顯增加。

2.4 醇提物抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

以乙醇為溶劑代替醇提藍(lán)莓溶液作為空白對(duì)照，采用1.3.4中DPPH自由基清除率的方法，測(cè)定與水提物同濃度的藍(lán)莓醇提物濃度的清除能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖5。

圖5 兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of alcohol extracts from two kinds of blueberry on DPPH free radicals

由圖5可知，藍(lán)莓RU的DPPH自由基清除率要高于藍(lán)莓HH，二者的清除率隨樣品濃度的增加而增大，且增加程度基本保持平行，在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，二者的清除率分別為91.44%和87.07%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于藍(lán)莓RU中多酚含量較高。

2.4.2 羥基自由基清除能力

以乙醇為溶劑代替藍(lán)莓醇提液作空白對(duì)照，兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)羥基自由基的清除能力見圖6。

圖6 兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effect of alcohol extracts from two kinds of blueberry on·OH

由圖6可知，藍(lán)莓HH的羥基自由基清除率要高于藍(lán)莓RU，在樣品質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL的范圍內(nèi)，樣品對(duì)羥基自由基的清除率逐漸增大，在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，分別為47.80%和38.26%。相對(duì)于醇提物對(duì)DPPH自由基清除率，醇提物對(duì)羥基自由基的清除率偏低。

2.4.3 Fe3+還原能力的測(cè)定

兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)Fe3+的還原力見圖7。

圖7 兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)Fe3+還原能力Fig.7 Reducing effect of alcohol extract from two kinds of blueberry on Fe3+

由圖7可知，藍(lán)莓RU的Fe3+還原力的要高于藍(lán)莓HH，在樣品質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL的范圍內(nèi)，樣品的Fe3+還原力逐漸升高，兩種藍(lán)莓醇提物對(duì)Fe3+的還原力相差較小。

野生藍(lán)莓水提物中的主要成分是藍(lán)莓多糖，醇提物中主要是酚類化合物。通過(guò)比較同種藍(lán)莓引種前后的兩種野生藍(lán)莓水提物和醇提物的抗氧化性發(fā)現(xiàn)二者均具有一定的抗氧化活性，在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，藍(lán)莓RU水提物和醇提物DPPH自由基清除率分別為93.22%和91.44%，藍(lán)莓HH分別為75.48%和87.07%。此外，水提物和醇提物還具有較強(qiáng)的鐵離子還原力，但是對(duì)羥基自由基的清除能力較低。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)藍(lán)莓HH與藍(lán)莓RU中主要活性成分、礦物質(zhì)元素和糖酸指標(biāo)的含量、水提物與醇提物的抗氧化活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，藍(lán)莓RU的可溶性固形物、還原糖、多酚含量高于藍(lán)莓HH，但是總酸、花色苷、黃酮含量低于藍(lán)莓HH。酸、還原糖及活性成分的差異可能是由于所處地方日照時(shí)間、年積溫等不同造成的。對(duì)于礦物質(zhì)元素，顯著性分析表明：兩種藍(lán)莓中礦物質(zhì)元素Ca、P、Zn、Mn、Cr、的含量存在顯著性差異，而K、Mg、Fe、Cu、Co無(wú)顯著性差異，這可能是因?yàn)閮傻氐耐寥罈l件及周邊環(huán)境的不同。抗氧化研究表明，藍(lán)莓RU水提物與醇提物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原力要強(qiáng)于藍(lán)莓HH，而藍(lán)莓HH的羥基自由基的清除率要強(qiáng)于藍(lán)莓RU。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)引種前后兩種自然生長(zhǎng)的藍(lán)莓在營(yíng)養(yǎng)成分方面各有千秋，且二者都具有較強(qiáng)的抗氧化性，這表明不同的經(jīng)緯度和自然環(huán)境條件會(huì)對(duì)藍(lán)莓的成分產(chǎn)生一定的影響。

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TS255.1

0254-5071（2017）05-0156-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.033

2017-01-09

中央高校項(xiàng)目專項(xiàng)基金（2572014EA02）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2015RAXXJ010）

包怡紅（1970-），女，教授，博士，研究方向?yàn)榱窒沦Y源精深加工，功能性食品。