鄧永平，楊敏，郭建華，李琰，劉曉蘭*，艾瑞波

（1.齊齊哈爾大學食品學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾大學理學院，黑龍江齊齊哈爾161006）

酒醅中產(chǎn)纖溶酶細菌的分離及發(fā)酵產(chǎn)酶研究

鄧永平1，2，楊敏1，郭建華1，2，李琰1，2，劉曉蘭1，2*，艾瑞波3

（1.齊齊哈爾大學食品學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾大學理學院，黑龍江齊齊哈爾161006）

該研究從酒醅中篩選高產(chǎn)纖溶酶的細菌。經(jīng)過初篩和復篩得到1株高產(chǎn)纖溶酶的菌株，命名為DL-1。通過菌株形態(tài)學和生理生化試驗初步鑒定菌株DL-1為芽孢桿菌（Bacillussp.）。菌株DL-1產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵試驗結(jié)果表明，最適菌齡為4 h，最適碳源為牛肉膏，最適氮源為豆餅粉。在此條件下，所產(chǎn)的纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積可達379.79 mm2。

酒醅；纖溶酶；細菌；分離；鑒定

DENG Yongping1,2,YANG Min1,GUO Jianhua1,2,LI Yan1,2,LIU Xiaolan1,2*,AI Ruibo3
(1.College of Food and Biological Engineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China;3.College of Science,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China）

心腦血管血栓栓塞性疾病是世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因，溶栓療法是主要的治療手段。纖溶酶可以預防和治療心腦血管血栓栓塞癥，具有溶解血栓和疏通血管的功效。目前，臨床上使用的大多數(shù)溶栓藥物是纖溶酶原激活劑或纖溶酶樣蛋白如組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）、尿激酶（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）和鏈激酶（streptokinase）[1]。這些藥物療效肯定，但是具有抗再灌注、發(fā)生急性冠狀動脈再閉塞、出血并發(fā)癥等副作用，并且價格昂貴[2]。因此，亟需開發(fā)天然來源的副作用較小或無副作用的替代品。為此，研究人員進行了大量的工作，分離到了多種纖溶酶產(chǎn)生菌，如根霉、芽孢桿菌、放線菌、好食脈孢菌、北蟲草等[3-7]。其中芽孢桿菌是生產(chǎn)纖溶酶的優(yōu)勢菌，如納豆激酶、枯草激酶及豆豉纖溶酶都是芽孢桿菌發(fā)酵的產(chǎn)物[4]。

在白酒生產(chǎn)工藝中，酒醅發(fā)酵是加入曲的糧糟在窖池內(nèi)糖化發(fā)酵的過程，窖池中各種微生物類群的協(xié)同作用，對白酒的風格和質(zhì)量影響很大，因此關(guān)于酒醅中微生態(tài)的研究一直倍受關(guān)注[8-9]。芽孢桿菌是酒醅發(fā)酵過程產(chǎn)生醬香味的主要菌群，能夠產(chǎn)生酯類、醇類、芳香族類、醛酮類、吡嗪類等醬香味的典型物質(zhì)[9-10]。有研究表明，已經(jīng)從酒醅中分離到了芽孢桿菌[11-14]，但是還沒有獲得產(chǎn)纖溶酶的菌株。

因此，本研究對酒醅中的產(chǎn)纖溶酶細菌進行了分離，經(jīng)過初篩和復篩獲得一株高產(chǎn)纖溶酶的菌株，對該菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶進行了研究，以期為后續(xù)該菌產(chǎn)纖溶酶的分離純化及性質(zhì)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：黑龍江北大倉集團有限公司。

牛血纖維蛋白原、牛凝血酶（200 U/支）：中國醫(yī)學科學院天津血研所；巴比妥鈉（分析純）、瓊脂糖（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

脫脂奶粉培養(yǎng)基：將脫脂奶粉10 g溶解于100 mL蒸餾水中，在115℃滅菌20 min；將瓊脂15 g溶解于500 mL蒸餾水中，在121℃滅菌30 min；待冷卻至45～50℃時，將兩液混勻倒于平板，即為脫脂奶粉平板。

