段焰青，杜剛，黨立志，曾熠程，李青青*

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明650231；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

紙葡萄穗霉降解β-胡蘿卜素的產(chǎn)香研究

段焰青1，杜剛2，黨立志1，曾熠程1，李青青3*

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明650231；2.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

從采自云南昆明的22份不同陳化時(shí)間的煙草樣品中篩選到6株可降解β-胡蘿卜素的真菌。菌株YNCA9037可降解β-胡蘿卜素，獲得具甜木香味的發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析進(jìn)行菌株分類鑒定，菌株YNCA9037初步鑒定為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的產(chǎn)香條件進(jìn)行初步研究，其較佳產(chǎn)香的條件為：pH 6.5，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間72 h，β-胡蘿卜素添加量0.2%。菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法分析，檢測(cè)到致香物質(zhì)β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮。

紙葡萄穗霉；β-胡蘿卜素；菌株鑒定；致香物質(zhì)

DUAN Yanqing1,DU Gang2,DANG Lizhi1,ZENG Yicheng1,LI Qingqing3*
(1.Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming 650231,China;2.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education,Kunming,650500,China;3.College of Life Science, Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

類胡蘿卜素是一大類自然界廣泛分布的四萜類化合物[1]，它作為生理抗氧化劑，具有抗腫瘤、抗衰老等功效，由于其無(wú)毒無(wú)害且著色能力良好，也作為食品著色劑使用[2-4]。類胡蘿卜素降解可產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-大馬酮等致香物質(zhì)[5-6]，因這類致香物質(zhì)具有較低的感官閾值，是許多香料的特征香味[7]，然而在天然材料中這類香味物質(zhì)含量極低，且提取成本昂貴。近年來(lái)一些研究者嘗試通過(guò)酶或微生物體系模擬類胡蘿卜素的自然降解獲得新型香料[8]。NINGRUM A等[9]從七葉蘭葉片中得到的粗酶降解β-胡蘿卜素，獲得β-紫羅蘭酮。楊雪鵬等[10]以霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）A20降解類胡蘿卜素可產(chǎn)生香味物質(zhì)。SáNCHEZ-CONTRERAS A等[11]以地絲菌屬菌株（Geotrichumsp.）和芽孢桿菌（Bacillussp.）兩株菌混菌培養(yǎng)，降解葉黃素產(chǎn)生紫羅蘭酮和紫羅蘭醇等有煙草特征香味的物質(zhì)。ZELENA L等[12]以來(lái)源于蒜頭狀小皮傘的過(guò)氧化物酶降解葉黃素得到3-羥基-β-紫羅蘭酮和3-羥基-α-紫羅蘭酮，降解β-胡蘿卜素得到β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛和二氫獼猴桃內(nèi)酯等致香物質(zhì)。

葡萄穗霉屬殼霉目、杯霉科真菌，是廣泛存在于自然界的霉菌[13]，同時(shí)是很重要的植物病原菌[14]。目前，利用微生物降解類胡蘿卜素產(chǎn)香尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)從云南昆明的22份不同陳化時(shí)間的煙草樣品中篩選到6株可降解β-胡蘿卜素的真菌，并對(duì)其中可降解β-胡蘿卜素菌株YNCA9037進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素的產(chǎn)香條件進(jìn)行初步研究。通過(guò)本研究為微生物降解類胡蘿卜素獲取致香物質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源

云南昆明陳化1～3年的煙葉22份：由紅云紅河集團(tuán)提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

β-胡蘿卜素降解篩選培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，β-胡蘿卜素0.2%，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，β-胡蘿卜素0.2%，瓊脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃滅菌25 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

β-胡蘿卜素（純度30%）：德國(guó)巴斯夫公司；瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；二氯甲烷（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；其他試劑采購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；TGL-15B高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；5331型PCR儀：德國(guó)Eppendorf股份公司；Nikon ECLIPSE E200顯微鏡：北京冠普佳科技有限公司；ScoutⅡ電子天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；SW-CJ-ZFD無(wú)菌操作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HP-900隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液制備

將β-胡蘿卜素（30%）5 g溶于10 mL二氯甲烷中，然后加入1 g Tween-80進(jìn)行乳化。將二氯甲烷自然揮發(fā)，再加入100 mL無(wú)菌蒸餾水混合得乳濁液儲(chǔ)備待用。

1.3.2 降解β-胡蘿卜素目標(biāo)菌株的平板篩選

以三點(diǎn)法對(duì)待篩選菌株進(jìn)行純化，純化菌株接種于斜面，再接種于β-胡蘿卜素降解篩選培養(yǎng)基上，能使培養(yǎng)基褪色的菌株為待選菌株。

1.3.3 降解β-胡蘿卜素產(chǎn)香菌株的篩選

將待選菌株斜面接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于恒溫培養(yǎng)振蕩器，180r/min、30℃條件下發(fā)酵5d，每株菌以相同的條件不添加底物發(fā)酵作空白對(duì)照。發(fā)酵液過(guò)濾后用二氯甲烷1∶1萃取為待檢測(cè)樣品。

