劉道奇，楊華，陳守文，李俊輝，陳雄，王志*

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

抗氧化脅迫促進(jìn)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽

劉道奇1，楊華1，陳守文2，李俊輝3，陳雄1，王志1*

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢430068；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430062；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）發(fā)酵合成桿菌肽過(guò)程中存在的氧化脅迫影響了桿菌肽的合成效率。添加0.2%抗壞血酸和0.4%半胱氨酸使桿菌肽效價(jià)在搖瓶水平分別比對(duì)照提高了20.7%和29.4%。另外，胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活比對(duì)照分別降低了68.3%和43.8%。半胱氨酸合成加強(qiáng)工程菌株在10 L罐發(fā)酵過(guò)程中，峰值生物量（84×109CFU/mL，26 h）比出發(fā)菌株提高了9.0%，桿菌肽效價(jià)（1 090 U/mL，32 h）也提高了13.5%。Cys含量（213.3 mg/L，24 h）和過(guò)氧化氫酶活力（14～32 h）分別比對(duì)照提高了約60%和降低了15%～40%。說(shuō)明Cys作為前體氨基酸參與桿菌肽合成與參與氧化自由基清除之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，工程菌株通過(guò)增強(qiáng)Cys合成更好地滿足了細(xì)胞對(duì)兩者的生理需求，維持了細(xì)胞活性、促進(jìn)了桿菌肽合成效率。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；抗壞血酸；半胱氨酸；過(guò)氧化氫酶

LIU Daoqi1,YANG Hua1,CHEN Shouwen2,LI Junhui3,CHEN Xiong1,WANG Zhi1*
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Lifecome Bioengineering Institute of Hubei University,College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China; 3.Lifecome Biochemistry Co.,Ltd.,Pucheng,353400,China)

地衣芽胞桿菌以淀粉、豆粕等為主要原料進(jìn)行高密度發(fā)酵合成桿菌肽過(guò)程中，發(fā)酵液固形物含量高、黏度大，并且菌體生長(zhǎng)迅速促使溶氧在發(fā)酵早期跌零，因此溶解氧是影響桿菌肽合成的關(guān)鍵因素[1-2]。曾新年等[3]在轉(zhuǎn)速為300 r/min和通風(fēng)量為600 L/h的發(fā)酵條件下通過(guò)流加雙氧水有效地緩解了供氧不足的問(wèn)題，促進(jìn)了桿菌肽的合成效率，但發(fā)酵周期仍然過(guò)長(zhǎng)（42 h）。提高攪拌速度和增加通氣流量可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，在本實(shí)驗(yàn)條件下（轉(zhuǎn)速600 r/min和通風(fēng)量600 L/h）發(fā)酵周期顯著縮短了約10 h，放罐效價(jià)略有提高。但是也出現(xiàn)了“新的矛盾”，表面上看是發(fā)酵中期細(xì)胞衰老自溶，桿菌肽合成效率難以維持。

細(xì)胞進(jìn)行有氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（H2O2）、羧自由基（ROO·）、羥自由基（·OH）等會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老和生理代謝紊亂[4]。VOIGT B等[5]對(duì)地衣芽胞桿菌在發(fā)酵條件下的蛋白組學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，確定地衣芽胞桿菌在快速生長(zhǎng)過(guò)程存在嚴(yán)重的氧化脅迫效應(yīng)，整個(gè)發(fā)酵周期過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物還原酶被強(qiáng)烈而持續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)。因此，在高通風(fēng)和高轉(zhuǎn)速條件下促使地衣芽胞桿菌的生長(zhǎng)代謝的同時(shí)，很可能也加劇了細(xì)胞清除高活性氧自由基的負(fù)擔(dān)，并對(duì)細(xì)胞造成了氧化脅迫，而突出的氧化脅迫很可能是上述“新的矛盾”的內(nèi)在因素，并使細(xì)胞活力急劇而持續(xù)的下降、自溶。