復篩培養(yǎng)基：10g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，2g/LNa2HPO4，1 g/L NaH2PO4，0.2 g/L CaCl2，0.5 g/L MgSO4，1 000 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121℃滅菌30 min。

纖維素培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（sodiumcarboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）8 g，酵母膏l(xiāng) g，KH2PO30.25 g，瓊脂15 g，溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，加入10 mg/mL剛果紅溶液5 mL，于121℃滅菌20 min，冷卻倒平板，凝固后待用[14]。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨2%，NaCl 1%，pH7.0。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏1%，豆餅粉1%，pH7.0。

血纖維蛋白平板：將0.25 g瓊脂糖溶于50 mL生理鹽水中，置于45℃水浴中保溫30 min后，加入200 U的凝血酶，混勻；稱取0.2 g牛血纖維蛋白原，溶于50 mL的巴比妥鈉緩沖液（pH值為7.8）中，置于45℃水浴中保溫5min。取5mL凝血酶溶液與5 mL纖維蛋白原溶液混合均勻，倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，水平放置30min后即制得血纖維蛋白平板。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等的配制方法參照文獻[15]。

1.2 儀器與設備

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；PHS-25型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；Himac CF15RX冷凍離心機：天美科學儀器有限公司；Nikon 50i生物顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)纖溶酶細菌的篩選

（1）產(chǎn)纖溶酶細菌的初篩

用無菌水將采集的酒醅樣品制成均勻懸液，系列稀釋后選取適合稀釋度的懸液涂布于脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 d。挑取溶圈直徑與單菌落直徑之比較大的菌株進一步純化，獲得的純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂斜面，4℃保存。

（2）產(chǎn)纖溶酶細菌的復篩

將初篩所得產(chǎn)蛋白酶菌株挑取一環(huán)，接種于裝液量為50 mL/250 mL的復篩培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min通風培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)物在4℃條件下，10 000 r/min離心10 min，去除固形物，取10 μL上清液點接到血纖維蛋白平板上，37℃恒溫保存6 h，測量血纖維蛋白溶解所形成的溶圈直徑，求得溶圈面積，以溶圈面積表示菌株產(chǎn)纖溶酶的活力。

1.3.2 菌種形態(tài)學與生理生化特征

（1）微生物形態(tài)和染色觀察：將產(chǎn)纖溶酶菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落特征。利用光學顯微鏡觀察產(chǎn)纖溶酶菌株的細胞形態(tài)，采用革蘭氏染色法和芽孢染色法對菌株進行形態(tài)特征鑒定。

（2）生理生化特征：將復篩得到的產(chǎn)纖溶酶菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌體培養(yǎng)特征。將該菌株接入不同pH值（分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長情況，判斷其最適生長pH值；將該菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別在不同溫度（4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、45℃）條件下培養(yǎng)48 h，確定其最適生長溫度；利用淀粉培養(yǎng)基判斷該菌是否可以向細胞外分泌淀粉酶；采用糖發(fā)酵試驗確定該菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。利用纖維素培養(yǎng)基確定該菌是否向胞外分泌纖維素酶；基礎培養(yǎng)基（配制方法見參考文獻[5]）滅菌后分別加入過濾滅菌的10%含碳化合物溶液（供試碳源包括：葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖和麥芽糖），使其最終含量為1%，以未接菌培養(yǎng)基的作為對照，于37℃靜置培養(yǎng)48 h，確定該菌對碳源的利用情況[16]。

1.3.3 液體發(fā)酵試驗

斜面培養(yǎng)：采用牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基活化所分離的菌株，在37℃靜置培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后于4℃保存。

種子生長曲線的繪制：將斜面保存的菌株接種于裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，定時取樣，在波長600 nm處測定吸光度值，繪制所分離菌株的種子生長曲線。

液體發(fā)酵試驗：在50mL/250mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入培養(yǎng)4h的種子液，接種量為10%（V/V），37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.4 纖溶酶活力的測定

酶的制備：發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。

纖溶酶活力的測定參照劉曉蘭等[17]方法，采用血纖維蛋白平板法測定纖溶酶活力。取10 μL粗酶液點加于平板表面，37℃保溫6 h后測溶圈面積。纖溶酶的活力與其在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積呈正相關(guān)[18]，因此，以溶圈面積大小表示菌株產(chǎn)纖溶酶活力的高低。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖溶酶菌株的篩選