1.3.4 菌株YNCA9037的形態(tài)鑒定

將菌株YNCA9037接種于平板培養(yǎng)基，28℃恒溫條件下培養(yǎng)3 d，記錄形態(tài)、干濕、顏色等菌落特征。

顯微特征觀察：插片法培養(yǎng)，把滅過(guò)菌的蓋玻片45度角插入PDA平板中，將菌種接種于蓋玻片的基部，使真菌菌絲迎著培養(yǎng)基表面附著于蓋玻片上，28℃恒溫條件下培養(yǎng)3～4 d后，用鑷子輕輕取出蓋玻片，置于載玻片上制成臨時(shí)裝片進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，記錄其菌絲、孢子囊、孢子梗、分生孢子形態(tài)特征及與營(yíng)養(yǎng)體之間的著生關(guān)系等。根據(jù)魏景超[15]《真菌鑒定手冊(cè)》，將真菌分類至綱、目、科、屬。1.3.5菌株YNCA9037的分子鑒定

菌株YNCA9037脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提?。夯罨泵婢N接種于100mLPDA液體培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)4 d，取5 mL發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，收集菌絲體，以液氮凍融-十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取真菌DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系（25 μL）：DNA Tax MIX，10 μL；引物ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，2 μL；引物ITS5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2μL；純凈水，9μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s；50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；72℃末端延伸10 min；循環(huán)30次；4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)：取0.75 g瓊脂糖于50 mL 0.5×四溴乙烷（tetrabromoethane，TBE）緩沖液中，加熱煮沸2min，稍冷后加入1.5μLGoldView染色液，搖勻倒膠。將所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和Marker分別取5 μL到瓊脂糖凝膠上，在0.5×TBE緩沖液中電泳，電壓80 V。電泳結(jié)束后凝膠成像儀系統(tǒng)記錄。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及序列測(cè)定經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

所測(cè)序列在GeneBank基因庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的分析構(gòu)建。

1.3.6 菌株YNCA9037產(chǎn)香發(fā)酵條件研究

培養(yǎng)基初始pH：將液體培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h，考察培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產(chǎn)香的影響。

培養(yǎng)溫度：將接種后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 6.5）分別置于20℃、25℃、28℃、32℃、35℃、40℃條件下，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，考察培養(yǎng)溫度對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產(chǎn)香的影響。

培養(yǎng)時(shí)間：將接種好的液體培養(yǎng)基（pH 6.5）在28℃、180r/min條件下分別培養(yǎng)48h、72h、96h、120h、144h、168h、192 h，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產(chǎn)香的影響。

β-胡蘿卜素的添加量：將接種好的液體培養(yǎng)基（pH 6.5），在28℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，β-胡蘿卜素添加量為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、1.00%，考察β-胡蘿卜素的添加量對(duì)菌株YNCA9037降解β-胡蘿卜素產(chǎn)香的影響。

發(fā)酵產(chǎn)物由10名專業(yè)人士對(duì)產(chǎn)香質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，優(yōu)選出較好的發(fā)酵方式。

1.3.7 菌株YNCA9037發(fā)酵樣品香味成分的GC/MS分析

菌株YNCA9037發(fā)酵β-胡蘿卜素的50 mL樣品，先進(jìn)行抽濾，再加入50 mL二氯甲烷萃取，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析檢測(cè)。

氣相色譜條件：TR-1MS色譜柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；載氣：氦氣（He）（純度99.999%）；升溫程序：60℃保持1 min，以10℃/min的速度升至120℃，保持1 min，然后以2℃/min的速度升至140℃，保持1 min，再以5℃/min的速度升至200℃，保持1 min；柱流量：0.8 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比30∶1，溶劑延遲3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電離電壓70 eV；離子源溫度260℃；掃描范圍30～500 m/z。

定性方法：各香氣組分質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫(kù)檢索及相關(guān)資料的分析，對(duì)香氣成分進(jìn)行分析比對(duì)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素降解菌株的篩選

從篩選平板上發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生明顯透明圈的6株菌，分別為菌株YNCA9013、YNCA9022、YNCA9023、YNCA9031、YNCA9037和YNCA9043。將6株菌接種于含類胡蘿卜素的液體培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵96 h后6株菌都可使液體培養(yǎng)基褪色。菌株YNCA9013、YNCA9022的發(fā)酵液有果香味，但味道較淡；菌株YNCA9037產(chǎn)生較濃的甜木香味；其余菌株發(fā)酵液沒(méi)有香味，未接種菌株的對(duì)照樣發(fā)酵前后沒(méi)有味道變化。因此，對(duì)菌株YNCA9037進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2 類胡蘿卜素降解菌株的分類鑒定