作為應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞會(huì)激活氧自由基清除系統(tǒng)的表達(dá)，如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶等酶系統(tǒng)[6]從而降低其對(duì)細(xì)胞的損害。另外，微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中也特異性的存在谷胱甘肽和半胱氨酸等非酶解氧化應(yīng)激的形式，這對(duì)于清除高活性氧自由基也起到了積極作用，趙素娟[7]研究了加入外源還原型谷胱甘肽后，可以提高釀酒酵母細(xì)胞存活率及膜完整性，降低O2-和H2O2水平。

基于以上分析，本試驗(yàn)基于發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活力和前體氨基酸濃度的時(shí)序變化趨勢(shì)，研究了還原性物質(zhì)—抗壞血酸（vitamin C，VC）和半胱氨酸對(duì)地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)和合成桿菌肽的影響，通過(guò)一株半胱氨酸合成加強(qiáng)型工程菌株在10 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行驗(yàn)證，為抗氧化脅迫促進(jìn)桿菌肽合成的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌LC（BacilluslicheniformisLC）、半胱氨酸合成加強(qiáng)型地衣芽孢桿菌CY（Bacillus licheniformisCY）：湖北大學(xué)綠康生物工程研究所。

斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏20 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)pH 7.5。

種子培養(yǎng)基：豆粕50 g/L，玉米淀粉20 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣4 g/L，（NH4）2SO41 g/L，玉米漿2.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕90 g/L，淀粉40 g/L，碳酸鈣4 g/L，硫酸銨0.7 g/L，蛋白胨10 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320 pH計(jì)：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CJ-2D型無(wú)菌操作臺(tái)：天津市泰斯特儀器有限公司；SGJ-10 L/C發(fā)酵罐：上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司；TG18M臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；5417R型冷凍離心機(jī)：Eppendorf（德國(guó)）公司；UVmini-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；PURELAB Flex 1/2/3/4純水儀：英國(guó)ELGA公司；E100光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；BQ50-1J蠕動(dòng)泵：保定蘭格恒流泵有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

（1）種子活化：無(wú)菌竹簽轉(zhuǎn)接-80℃保藏甘油管菌液至250 mL茄子瓶斜面（裝量60 mL），在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。

（2）種子培養(yǎng)：培養(yǎng)好的茄子瓶斜面加50 mL無(wú)菌水洗菌苔，倒入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶（250 mL三角瓶，種子培養(yǎng)基裝量50 mL）中，輕輕搖勻，接種4 mL菌懸液，并在37℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。

（3）搖瓶發(fā)酵：250 mL三角瓶，裝量25 mL。接種3 mL種子培養(yǎng)液于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在37℃、250 r/min培養(yǎng)約44 h。

（4）10 L罐培養(yǎng)：基料5 L，接種量6%（V/V），通氣量600 L/h，轉(zhuǎn)速600 r/min，罐壓控制在0.03 MPa，37℃培養(yǎng)32 h左右。

1.3.2 分析方法

（1）生物量的測(cè)定：由于是濁液發(fā)酵，為了較快得到生物量的數(shù)據(jù)，采取細(xì)菌計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并建立了顯微計(jì)細(xì)胞數(shù)（x）與平板計(jì)數(shù)（y，CFU/mL）之間的關(guān)系（y=0.350 1x-8.805 6，R2=0.986 8）。

（2）氨基酸測(cè)定：發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，取0.5mL上清液，加入等體積的磺基水楊酸，振蕩搖勻，再4℃、12 000 r/min離心15 min，用0.02 mol/L HCl進(jìn)行適當(dāng)稀釋，0.22 μm膜過(guò)濾，濾液用氨基酸分析儀檢測(cè)氨基酸含量[8]。

（3）高效液相色譜測(cè)定桿菌肽含量：取預(yù)處理后的上清液1 mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇4 mL，振蕩搖勻，再10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后，備用。HPLC測(cè)定桿菌肽效價(jià)方法按文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