2.1.1 產(chǎn)纖溶酶菌株的初篩

纖溶酶可以水解血纖維蛋白，屬于蛋白酶，所以先利用脫脂奶粉平板分離酒醅中產(chǎn)蛋白酶的微生物。經(jīng)脫脂奶粉平板分離到12株產(chǎn)蛋白酶的菌株，測定這12株菌株形成的溶圈直徑和菌落直徑，結(jié)果見表1。由表1可知，這12株菌的菌落周圍均有透明圈，說明這12株菌都可以向細胞外分泌蛋白酶，但是產(chǎn)酶活力高低有所差異。

表1 酒醅中產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of protease-producing strains in the fermented grains

2.1.2 產(chǎn)纖溶酶菌株的復篩

將初篩所得的12株產(chǎn)蛋白酶菌株進行液體發(fā)酵，所得發(fā)酵液在4℃、10000r/min離心10min后，取10μL上清液點加于血纖維蛋白平板表面，37℃恒溫保存6 h后測定血纖維蛋白平板上所形成的溶圈直徑，計算溶圈面積，平行試驗3次，結(jié)果如表2所示。

表2 產(chǎn)纖溶酶菌株的復篩結(jié)果Table 2 Secondary screening results of fibrinolytic enzyme-producing strains in the fermented grains

由表2可知，12株分離菌株中10株菌能夠產(chǎn)纖溶酶，其中4號菌株的發(fā)酵液在血纖維蛋白平板上形成的溶圈面積最大，為（307.13±67.30）mm2，說明該菌株所產(chǎn)纖溶酶活力最大，因此選取4號菌株為高產(chǎn)纖溶酶的菌株，并命名為DL-1。

2.2 DL-1菌株的形態(tài)學與生理生化特征

2.2.1 菌落及菌株形態(tài)觀察結(jié)果

利用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶菌株DL-1，用光學顯微鏡對菌株形態(tài)進行鏡檢，對產(chǎn)纖溶酶菌株DL-1進行革蘭氏染色，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株DL-1在平板上形成的菌落為圓形或者近似圓形，邊緣鋸齒狀，菌落的中央稍凸起，不透明，灰白色，質(zhì)地軟，具有一定的濕度，有光澤。菌體呈桿狀，兩端鈍圓，單個散生或3～5個鏈狀排列，且菌株DL-1革蘭氏染色結(jié)果呈紫色，為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株DL-1的菌落特征（a）和菌株形態(tài)（b）及革蘭氏染色結(jié)果（c）Fig.1 Colony characteristics(a)and strain morphology(b)and gram staining(c)of strain DL-1

2.2.2 生理生化試驗

對菌株DL-1進行液態(tài)靜置培養(yǎng)，以判斷該菌對氧氣的需求情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌生長在液體培養(yǎng)基的表面，并貼試管內(nèi)壁生長，因此判斷該菌為好氧菌。菌株DL-1生理生化試驗結(jié)果見表3。

表3 菌株DL-1生理生化試驗結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical experiments of strain DL-1

由表3可知，菌株DL-1在培養(yǎng)液pH值為5～7時均可以生長，當pH值為6～7時生長良好；在4℃、10℃、20℃條件下該菌不生長，在30 ℃、40℃條件下該菌皆可生長，在45℃、50℃條件菌株DL-1菌生長最旺盛，表明該菌在一定程度較耐熱。由產(chǎn)胞外酶試驗結(jié)果可知，淀粉水解試驗、蛋白質(zhì)水解試驗和明膠液化試驗結(jié)果均呈陽性，表示菌株DL-1可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶，并且可以液化明膠；菌株DL-1不能再纖維素平板上形成溶圈，說明該菌不能向細胞外分泌纖維素酶。該菌能夠利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖和麥芽糖作為碳源，均能產(chǎn)酸，不能利用木糖。結(jié)合形態(tài)學特性，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

