蔣彪，王常高，杜馨，林建國(guó)，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

蔣彪，王常高，杜馨，林建國(guó)，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

采用響應(yīng)面法對(duì)芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響產(chǎn)酶的2個(gè)顯著性因素：羽毛粉、蔗糖。在此基礎(chǔ)上，采用最陡爬坡試驗(yàn)確定中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，然后對(duì)其他不顯著因素進(jìn)行最低添加量試驗(yàn)以降低生產(chǎn)成本和簡(jiǎn)化培養(yǎng)基組分。利用中心復(fù)合試驗(yàn)，得到預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基組成為羽毛粉5.6 g/L、蔗糖13.6 g/L、尿素5.0 g/L、KH2PO40.4 g/L、MgSO41.44 g/L、CaCl21.1 g/L、NaCl 5.0 g/L，預(yù)測(cè)角蛋白酶酶活為501.9 U/mL。用預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果實(shí)際角蛋白酶酶活為503.5 U/mL，表明模型能較好的預(yù)測(cè)發(fā)酵后酶活。

芽孢桿菌；角蛋白酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

JIANG Biao,WANG Changgao,DU Xin,LIN Jianguo,CAI Jun* (Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

角蛋白是一種不溶于水、鹽、稀酸或稀堿，自然界中廣泛存在的硬質(zhì)蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)中的多肽多由二硫鍵、氫鍵和疏水作用的其他化學(xué)鍵高度交聯(lián)形成較為穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)[1]。角蛋白主要來(lái)源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚和皮膚的衍生物（如毛發(fā)、羽毛、鱗、甲、角質(zhì)、喙等），分為α-角蛋白和β-角蛋白兩種[2]。羽毛作為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物年產(chǎn)量巨大，其中粗蛋白含量約占羽毛本身的85%以上，且蛋白多為角蛋白[3-5]。通過(guò)角蛋白酶降解羽毛得到小分子多肽和氨基酸，可以運(yùn)用于飼料行業(yè)和醫(yī)療保健產(chǎn)品[6-7]。另外，角蛋白酶廣泛應(yīng)用于肥料、洗滌工業(yè)和皮革行業(yè)等領(lǐng)域[8-10]。

目前，在角蛋白酶的發(fā)酵研究中，主要集中在對(duì)發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基這兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，研究方法上主要是用到單因素、正交和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化[11]。由于單因素試驗(yàn)無(wú)法考慮到各因素之間的交互作用，正交試驗(yàn)無(wú)法獲得全面可靠的水平組合，但響應(yīng)面試驗(yàn)法不僅可以同時(shí)對(duì)影響生物量的各因素和各因素的相互作用進(jìn)行比較和優(yōu)化，還可以快速確定出各因素最優(yōu)水平，減少試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)約時(shí)間。RAMNANI P等[12]采用Plackett-Burman法選出影響地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）RG1產(chǎn)角蛋白酶的3個(gè)顯著因素，并進(jìn)一步通過(guò)中心復(fù)合試驗(yàn)得到最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，使優(yōu)化后酶活提高3.5倍。THYS R C S等[13]采用響應(yīng)面法對(duì)微桿菌（Microbacteriumsp.）kr10產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活達(dá)到202.7 U/mL。ANBU P等[14]以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)Scopulariopsis brevicaulis產(chǎn)角蛋白酶培養(yǎng)基及條件進(jìn)行優(yōu)化，得到合適的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件。

本研究以前期實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209作為出發(fā)菌株，在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，提高酶活，為后期大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)室自行篩選得到的一株芽孢桿菌（Bacillussp.）CJPE209：保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號(hào)為CCTCC M 2015734。

1.1.2 試劑

羽毛粉：市售；50 mg/mL水溶性角蛋白：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；福林酚試劑（生物試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L；

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：羽毛粉10g/L，尿素5g/L，蔗糖10g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，CaCl20.55 g/L，MgSO41.8 g/L，NaCl 5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

SYNERGY2酶標(biāo)儀：Gene Company Limited；3K15冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制品廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)箱振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 角蛋白酶粗酶液的制備

將保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h以活化菌種。將活化好的菌種接種到種子培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)14 h，待菌株生長(zhǎng)達(dá)到最大速度。取2%（V/V）種子培養(yǎng)液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵液高速離心，得到上清液即為粗酶液。