（4）過(guò)氧化氫酶活測(cè)定：a.樣品保存與洗滌：發(fā)酵中期進(jìn)行周期取樣，液氮凍存后備用。保留5mL發(fā)酵液離心（4℃、8 000 r/min、10 min）后的菌體沉淀，加入4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液（pH 7.0），充分振蕩搖勻，洗滌，再次離心（4℃、8 000 r/min、10 min）。重復(fù)此操作6次，保留細(xì)胞沉淀。b.提取過(guò)氧化氫粗酶液：洗滌后的細(xì)胞加入PBS緩沖液（pH 7.0），定容至5 mL，充分振蕩搖勻。然后將菌懸液置于超聲細(xì)胞破碎儀超聲破碎，并進(jìn)行冰浴處理。工作條件：功率60%，超聲工作4 s，間歇5 s，超聲時(shí)間15min。待超聲細(xì)胞完成后，取出離心管離心（4℃、8 000 r/min、10 min），上清液即為過(guò)氧化氫粗酶液提取液。c.酶活測(cè)定：取10 mL試管2支，編號(hào)0和1，并按表1順序依次加入試劑[10]。

表1 過(guò)氧化氫酶活測(cè)定體系Table 1 Determination system of catalase activity

對(duì)照組加入0.3 mL蒸餾水，在波長(zhǎng)240 nm處調(diào)零。實(shí)驗(yàn)組加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2，測(cè)定吸光度值，間隔15 s讀數(shù)1次，記錄數(shù)據(jù)3～5 min。酶活定義：1 min內(nèi)A240nm減少0.1所用的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。

式中：VT為破碎后過(guò)氧化氫酶總體積，mL；V1為用于測(cè)定的過(guò)氧化氫酶體積，mL；FW為破碎后胞內(nèi)蛋白質(zhì)量，g；0.1為A240nm每下降0.1為1個(gè)酶活單位，U；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

本實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白（FW）為粗酶液中的蛋白含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測(cè)定粗酶液蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中胞外氨基酸濃度的時(shí)序變化

桿菌肽是一種非核糖體合成酶催化合成的12環(huán)肽次級(jí)代謝產(chǎn)物，前體氨基酸的種類主要有Asp、Glu、Cys、Val等[11]。氨基酸不僅為桿菌肽合成的前體分子，有些氨基酸（如Cys）還可能具有緩解氧化脅迫的功能。因此，有必要對(duì)發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)前體氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 地衣芽孢桿菌在10 L罐發(fā)酵過(guò)程中胞外氨基酸含量及桿菌肽效價(jià)的變化Fig.1 Change of the extracellular amino acids content and bacitracin titreB.licheniformisLC fermentation in 10 L fermentor

由圖1可知，在發(fā)酵過(guò)程中Glu、Asp、Leu、Phe、Lys和His的含量持續(xù)上升，在放罐時(shí)（32 h）分別達(dá)到626 mg/L、140mg/L、480mg/L、933mg/L、394mg/L和151mg/L。而Cys和Val在26 h分別達(dá)到峰值134 mg/L和196 mg/L之后，便開始迅速下降，至32 h分別下降了81.1%（74 mg/L）和30.7%（150 mg/L），而且發(fā)酵過(guò)程中Val含量始終高于Cys近50%以上。30 h桿菌肽效價(jià)達(dá)到峰值960 U/mL，后開始降解。這可能與Cys在28 h后處于低水平狀態(tài)不足以維持桿菌肽合成有關(guān)。