2.3 菌株產(chǎn)纖溶酶的液體發(fā)酵研究

2.3.1 菌株DL-1種子生長曲線的繪制

將菌株DL-1接種于種子培養(yǎng)基，每隔1 h取樣測定培養(yǎng)液吸光度值，繪制菌株DL-1種子生長曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在0～3 h內(nèi)，培養(yǎng)液OD600nm值緩慢增長，說明菌體處于延遲期；在3～8 h培養(yǎng)時間內(nèi)，OD600nm值迅速增長，菌體進入快速生長期，在培養(yǎng)時間為8 h時菌體生物量達到最大。養(yǎng)時間內(nèi)＞8 h后，OD600nm值不再增多，表明菌體生長進入穩(wěn)定期。

圖2 菌株DL-1的種子生長曲線Fig.2 Growth curve of seed of strain DL-1

處于快速生長期的菌種酶系活躍，代謝旺盛，可以縮短發(fā)酵的延遲期，最適宜作為發(fā)酵的種子[19]。因此，分別將培養(yǎng)3～8 h的新鮮種子液進行液體發(fā)酵試驗，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌齡為4 h的種子液發(fā)酵產(chǎn)溶圈面積最大，即產(chǎn)纖溶酶活力最高，因此，確定種子培養(yǎng)時間為4 h。

圖3 菌株種齡對產(chǎn)纖溶酶活力的影響Fig.3 Effect of cell age on the fibrinolytic enzyme activity

2.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以蛋白胨為氮源，分別以葡萄糖、蔗糖和牛肉膏為碳源，研究不同碳源對菌株DL-1產(chǎn)纖溶酶的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，不同種類碳源對菌株產(chǎn)纖溶酶影響較大，葡萄糖屬于速效碳源，易于被菌體利用，菌體生長迅速但是不利于積累代謝產(chǎn)物，而使纖溶酶活力較低。以蔗糖為碳源時酶活力略有升高，以遲效碳源牛肉膏為碳源時酶活力最高，可能因為牛肉膏中成分復雜，其中富含生長因子，對酶合成具有促進作用，因此，選擇牛肉膏為碳源。

圖4 不同碳源對產(chǎn)纖溶酶活力的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the fibrinolytic enzyme activity

以硫酸銨、蛋白胨、豆粕粉和豆餅粉為氮源，研究不同氮源對產(chǎn)纖溶酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同氮源對纖溶酶活力的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the fibrinolytic enzyme activity

由圖5可知，不同種類氮源對菌株DL-1產(chǎn)纖溶酶影響較大，硫酸銨作為速效氮源，能夠被菌體快速利用，導致培養(yǎng)基pH降低，不適于菌體繼續(xù)生長及產(chǎn)纖溶酶，所以產(chǎn)纖溶酶活力較低；蛋白胨、豆粕和豆餅均為遲效氮源，蛋白質(zhì)含量較高，這些有機氮源可提高產(chǎn)纖溶酶活力，可能是因為其含有的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的短肽可作為產(chǎn)酶誘導劑[15]。其中，豆餅粉為氮源時酶的活力最高，因此，選擇豆餅為氮源，此時，發(fā)酵液中的纖溶酶在血纖維蛋白平板上可形成面積為379.79mm2的溶圈，是雞腿菇纖溶酶活力的2.3倍[18]。

3 結(jié)論

本研究以酒醅為試驗材料，經(jīng)過初篩和復篩試驗，篩選出高產(chǎn)纖溶酶的菌株DL-1，結(jié)合形態(tài)學和生理生化學試驗初步鑒定菌株DL-1為芽孢桿菌（Bacillussp.）。對菌株DL-1產(chǎn)纖溶酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行了研究。結(jié)果表明，當以牛肉膏為碳源，以豆餅粉為氮源，接入菌齡為4 h的液體種子，菌株DL-1的發(fā)酵液在血纖維蛋白平板上可形成面積為379.79 mm2的溶圈。

本研究為后續(xù)研究菌株DL-1產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)條件、分離純化和酶學性質(zhì)奠定了基礎，也為纖溶酶提供了新的來源。

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Q815

0254-5071（2017）05-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.014

2016-12-27

齊齊哈爾市科學技術(shù)計劃項目（SFGG-201578）

鄧永平（1978-），女，副教授，碩士，研究方向為微生物學與酶學。

*通訊作者：劉曉蘭（1962-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與酶工程。