1.3.2 角蛋白酶酶活測(cè)定方法

以1%的水溶性角蛋白（用0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH9）稀釋）作為底物，參考YAMAMURA S等[15]的測(cè)定方法，向1mL底物中加入1mL的粗酶液，55℃水浴反應(yīng)20min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，高速離心取1 mL上清液加入4 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉溶液和1 mL福林酚試劑均勻混合，于40℃水浴反應(yīng)20 min，取反應(yīng)液200 μL于96孔板用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)680 nm處檢測(cè)吸光度值；對(duì)照組使用先加入三氯乙酸滅活的酶液。

角蛋白酶酶活定義：在上述反應(yīng)體系中，吸光度值每增加0.01為一個(gè)酶活單位（U/mL）。酶活計(jì)算公式如下：

D=（A-B）×C×100

式中：A為試驗(yàn)組吸光度值；B為對(duì)照組吸光度值；C為粗酶液稀釋倍數(shù)；D為角蛋白酶酶活，U/mL。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選取N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取前期單因素試驗(yàn)中對(duì)酶活影響較大的7個(gè)因素，每個(gè)因素分為高（+）、低（-）兩水平，按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行12次試驗(yàn)，以角蛋白酶酶活為響應(yīng)值，挑選出置信度＞95%的因素作為影響酶活的顯著因素。PB設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)

通過(guò)PB試驗(yàn)得到影響角蛋白酶酶活的顯著因素，依據(jù)各因素的效應(yīng)值來(lái)選擇適當(dāng)步長(zhǎng)，通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)找到拐點(diǎn)，為下一步中心復(fù)合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）提供中心點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.3.5 最低添加量試驗(yàn)

經(jīng)PB試驗(yàn)得到影響粗酶液酶活的顯著因素和不顯著因素。為了降低成本、簡(jiǎn)化培養(yǎng)基組分，選擇不顯著因素進(jìn)行合理步長(zhǎng)的單因素試驗(yàn)，確定不顯著因素組分的最小添加量。1.3.6中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)2因素5水平的試驗(yàn)來(lái)確定芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的最佳培養(yǎng)基組分。CCD利用13組試驗(yàn)，用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析、方差分析和分析兩因素之間的相互作用，同時(shí)通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得到模型的多元函數(shù)和響應(yīng)面三維立體圖。然后用預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基組分進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)自變量水平的編碼值和實(shí)際值見(jiàn)表2。

表2 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite design experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)

PB試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表3Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析Table 4 Regression analysis of the Plackett-Burman design

表5Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman design

由表4可知，α=0.05時(shí)羽毛粉和蔗糖的P值在95%的置信區(qū)間內(nèi)都＜0.05，表明羽毛粉和蔗糖都是影響CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的顯著因素。通過(guò)效應(yīng)值知道蔗糖為正效應(yīng)，羽毛粉為負(fù)效應(yīng)。

由表5可知，此模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著，其決定系數(shù)R2=87.60%，說(shuō)明回歸方程能解釋87.60%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)證明此模型合理。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)得到的結(jié)果，按照各因素的效應(yīng)值合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)的變化步長(zhǎng)和最陡爬坡試驗(yàn)，其步長(zhǎng)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

由表6可知，第1組到第3組角蛋白酶或逐漸升高，而從第4組酶活就開(kāi)始下降，即第3組試驗(yàn)為最陡爬坡的拐點(diǎn)，因此選擇第3組（蔗糖和羽毛粉的添加量分別為蔗糖12g/L、羽毛粉6 g/L）作為下一步中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 最低添加量試驗(yàn)