菌株YNCA9037形態(tài)特征如圖1所示。由圖1可知，菌株YNCA9037菌落大，呈毛絮狀，黑褐色，邊緣白色，背面黑褐色；菌絲體不發(fā)達(dá)，菌絲光滑透明、有隔；孢子梗和孢子囊為黑色或褐色，分生孢子簇生于孢子梗頂端的瓶形小梗上，初步鑒定YNCA9037菌株為葡萄穗霉屬（Stachybotrys）。

以菌株YNCA9037提取的DNA為模板，ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增如圖2所示，表明擴(kuò)增片段在500～750 bp。測(cè)序結(jié)果表明，菌株YNCA9037的ITS序列長(zhǎng)566 bp。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA7.0軟件，以領(lǐng)接法構(gòu)建菌株YNCA9037的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，YNCA9037與Stachybotrys聚為一大簇，與紙葡萄穗霉菌株Stachybotrys chartarumstrain CBS 136172聚為一簇，同源性為99%，初步鑒定菌株YNCA9037為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。

圖1 菌株YNCA9037的菌落（a）及顯微（b）形態(tài)Fig.1 Colony(a)and microscopic(b)morphology of strain YNCA9037

圖2 菌株YNCA9307的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of ITS sequence PCR amplified products strain YNCA9307

圖3 菌株YNCA9037基于ITS序列N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA9037 based on ITS sequence with N-J method

2.3 菌株YNCA9037產(chǎn)香發(fā)酵條件研究

培養(yǎng)基初始pH實(shí)驗(yàn)中pH 6.5發(fā)酵液香味最好，表明最適宜的初始pH為6.5；培養(yǎng)溫度實(shí)驗(yàn)中28℃發(fā)酵液香味最好，溫度過(guò)低香味較淡，溫度高于32℃產(chǎn)生異味，表明最適宜的發(fā)酵溫度為28℃；培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)中72 h發(fā)酵液香味最好，超過(guò)72 h香味逐漸變淡，表明最適宜的發(fā)酵時(shí)間為72 h；β-胡蘿卜素添加量＞0.1%時(shí)香味較淡，添加量為0.2%與0.4%的香味相當(dāng)，β-胡蘿卜素添加量超過(guò)0.6%時(shí)產(chǎn)生異味，表明最適宜的β-胡蘿卜素添加量為0.2%。

2.4 菌株YNCA9037發(fā)酵樣品香味成分的GC/MS分析

紙葡萄穗霉菌株YNCA9037發(fā)酵β-胡蘿卜素產(chǎn)生甜木香味，對(duì)該樣品進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵樣品檢測(cè)到保留時(shí)間9.86 min的峰為β-環(huán)檸檬醛，保留時(shí)間18.54 min的峰為β-紫羅蘭酮。β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮為β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物，β-環(huán)檸檬醛具有果香和花香香氣，香氣類似紫蘭酮和鳶尾，并帶有清涼和木香，稍有油膩的氣息，β-紫羅蘭酮香氣較為柔，木香稍重，具有覆盆子的香味，稀釋后有類似紫羅蘭花的香味。但發(fā)酵產(chǎn)物含量較低，含有一定刺激性氣味，還需進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

圖4 菌株YNCA9037發(fā)酵樣品香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components in the fermentation samples of strain YNCA9037 analysis by GC-MS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從采自云南省昆明市的22份不同陳化程度的煙草樣品篩選到6株可降解類胡蘿卜素的真菌，經(jīng)菌落及菌體的顯微形態(tài)觀察比對(duì)，初步鑒定為葡萄穗霉屬菌株，結(jié)合ITS序列分析對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定，初步鑒定菌株YNCA9037為紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。對(duì)其降解β-胡蘿卜素進(jìn)行初步發(fā)酵條件研究，最適宜的初始pH為6.5，最適宜的發(fā)酵溫度為28℃，最適宜的發(fā)酵時(shí)間為72 h，最適宜的β-胡蘿卜素添加量為0.2%。紙葡萄穗霉菌株YNCA9037發(fā)酵樣品經(jīng)GC-MS分析，檢測(cè)到β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮等致香物質(zhì)。ZORN H等[16]的研究中篩選出可降解類胡蘿卜素的2株酵母和8株絲狀真菌，β-胡蘿卜素的降解產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)β-紫羅蘭酮和β-環(huán)檸檬醛等香味物質(zhì)。本研究建立篩選降解β-胡蘿卜素菌株的方法，初步研究了紙葡萄穗霉降解β-胡蘿卜素的產(chǎn)香條件，為進(jìn)行放大發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)新型香料提供了技術(shù)支持。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.022

2016-12-21

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目（2015539200340277）；云南省科技廳項(xiàng)目（2015BA006）；云南省技術(shù)創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2016HB009）；中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目（110201402040）

段焰青（1974-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锵懔稀?/p>

*通訊作者：李青青（1976-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。