2.2 單因素?fù)u瓶添加抗壞血酸與半胱氨酸對(duì)桿菌肽合成的影響

在桿菌肽高密度發(fā)酵過(guò)程中，溶氧是限制性因素之一。溶氧不足而導(dǎo)致的“酸脅迫效應(yīng)”使細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，桿菌肽的合成受到限制[12]。加強(qiáng)供氧夠有效的解決以上問(wèn)題，曾新年等[3]在300 r/min和600 L/h發(fā)酵條件下流加雙氧水有效地緩解了溶解氧不足的問(wèn)題，促進(jìn)了桿菌肽的合成效率，但發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題沒(méi)有解決。本實(shí)驗(yàn)條件下（轉(zhuǎn)速600 r/min和通風(fēng)600 L/h）發(fā)酵周期縮短了約10 h，放罐效價(jià)也略高于曾新年的報(bào)道[3]。但是也出現(xiàn)了著新的矛盾：發(fā)酵中后期細(xì)胞便開始自溶，這勢(shì)必會(huì)影響桿菌肽的合成效率。VOIGT B等[5]報(bào)道了地衣芽胞桿菌在快速生長(zhǎng)過(guò)程存在嚴(yán)重的氧化脅迫效應(yīng)。因此，在實(shí)驗(yàn)條件下（高通風(fēng)和高轉(zhuǎn)速）促使地衣芽胞桿菌的生長(zhǎng)代謝的同時(shí)，很可能也加劇了細(xì)胞清除高活性氧自由基的負(fù)擔(dān)，并對(duì)細(xì)胞造成了氧化脅迫，而突出的氧化脅迫很可能是使細(xì)胞活力急劇而持續(xù)的下降、自溶的內(nèi)在因素。而微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中也特異性的存在谷胱甘肽和半胱氨酸等非酶解氧化應(yīng)激的形式，這對(duì)于清除高活性氧自由基也可起到積極作用，因此，在搖瓶水平研究了VC和半胱氨酸對(duì)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 抗壞血酸（A）及半胱氨酸（B）對(duì)出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵合成桿菌肽的影響Fig.2 Effects of VC(A)and Cys(B)addition on bacitracin production byB.licheniformis LC in shake flask fermentation

由圖2A可知，單因素?fù)u瓶添加VC或半胱氨酸都能促進(jìn)地衣芽孢桿菌合成桿菌肽，添加0.2%抗壞血酸時(shí)，桿菌肽效價(jià)最高為821 U/mL，比對(duì)照提高了20.7%（680 U/mL）。0.4%和0.6%添加量都促進(jìn)了桿菌肽合成，但是不如0.2%的添加量明顯，然而0.8%的添加量卻抑制桿菌肽的合成，只有對(duì)照組的97.5%（663 U/mL）。另外，VC添加量越多，發(fā)酵液的pH值反而越低（資料未顯示），這可能與過(guò)量的抗壞血酸被氧化、增強(qiáng)的供氧矛盾導(dǎo)致細(xì)胞能量供給不足以及溢流酸代謝加劇有關(guān)[13]。

由圖2B可知，當(dāng)添加0.4%半胱氨酸時(shí)，桿菌肽效價(jià)達(dá)到了880 U/mL，比對(duì)照提高了29.4%，比VC添加的最高值（821 U/mL）提高了7.2%，但是繼續(xù)增加Cys的濃度（0.6%和0.8%）并沒(méi)有進(jìn)一步提高桿菌肽的效價(jià)，但沒(méi)有VC組添加抑制桿菌肽合成的現(xiàn)象。同樣的，放瓶pH也隨著Cys添加量的增多而降低（資料未顯示）。

2.3 單因素?fù)u瓶添加抗壞血酸和半胱氨酸對(duì)過(guò)氧化氫酶

活的影響

抗壞血酸（VC）是酸性多羥基化合物，而半胱氨酸含有巰基（-SH），都具很強(qiáng)的抗氧化性，可保護(hù)細(xì)胞免于活性氧自由基的威脅[14]。為了考察添加Cys或VC是否能夠促進(jìn)桿菌肽的合成，對(duì)發(fā)酵過(guò)程的胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 搖瓶添加抗壞血酸或半胱氨酸對(duì)出發(fā)菌株胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活的影響Fig.3 Effects of VC or Cys addition on the intracellular catalase activity of strain LC in shake flask fermentation

由圖3可知，隨著搖瓶發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（添加Cys或VC）過(guò)氧化氫酶活力均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。26 h分別達(dá)到13.8 U/（g·min）（對(duì)照組）、9.6 U/（g·min）（Cys組）和8.2 U/（g·min）（VC組）。但是，實(shí)驗(yàn)組酶活較對(duì)照組分別降低了43.8%（Cys組）和68.3%（VC），說(shuō)明了添加VC或Cys確實(shí)起到了抗氧化脅迫的作用，它們分擔(dān)了胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶的氧自由基清除負(fù)擔(dān)。