由PB試驗(yàn)結(jié)果可知，所選取的7個(gè)因素中尿素、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、CaCl2和MgSO4為不顯著因素。將這5個(gè)因素做最低添加量試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1a可知，酶活隨著尿素添加量的增加而升高，在尿素添加量為4 g/L時(shí)酶活達(dá)到最高為417 U/mL，當(dāng)尿素添加量繼續(xù)增加時(shí)粗酶液酶活開(kāi)始下降，因此尿素的最佳添加量為4g/L；由圖1b可知，當(dāng)磷酸二氫鉀的添加量從0～0.4g/L逐漸增加時(shí)，粗酶液酶活隨磷酸二氫鉀的添加量的增加而提高，但磷酸二氫鉀的添加量繼續(xù)增加時(shí)，粗酶液酶活變化很小，因此磷酸二氫鉀的最佳添加量為0.4 g/L；由圖1c可知，磷酸氫二鉀的添加量從0～1 g/L逐漸增加時(shí)，粗酶液的酶活變化不大，為節(jié)約成本和簡(jiǎn)化培養(yǎng)基，故磷酸氫二鉀選擇不添加到培養(yǎng)基；由圖1d可知，硫酸鎂的添加量在0～1.44 g/L的范圍內(nèi)逐漸增加，粗酶液的酶活在硫酸鎂添加量為1.44g/L達(dá)到最高為416g/L，因此硫酸鎂的最佳添加量為1.44 g/L；由圖1e可知，粗酶液的酶活隨氯化鈣的添加量的增加而增加，當(dāng)氯化鈣的添加量為1.1 g/L時(shí)，酶活達(dá)到最高為447U/mL。故選擇尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂和氯化鈣的添加量分別為4 g/L、0.4 g/L、0 g/L、1.44g/L和1.1 g/L。

圖1 最低添加量試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Fig.1 Design and results of the minimum addition experiments

2.4 中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCD）試驗(yàn)

通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)得到兩個(gè)影響酶活的顯著因素（蔗糖和羽毛粉）的中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)：蔗糖12 g/L、羽毛粉6 g/L。以這兩種顯著因素的濃度為自變量，角蛋白酶酶活為響應(yīng)值，進(jìn)行2因素5水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。固定培養(yǎng)基其他組分為：尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4g/L、硫酸鎂1.44g/L、氯化鈣1.1 g/L和氯化鈉5 g/L。

表7 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Design and results of central composite design

表8 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 8 Variance analysis of response surface quadratic model

由表8可知，模型的P值遠(yuǎn)小于0.05，并且模型多元相關(guān)系數(shù)R2=99.41%，表明預(yù)測(cè)僅有0.59%的數(shù)據(jù)不能由該模型解釋。失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型無(wú)失擬現(xiàn)象。

通過(guò)Designexpert8.0.6對(duì)二次回歸系數(shù)的分析和計(jì)算得到A蔗糖和B羽毛粉對(duì)角蛋白酶酶活力影響的模型方程：

Y=493.9+38.75A-2.85B+24.37AB-20.98A2-17.73B2

通過(guò)軟件分析得到蔗糖和羽毛粉交互作用的三維立體圖見(jiàn)圖2。

圖2 蔗糖和羽毛粉交互作用對(duì)角蛋白酶酶活影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose and feather meal on keratinase activity

由圖2可知，當(dāng)羽毛粉添加量不變時(shí)，蔗糖添加量對(duì)酶活存在二次效應(yīng)，曲面呈拋物面，此響應(yīng)面圖呈典型的鐘罩狀，說(shuō)明蔗糖和羽毛粉的交互作用比較明顯。根據(jù)上述分析及軟件計(jì)算，預(yù)測(cè)最佳組合為：蔗糖13.6 g/L和羽毛粉5.6 g/L。最終預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)基為：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、硫酸鎂1.44 g/L、氯化鈣1.1g/L和氯化鈉5g/L。預(yù)測(cè)最高酶活為501.9U/mL。

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，在用預(yù)測(cè)得到的最佳培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行3次發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果角蛋白酶酶活平均值為503.5 U/mL。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值較吻合，說(shuō)明該模型是比較合理的。

3 結(jié)論

本研究以試驗(yàn)室篩選、保存的一株芽孢桿菌（Bacillus sp.）CJPE209為出發(fā)菌株，采用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到最終培養(yǎng)基：蔗糖13.6 g/L、羽毛粉5.6 g/L、尿素4 g/L、磷酸二氫鉀0.4 g/L、硫酸鎂1.44 g/L、氯化鈣1.1 g/L和氯化鈉5 g/L，此條件下角蛋白酶酶活為503.5 U/mL。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)確定其預(yù)測(cè)值和實(shí)際值較吻合，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化是合理的、可靠的。并且相較于響應(yīng)面優(yōu)化前的酶活417U/mL提高了20.74%。同時(shí)本研究對(duì)后期酶的規(guī)模生產(chǎn)提供參考和鋪墊。

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Q815

0254-5071（2017）05-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.016

2017-02-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401807）

蔣彪（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與放大。

*通訊作者：蔡?。?968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程。