雖然半胱氨酸的還原性（氧自由基去除能力）沒(méi)有VC強(qiáng)[15]，但是Cys是桿菌肽的前體氨基酸之一，又是限制性因素（圖1），而且添加Cys相比VC更能有效的提高桿菌肽效價(jià)（圖2）。因此，提高桿菌肽發(fā)酵菌株內(nèi)源性Cys的供給效率可能會(huì)更有效的促進(jìn)效價(jià)合成。

2.4 半胱氨酸合成加強(qiáng)型基因工程菌株在10 L罐上進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證

菌株LC（對(duì)照組）和CY（實(shí)驗(yàn)組）在10 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵特性，如：桿菌肽效價(jià)、生物量、過(guò)氧化氫酶活和Cys含量的變化如圖4所示。

圖410 L罐發(fā)酵過(guò)程中地衣芽孢桿菌LC和CY生物量、Cys、過(guò)氧化氫酶和桿菌肽產(chǎn)量的變化Fig.4 Change of cell growth,Cys,catalase and bacitracin production in a 10 L bioreactor by strain LC and CY

由圖4可知，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組桿菌肽效價(jià)變化趨勢(shì)幾乎一致，分別達(dá)到最高效價(jià)960 U/mL（30 h）和1 090 U/mL（28 h），后者桿菌肽效價(jià)比對(duì)照提高了13.5%。細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)幾乎一致，分別在26 h（實(shí)驗(yàn)組，84×109CFU/mL）和24 h（對(duì)照組，77×109CFU/mL）達(dá)到峰值。但是，CY菌株自溶時(shí)間比對(duì)照延后了2 h。對(duì)過(guò)氧化氫酶活力和Cys含量而言，20h之前Cys的含量幾乎一樣，但是進(jìn)入主發(fā)酵期（20 h）后，實(shí)驗(yàn)組Cys含量明顯高于出發(fā)菌株，分別到達(dá)峰值213.3mg/L（24h）和133.6 mg/L（26 h），比對(duì)照提高了近60%。

過(guò)氧化氫酶活變化與搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，由于發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中氧的供給效率遠(yuǎn)高于搖瓶培養(yǎng)過(guò)程，氧自由基生成效率以及對(duì)其去除所需要的過(guò)氧化氫酶也要遠(yuǎn)高于搖瓶水平，因此過(guò)氧化氫酶活明顯高于搖瓶80%～120%。另外，CY菌株相比LC菌株過(guò)氧化氫酶活力（14～32 h）降低了15%～40%。由于半胱氨酸既是桿菌肽合成的前體氨基酸之一，同時(shí)其分子中的巰基（-SH）又是消除氧自由基的活性基團(tuán)[16]，因此，桿菌肽合成對(duì)Cys前體分子的需求與氧自由基去除（抗氧化脅迫）之間存在競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系。CY菌株增強(qiáng)了Cys的合成，更好地滿足了細(xì)胞對(duì)兩者的生理需求，顯著維持了細(xì)胞活性（生物量提高以及細(xì)胞自溶延后2 h）、促進(jìn)了桿菌肽合成效率。另外，實(shí)驗(yàn)組的桿菌肽合成時(shí)間（28 h）比對(duì)照減少了2 h，可能與高活性細(xì)胞生長(zhǎng)代謝更快速地消耗了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，致使其在后期不足有關(guān)。這也為進(jìn)一步的桿菌肽補(bǔ)料發(fā)酵研究提供了較為明確的補(bǔ)料窗口信息。

3 結(jié)論

由地衣芽孢桿菌發(fā)酵合成桿菌肽過(guò)程中的上清液前體氨基酸的含量變化，確定了Cys是限制氨基酸之一。另外，在高密度耗氧發(fā)酵過(guò)程中，尤其是高通風(fēng)量和高轉(zhuǎn)速培養(yǎng)條件下，活性氧自由基生成以及其對(duì)細(xì)胞造成的氧化脅迫是限制桿菌肽高效合成的限制性因素之一。發(fā)酵中期添加Cys可促進(jìn)活性氧自由基的清除，但是內(nèi)源性Cys作為前體氨基酸參與桿菌肽分子合成與參與自由基去除反應(yīng)之間的矛盾不可調(diào)和。菌體為了保持其細(xì)胞活性而存活的生理需求很可能使Cys處于加速參與自由基去除系統(tǒng)的狀態(tài)，這樣就對(duì)其“前體氨基酸”的功能產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制。半胱氨酸加強(qiáng)型工程菌株通過(guò)提高Cys的供給效率既滿足了細(xì)胞清除自由基、減弱氧化脅迫效應(yīng)的需求，又加強(qiáng)了Cys參與桿菌肽合成的效率，可謂是一舉兩得。同時(shí)，發(fā)酵后期工程菌株桿菌肽效價(jià)不再上升以及細(xì)胞自溶可能與發(fā)酵后期碳源不足有關(guān)，這也提供了較為準(zhǔn)確的補(bǔ)料窗口信息，將在以后的研究中進(jìn)行補(bǔ)料優(yōu)化。

[1]鄧?yán)?，冀志霞，陳守?溶氧對(duì)地衣芽胞桿菌DW2合成桿菌肽的影響[J].中國(guó)抗生素雜志，2009，34（11）：664-669.

[2]KABISCH J,PRATZKA I,MEYER H,et al.Metabolic engineering of Bacillus subtilis,for growth on overflow metabolites[J].Microbial Cell Fact,2013,12(1):1-10.

[3]曾新年，鮑帥帥，李洪杰，等.雙氧水對(duì)地衣芽胞桿菌合成桿菌肽的影響[J].中國(guó)釀造，2013，32（3）：94-97.

[4]段菁菁，劉立明，華兆哲，等.氧化脅迫對(duì)Alkalibacteriumsp.F26防御酶和輔因子的影響[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（9）：1385-1392.

[5]VOIGT B,SCHWEDER T,BECHER D,et al.A proteomic view of cell physiology ofBacillus licheniformis[J].Proteomics,2004,4(5):1465-1490.

[6]宋道軍，李紅，余增亮.N～+離子注入對(duì)不同輻射敏感性微生物超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響[J].生物物理學(xué)報(bào)，1998，14（2）：325-330.

[7]趙素娟.活性氧在釀酒酵母乙醇脅迫中的作用[D].鄭州：河南工業(yè)大學(xué)，2012.

[8]何桂珍.游離氨基酸和脂肪酸分析的應(yīng)用[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，22（3）：162-163.

[9]鮑帥帥，張默，王新平，等.谷氨酸對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)桿菌肽的影響[J].中國(guó)釀造，2014，33（3）：49-51.

[10]王會(huì)，郭立，謝文磊.抗氧化劑抗氧化活性的測(cè)定方法（一）[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（3）：98-102.

[11]林綱.桿菌肽發(fā)酵過(guò)程中氨基酸等成分的測(cè)定方法研究和應(yīng)用[D].上海：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，2006.

[12]WANG Z,WANG Y,XIE F,et al.Improvement of acetoin reductase activity enhances bacitracin production byBacillus licheniformis[J]. Process Biochem,2014,49(12):2039-2043.

[13]王勇.地衣芽胞桿菌發(fā)酵合成桿菌肽優(yōu)化研究[D].武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2015.

[14]王鏡巖.生物化學(xué).上冊(cè)[M].北京：高等教育出版社，2002：42-46.

[15]王文君.VC和VE的抗氧化和免疫功能[J].飼料工業(yè)，2000（12）：14-15.

[16]劉建忠，劉杰，翁麗萍，等.巰基乙酸對(duì)過(guò)氧化氫酶的激活及其機(jī)制研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，40（6）：39-41.

Q815

0254-5071（2017）05-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.024

2017-01-22

湖北大學(xué)綠康生物工程研究所開放課題（2015LBIHU603）

劉道奇（1991-），男，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究工作。

*通訊作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要從事微生物工程研究工作。